一种高活性与高稳定性的脂肪酶及其应用

本发明涉及一种高活性与高稳定性的脂肪酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术：

1、短链脂肪酸乙酯具有典型的水果香气，广泛用作食品体系中的天然风味添加剂。其中，己酸乙酯是乳制品、糖果和发酵饮品等产品中的关键香气成分。然而，天然风味酯通常在天然来源中含量较低，提取成本较高，限制了其大规模工业化应用。与传统化学合成相比，脂肪酶催化酯化反应在绿色制造方面具有显著优势，包括反应条件温和、底物特异性和化学选择性高、副产物生成少，以及由于催化选择性高而有利于简化产物分离过程。这些特点使酶法合成成为高附加值风味酯可持续制备的重要途径。近年来，相关研究进一步表明，水相生物催化、无溶剂酯化、固定化脂肪酶体系的绿色评价指标正在推动风味酯合成向更加绿色的方向发展。总体来看，该领域正逐渐从传统有机溶剂体系转向更安全的反应介质、更高效的催化剂重复利用方式以及更定量化的环境性能评价。然而，许多高产率酯化策略仍依赖有机介质、低水体系、固定化酶制剂、活化酰基供体或除水操作。因此，如何重构脂肪酶，使其在富水且组成复杂的发酵来源副产物流中仍能保持较高活性和耐久性，是当前仍有待深入探索的问题。

2、这一挑战对于脂肪酸和乙醇在水相体系中进行酯化反应尤为突出，因为该反应环境会对酶的催化性能施加多重限制。短链脂肪酸和醇类可能抑制脂肪酶活性或破坏酶结构稳定性，尤其是在高底物负载或富醇条件下更为明显。在脂肪酸乙酯合成过程中，醇既是必需反应物，也是潜在的过程胁迫因子。过量醇通常用于推动酯化反应进行，但也可能通过削弱酶结构稳定性或扰乱催化微环境而降低催化效率。反应介质进一步决定了脂肪酶催化酯合成能否在绿色且食品相容的条件下实现。水相体系和界面工程化水相体系具有环境友好、不易燃以及适用于食品相关加工过程等优势，因此为风味酯合成提供了具有吸引力的平台。同时，这类体系也有助于相对水溶性的 c2–c6 脂肪酸底物分散和传质。然而，水相酯化仍面临显著挑战，因为该反应受到热力学平衡限制，并与水解反应相竞争，通常导致催化效率较低、底物转化受限和酯积累不足。因此，在水相体系中实现高效酯合成，需要脂肪酶在富水条件下同时保持较高的酯化活性、醇耐受性和结构稳定性。

3、南极假丝酵母脂肪酶b（calb）是应用最广泛的工业脂肪酶之一，因其在酯化和转酯化反应中具有广泛的底物适应性和较高的选择性而受到关注。然而，天然calb在工业条件下的稳健性仍然有限，尤其是在富醇环境中更为明显。近年来，理性设计、半理性工程、定向进化以及机器学习辅助蛋白质工程的发展，为提升脂肪酶性能提供了有力工具。基于结构的工程策略，包括空腔、通道和环区工程，能够识别调控底物进入、局部柔性和热稳定性的关键残基。与此同时，基于序列和机器学习的模型能够快速优先筛选进化上可耐受或功能上有利的氨基酸替换，从而降低实验筛选工作量。然而，目前多数改造策略主要集中于提高蛋白骨架稳定性或优化底物结合口袋，而将配体响应性催化动态与远端位点稳定化相耦合的机制导向型设计框架仍不完善。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明要解决的技术问题是获得一种高活性与高稳定性的脂肪酶。

3、技术方案

4、通过整合动态活性优化与远端稳定化设计，本发明建立了一种可推广的酶工程技术，用于突破活性与稳定性之间的权衡关系，获得了高活性与高稳定性的calb 突变体，并实现了水相体系中较高的酯化转化率。

