一种启动子及其应用的制作方法

本发明涉及代谢工程及基因工程，尤其是一种启动子及其应用。

背景技术：

1、l-赖氨酸（2,6-二氨基己酸）是一种必需氨基酸，在促进动物生长、增强免疫功能及改善神经系统健康等方面发挥关键生理作用，广泛应用于饲料、医药和食品工业，其中饲料添加剂领域占据全球约90%的市场份额。当前，微生物发酵法是大规模生产l-赖氨酸的主流工艺，而谷氨酸棒状杆菌（

corynebacterium glutamicum）凭借其食品安全级（gras）地位、产物分泌能力强、耐酸性好以及碳代谢流易于定向改造等优势，已成为工业发酵生产赖氨酸的首选宿主。

2、转录起始是基因表达过程中关键的限速环节，其效率高度依赖于启动子序列的结构特征。启动子决定了rna聚合酶在dna上的正确定位与转录起始复合物的形成效率，其核心元件（如-10区、-35区及其间隔序列）的碱基组成和空间构象直接影响启动子强度。对该序列进行单碱基或短片段替换、删除或插入，即可显著改变转录速率，从而调节下游基因的mrna丰度。由于mrna水平直接决定了翻译模板的可获得性，启动子的理性设计实质上能够有效提高目标基因的翻译强度，且这一过程完全不改变所编码蛋白的氨基酸序列，具有改造幅度小、代谢干扰低、无外源标签引入等突出优势。

3、然而，目前针对谷氨酸棒状杆菌赖氨酸合成途径中关键基因的启动子序列的系统性理性设计及功能验证仍鲜有报道。因此，开发能够高效增强氨基酸合成相关基因转录（进而提升翻译强度）的启动子序列，对于突破现有工业菌株的产量瓶颈具有重要的理论与应用价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种启动子。

2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述启动子的应用。

3、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

4、一种启动子，其核苷酸序列如序列表seq id no.6所示或如序列表seq id no.5所示；或与seq id no.6或seq id no.5具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更多的同源性或同一性且具有启动子活性的多核苷酸。

5、一种基因表达盒，其包含上述启动子。

6、优选的，上述基因表达盒，还包含靶基因。

7、优选的，上述基因表达盒，所述靶基因为谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸转氨酶基因

aspb、二氢吡啶二羧酸合酶基因dapa和/或内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶基因ddh。

8、一种表达载体，其包含上述启动子或上述基因表达盒。

9、一种宿主细胞，其包含上述启动子、基因表达盒或表达载体。

10、优选的，上述宿主细胞，所述宿主细胞是微生物。

11、优选的，上述宿主细胞，所述宿主细胞是放线纲棒状杆菌属的微生物。

12、优选的，上述宿主细胞，所述放线纲棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌（

corynebacterium glutamicum）。

13、优选的，上述宿主细胞，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032。

14、一种生产目标产物的方法，所述方法包括：在培养基中培养上述宿主细胞；并从所述培养基中回收目标产物的步骤。

15、优选的，上述生产目标产物的方法，所述目标产物是氨基酸。

16、优选的，上述生产目标产物的方法，所述目标产物是l-赖氨酸。

17、上述启动子、基因表达盒或表达载体在构建l-赖氨酸生产菌株中的应用。

18、优选的，上述应用，所述启动子或基因表达盒能够提升l-赖氨酸生产能力。

19、一种l-赖氨酸生产菌株，通过基因编辑技术在基因组中整合有上述启动子。

20、优选的，上述l-赖氨酸生产菌株，是将所述启动子通过基因编辑技术整合至出发菌株基因组中l-赖氨酸合成通路基因的起始密码子（atg）上游获得的重组谷氨酸棒状杆菌菌株。

21、优选的，上述l-赖氨酸生产菌株，所述出发菌株是谷氨酸棒状杆菌。

22、优选的，上述l-赖氨酸生产菌株，所述l-赖氨酸合成通路基因为谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸转氨酶基因

aspb、二氢吡啶二羧酸合酶基因dapa或内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶基因ddh，对应构建了重组谷氨酸棒状杆菌菌株

c.glutamicumlys aspb-r5、

c.glutamicumlys dapa-r5或

c.glutamicumlys ddh-r5；或对应构建了重组谷氨酸棒状杆菌菌株

c.glutamicumlys aspb-r4、

c.glutamicumlys dapa-r4或

c.glutamicumlys ddh-r4。

23、优选的，上述l-赖氨酸生产菌株，谷氨酸棒状杆菌天冬氨酸转氨酶基因

aspb的氨基酸序列如序列表seq id no.10所示（核苷酸序列如序列表seq id no.9所示）或与该序列一致性为95%以上且来源于相同种属，二氢吡啶二羧酸合酶基因dapa的氨基酸序列如序列表seq id no.8所示（核苷酸序列如序列表seq id no.7所示）或与该序列一致性为95%以上且来源于相同种属，内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶基因ddh的氨基酸序列如序列表seq idno.12所示（核苷酸序列如序列表seq id no.11所示）或与该序列一致性为95%以上且来源于相同种属。

