一种用于检测丙戊酸血药浓度的荧光探针及其制备与应用的制作方法

：本发明涉及医药检测，尤其涉及一种用于检测丙戊酸血药浓度的荧光探针及其制备与应用。

背景技术

0、 背景技术：

1、丙戊酸(valproic acid，vpa)作为一线广谱抗癫痫发作药物，在儿科临床中被广泛应用于治疗全面性癫痫、部分性癫痫、不同癫痫综合征以及各种癫痫共患病。在临床实践中，vpa用药后的不良反应与其血药浓度密切相关。有研究表明，vpa血药浓度较低(<50mg/l)的患儿癫痫复发风险是vpa血药浓度处于有效范围内(50-100mg/l)患儿的3.06倍。而当vpa血药浓度>120mg/l时，不良反应发生的概率将大大增加，如倦睡、眩晕、恶心、呕吐、体重增加、肝功能损害等。此外，由于vpa与血浆蛋白结合的饱和性受多种代谢酶的影响，引起vpa的血药浓度个体差异较大，药物相互作用复杂，剂量与体内暴露量之间呈现非线性的相关性，造成临床用药指导的困难。在agnp精神科治疗药物监测共识指南(2017版)中，研究者对vpa血药浓度监测的推荐等级为第一级：强烈推荐。因此，监测儿童癫痫患者体内vpa血药浓度水平，对临床调整剂量、提高患者依从性、评价疗效、避免毒副作用和实施vpa的个体化治疗具有重要意义。

2、由于vpa分子中缺乏有效的检测发光基团，导致当前检测方法无法直接对丙戊酸进行快速检测。目前传统检测vpa血药浓度方法主要分为气相色谱法(gaschromatography，gc)，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，hplc)和化学发光法。这些方法的样本前处理过程涉及步骤繁琐且无法大规模批量检测，干扰因素多，检测成本高，准确性低且灵敏度较低，影响vpa检测效率和准确性。由于临床上vpa血清样本较多，目前尚缺乏快速灵敏可靠的检测分析方法应用于儿童vpa血药浓度监测，因此建立一种快速、灵敏、稳定的vpa检测分析方法对于儿童个体化精准用药具有重要临床应用价值。荧光探针用于生命活动进程的检测已经成为当前重要的研究领域之一，荧光分析方法具有如下优点：高灵敏度、快速无创伤分析和实时动态监测等。

3、相比传统监测方式，基于激发态分子内质子转移效应(esipt效应)和对羟基溴苯乙酮的荧光探针在一定程度上可以避免干扰，同时由于具有esipt效应和低的光子吸收，能提供高分辨率的荧光强度和快速释放的荧光信号，而且可以以较高的灵敏度和特异性对生物样本中的vpa进行跟踪和监测，从而更好的对生物样品进行实时追踪和定量。为了提高vpa检测效率和准确性，发展一种理想的荧光探针用于临床样品中vpa的检测是十分必要的。

技术实现思路

0、 技术实现要素：

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于检测丙戊酸血药浓度的荧光探针及其制备与应用，该探针通过在对羟基溴苯乙酮(php)基团上引入2-(2'-羟基苯基)苯并噻唑(hbt)类结构部分，使其具有内置的esipt取代基，可以扩展其激发波长，产生比率型的发光团，可以作为环境敏感的荧光团。这种荧光团可以帮助php基团的苯酚部分去质子化，以实现更快的释放，并且能够在光释放时产生明显的荧光颜色变化，可以更加灵敏的对生物样品中的vpa进行定量检测，避免血清样本中的物质干扰，解决现有的检测方法准确性和灵敏性不佳的问题。