5、具体的，本发明以calb为模型酶，构建了一种计算设计策略：slingshotperturbation-evolutionary enzyme design，简称 speed，用于同步提升calb在脂肪酸乙酯合成中的催化效率、热稳定性和醇耐受性。所述计算设计策略将“弹弓效应”方法与进化指导的远端残基设计相结合。首先，本发明提出了一种基于可控构象扰动的机制启发型“弹弓效应”框架，用于探测和量化能调控酶–配体复合物动态响应性的关键热点残基。所述“弹弓效应”框架是通过在calb催化残基 ser105 与配体羰基碳之间梯度施加距离约束，模拟了“加载–保持–释放”过程，从而探测配体响应性构象动态，并识别与催化响应相关的动态热点。所述配体可以是底物己酸或产物己酸乙酯。其次，通过进化指导和计算辅助的热稳定性设计流程对calb的远端残基进行改造，以在不直接扰动催化中心的前提下增强结构稳健性。随后，在不同酰基链长的水相体系中评价有益突变体的脂肪酸乙酯合成性能。

6、本发明提供一种进化南极假丝酵母脂肪酶b的方法，所述方法结合了“弹弓效应”方法与进化指导的远端残基设计，主要包括以下步骤：

7、1.“弹弓效应”的设计流程如下：（1.1）获取南极假丝酵母脂肪酶b的三维结构模型，并将待评价配体分子对接至南极假丝酵母脂肪酶b的催化活性中心，得到酶-配体复合物结构模型；所述待评价配体可以是底物己酸或产物己酸乙酯；需说明的是，所述待评价配体是指在分子动力学模拟过程中与南极假丝酵母脂肪酶b（calb）活性中心结合的小分子，包括底物己酸和反应产物己酸乙酯，“配体”并不完全等同于“底物”，而是底物和产物的统称，分别对酶–底物复合物和酶–产物复合物进行距离约束分子动力学模拟，并比较二者在相同约束距离下的残基柔性变化；

8、（1.2）以步骤（1.1）得到的酶-配体复合物结构模型作为初始结构，进行分子动力学模拟；在分子动力学模拟过程中，对南极假丝酵母脂肪酶b中ser105残基的oγ原子与配体分子羰基碳原子之间的距离施加距离约束，使所述距离按照设定范围进行变化；

9、（1.3）所述距离约束包括三个连续阶段：第一阶段，将ser105残基的oγ原子与配体分子羰基碳原子之间的距离由7 å逐渐缩短至3 å；第二阶段，将所述距离维持在3 å至4å范围内；第三阶段，将所述距离由3 å逐渐增大至7 å；

10、（1.4）对步骤（1.3）得到的分子动力学模拟轨迹进行分析，计算各氨基酸残基在“弹弓效应”模拟过程中的柔性变化值 δrmsf(d)，并采用 δrmsf(d) 表征相同约束距离下由配体状态变化引起的残基柔性重分布；对各约束距离下 δrmsf(d) 的绝对值进行平均，得到平均绝对柔性响应值，并将其作为量化各氨基酸残基弹弓响应程度的指标，δrmsf(d)的计算公式为：

11、δrmsf(d) = rmsfe-product(d)rmsfe-substrate(d)

12、其中，rmsfe-product(d) 和 rmsfe-substrate(d) 分别表示在相同约束距离 d 下，酶–产物复合物（e-product）和酶–底物复合物（e-substrate）中主链 cα 的 rmsf 值；

13、（1.5）根据步骤（1.4）得到的各氨基酸残基的平均绝对柔性响应值，筛选柔性响应程度较高的氨基酸残基，并结合其空间位置和结构功能，确定与底物结合、底物进入催化活性中心或催化构象形成相关的候选突变位点；

14、（1.6）针对步骤（1.5）确定的候选突变位点，分别构建单点氨基酸替换序列；将野生型南极假丝酵母脂肪酶b的氨基酸序列输入蛋白质语言模型esm-scan中进行评分，得到各单点氨基酸替换序列相对于野生型序列的序列兼容性评分；

15、（1.7）根据步骤（1.6）得到的序列兼容性评分，对候选氨基酸替换进行排序，选择序列兼容性评分较高的氨基酸替换作为候选突变，并将所述候选突变引入南极假丝酵母脂肪酶b中，得到南极假丝酵母脂肪酶b突变体。