24、上述l-赖氨酸生产菌株的构建方法，具体步骤为：将所述启动子通过基因编辑技术整合至出发菌株基因组中l-赖氨酸合成通路基因的起始密码子atg上游。

25、优选的，上述l-赖氨酸生产菌株的构建方法，所述出发菌株是谷氨酸棒状杆菌。

26、上述启动子、基因表达盒、表达载体、宿主细胞或l-赖氨酸生产菌株在发酵生产l-赖氨酸或提高l-赖氨酸产量中的应用。

27、优选的，上述应用，具体步骤如下：

28、（1）种子活化及培养：菌液均匀涂布于活化斜面进行培养，转接活化斜面继续培养，再转接至含种子培养基的摇管中进行种子培养；

29、（2）发酵培养：将种子液接入装有发酵培养基的三角瓶中，振荡培养；添加碳酸钙，间歇流加氢氧化钠控制ph在7.0左右。

30、优选的，上述应用，具体步骤如下：

31、（1）种子活化及培养：菌液均匀涂布于活化斜面，32℃培养12h，转接活化斜面继续培养10h，再转接至含种子培养基的摇管中进行种子培养；

32、（2）发酵培养：按5%接种量将种子液接入装有发酵培养基的三角瓶中，9层纱布封口，置巡回式摇床(200r/min)上，32℃振荡培养48h；添加碳酸钙2%，间歇流加氢氧化钠控制ph在7.0左右。

33、优选的，上述应用，种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖0.5-1.5g/l，蛋白胨8-12g/l，牛肉膏8-12g/l，酵母粉4-6g/l，nacl 2.0-3.0g/l，琼脂23-27g/l。

34、优选的，上述应用，种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖1g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂25g/l，ph 7.0～7.2。

35、优选的，上述应用，种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖0.5-1.5g/l，玉米浆8.0-12.0ml/l，mgso4·7h2o 0.3-0.5g/l，kh2po40.8-1.2g/l，l-丙氨酸0.3-0.4g/l，味精0.05-0.15g/l，mnso4·h2o 0.005-0.015g/l，生物素45-55μg/l，烟酰胺4-6mg/l，硫胺素0.1-0.3mg/l，ph-7.0～7.2。

36、优选的，上述应用，种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖1g/l，玉米浆10.0ml/l，mgso4·7h2o 0.4g/l，kh2po41.0g/l，l-丙氨酸0.35g/l，味精0.1g/l，mnso4·h2o 0.01g/l，生物素50μg/l，烟酰胺5mg/l，硫胺素0.2mg/l，ph7.0～7.2。

37、优选的，上述应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖35.0-45.0g/l，玉米浆35.0-45.0ml/l，kh2po4·3h2o 2.0-4.0g/l，mgso4·7h2o 1.0-2.0g/l，mnso4·h2o0.01-0.02g/l，生物素0.7-0.9mg/l，烟酰胺0.7-0.9mg/l，硫胺素140-160μg/l，caco325-35g/l(单独灭菌)，ph 7.0～7.2，苯酚红1-3%，其余为水。

38、优选的，上述应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：葡萄糖40.0g/l，玉米浆40.0ml/l，kh2po4·3h2o 3.0g/l，mgso4·7h2o 1.5g/l，mnso4·h2o 0.015g/l，生物素0.8mg/l，烟酰胺0.8mg/l，硫胺素150μg/l，caco330g/l(单独灭菌)，ph7.0～7.2，苯酚红2%，其余为水。

39、上述培养基均可采用标准方法制备获得。

40、有益效果：

41、上述启动子，以sod启动子(其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示)为基础，利用salis lab promoter calculator对核心区（-35/-10）和up元件进行理性设计与优化，获得多个候选启动子序列，经功能验证表明，优化后的序列seq id no.6（ttttatatattatattttttttgacaattgttatgcaaaagtataatggaaggaggtgtcgccacca）表现出最佳的表达增强效果，序列seq id no.5（ttttatatattatattttttttgacaattgttatgcaaaagtataatggaaggaggtttcgccagca）亦有较好的表达增强效果。启动子序列的关键突变通过优化转录起始效率，在谷氨酸棒状杆菌中有效增强了赖氨酸合成能力，为构建高效赖氨酸生产菌株提供了重要的启动子顺式调控元件与工程化策略。

42、通过基因编辑技术将所述启动子整合至出发菌株谷氨酸棒状杆菌lys-05(cn202610405633.3实施例1中菌株lys-05)基因组中赖氨酸合成通路基因

aspb、dapa和

ddh的起始密码子atg上游，成功构建了不含质粒、无生长缺陷、无需诱导且遗传稳定性良好的重组谷氨酸棒状杆菌工程菌株，有效提升其赖氨酸生产能力。摇瓶发酵结果表明，使用上述优化的sod启动子构建的重组菌株的赖氨酸氨酸产量分别达到5.65g/l、5.23g/l和5.44g/l，显著高于原始sod启动子表达aspb、dapa和ddh的谷氨酸棒状杆菌重组菌菌株（4.45g/l、4.52g/l和4.56g/l）。