3、(二)技术方案

4、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

5、一种用于检测丙戊酸血药浓度的荧光探针及其制备与应用，该探针的结构如下：

6、

7、其中r1，r2为h、f、cl、br、i、no2、c1-18烷基、cn、conhnh2、coor、oh、och3中的一种，r3为f、cl、br、i中的一种。

8、本发明公开一种用于检测丙戊酸血药浓度的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

9、(1)5-乙酰基-2-羟基苯甲醛的制备

10、取alcl3和二氯甲烷混合，冰浴搅拌，加入合适的溶剂继续搅拌，缓慢滴加水杨醛，氩气保护，持续一定的反应时间；反应结束后，将溶液倒入hcl和冰的混合液中，用二氯甲烷萃取；得到的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物经硅胶柱层析分离纯化，采用合适的洗脱剂，得到5-乙酰基-2-羟基苯甲醛；

11、(2)1-(3-(5，6双取代苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基苯基)乙烷-1-酮的制备

12、将5-乙酰基-2-羟基苯甲醛，2-氨基-5-取代基-4-甲基苯硫醇，硫代硫酸钠溶于合适的溶剂中，并在合适的反应温度和氩气氛围下搅拌，tlc监测反应进程；持续一定反应时间后倒入蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，得到的有机相经无水硫酸钠干燥，减压至一定的压强，蒸馏除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析分离，采用合适的洗脱剂，得到白色固体1-(3-(5，6双取代苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基苯基)乙烷-1-酮；

13、(3)荧光探针的制备

14、将1-(3-(5，6双取代苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基苯基)乙烷-1-酮溶于合适的溶剂中，在氩气保护下缓慢滴加溶于合适的溶剂中的铜盐溶液，在一定的反应温度下持续一定的反应时间；反应结束后过滤，滤液经减压浓缩得到粗产物，经硅胶柱层析分离，采用合适的洗脱剂，得到白色固体荧光探针。

15、进一步地，所述溶剂为dmf、dmso、乙腈、丙酮，乙醇，四氢呋喃，二氯甲烷，醋酸酐中的任意一种。

16、进一步地，所述反应温度为25-150℃。

17、进一步地，所述反应时间为2h-48h。

18、进一步地，所述减压浓缩是在压强为0.1mpa-10mpa下进行的，所述洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯混合物或二氯甲烷与甲醇混合物中的一种，这两种混合物中，原料的体积比范围为100:1-1:1。

19、进一步地，所述硅胶柱层析分离采用100-800目硅胶柱；所述铜盐为氯化铜，溴化铜，碘化亚铜中的一种；所述2-氨基-5-取代基-4-甲基苯硫醇的结构如下：

20、

21、其中r1，r2为h、f、cl、br、i、no2、c1-18烷基、cn、conhnh2、coor、oh、och3中的一种。

22、本发明还提供上述荧光探针在丙戊酸浓度检测中的应用。

23、进一步地，所述荧光探针对丙戊酸浓度的检测在血清样本中进行。

24、本发明提供的荧光探针，其荧光性质通过在php基团上引入hbt部分，使其具有内置的esipt取代基，使其发射波长大于400nm。所述的荧光探针在生理条件下能够监测血清样本中vpa的变化，转化为其荧光信号变化，可用于vpa的血药浓度监测，并对药物治疗癫痫进行疗效评价，为后续的vpa临床疗效提供初步依据。

25、(三)有益效果

26、本发明产生的有益效果是：

27、1.本发明通过在php基团上引入hbt部分，使其具有内置的esipt取代基，成功发展了一种新结构的荧光探针，提高了探针的灵敏性。

28、该荧光探针相比于已存在的检测方法存在以下几个优点：

29、(1)较低的检出限，灵敏度较高；

30、(2)受仪器，微环境等因素干扰较小，可以在体内外获得有效高分辨率检测，特别是在深部组织中，而且还能以较高的灵敏度和特异性对体内的vpa进行跟踪和监测，能实现对被测物质的实时检测；

31、(3)可以通过荧光强度的变化对被测物质进行定量分析，不受生物样本背景的干扰。

32、2.通过利用该荧光探针对临床血清样本中vpa检测发现，该探针可以一次性同时检测50个样本，较大提高了检测效率。

33、3.与传统检测方法相比，利用本发明提出的荧光探针进行vpa检测操作简便，试剂消耗成本较低，准确性高，具有良好的临床转化应用前景。