16、2.远离催化活性中心的稳定性突变位点筛选

17、在步骤1.获得催化活性提高的南极假丝酵母脂肪酶b突变体后，进一步筛选用于提高稳定性的远端突变位点，具体包括如下步骤：

18、（2.1）以南极假丝酵母脂肪酶b突变体的三维结构模型作为初始结构，分别在不同温度条件下进行分子动力学模拟，得到不同温度下的分子动力学模拟轨迹；

19、（2.2）对步骤（2.1）得到的分子动力学模拟轨迹进行分析，计算各氨基酸残基的均方根波动值；将高温条件下均方根波动值高于全蛋白平均均方根波动值的残基，或高温条件下均方根波动值相对于低温条件明显升高的残基，确定为候选柔性残基；

20、（2.3）以南极假丝酵母脂肪酶b的催化三联体残基ser105、asp187和his224为催化活性中心，计算步骤（2.2）得到的候选柔性残基与所述催化活性中心之间的空间距离；保留与ser105距离均大于10 å的候选柔性残基，作为远离催化活性中心的候选突变位点；

21、（2.4）将南极假丝酵母脂肪酶b突变体的氨基酸序列和三维结构模型分别输入pross、fireprot和abacus蛋白质稳定性设计程序中，并将催化活性中心设定为不进行突变的残基，分别获得pross、fireprot和abacus推荐的氨基酸替换结果；

22、（2.5）对步骤（2.4）中pross、fireprot和abacus推荐的氨基酸替换结果进行比较，筛选同时满足以下条件的氨基酸替换作为候选稳定性突变：所述氨基酸替换位于步骤（2.3）确定的远离催化活性中心的候选突变位点，所述氨基酸替换未改变ser105、asp187和his224，且所述氨基酸替换由pross、fireprot和abacus共同推荐；

23、（2.6）获取南极假丝酵母脂肪酶b及其同源蛋白的氨基酸序列，对所述氨基酸序列进行多序列比对和系统发育分析，并通过祖先序列重构获得推定的祖先蛋白氨基酸序列；统计各候选突变位点在所述推定的祖先蛋白氨基酸序列中的氨基酸分布；当步骤（2.5）得到的候选稳定性突变与所述推定的祖先蛋白氨基酸序列中出现频率较高的氨基酸一致时，将该候选稳定性突变确定为待构建的稳定性突变；

24、（2.7）将步骤（2.6）确定的稳定性突变引入南极假丝酵母脂肪酶b突变体中，得到具有提高热稳定性的南极假丝酵母脂肪酶b组合突变体。

25、本发明提供南极假丝酵母脂肪酶b突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的南极假丝酵母脂肪酶b的第146位丙氨酸突变为甘氨酸（a146g）、第278位亮氨酸突变为甲硫氨酸（l278m）、第162位丙氨酸突变为半胱氨酸（a162c）、第282位丙氨酸突变为异亮氨酸（a282i）以及第308位赖氨酸突变为半胱氨酸（k308c），或第146位丙氨酸突变为甘氨酸（a146g）、第278位亮氨酸突变为甲硫氨酸（l278m）、第162位丙氨酸突变为半胱氨酸（a162c）、第282位丙氨酸突变为异亮氨酸（a282i）、第308位赖氨酸突变为半胱氨酸（k308c）、第147位亮氨酸突变为甘氨酸（l147g）、第149位缬氨酸突变为甘氨酸（v149g）以及第193位谷氨酰胺突变为天冬酰胺（q193n）。

26、本发明提供所述南极假丝酵母脂肪酶b突变体在合成酯类，包括中链脂肪酸酯、短链脂肪酸酯中的应用。所述应用可以是在水相体系或无溶剂体系中进行，所述水相体系可以是水、缓冲液、含醇类的溶液、含脂肪酸的溶液。所述应用适用的底物包括脂肪酸和醇；所述脂肪酸包括直链脂肪酸、支链脂肪酸和环状脂肪酸，优选包括丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸一种或多种；所述醇包括直链醇、支链醇和环状醇，优选为乙醇、甲醇。所述短链脂肪酸酯优选为丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯中的一种或多种；所述中长链脂肪酸酯包括庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯中的一种或多种。

27、有益效果

28、speed支持的calb计算设计能够在水相介质中实现游离脂肪酸与乙醇的直接酯化反应，无需额外添加疏水性有机溶剂，也无需专门的除水操作，从而减少溶剂使用，并避免由脱水步骤产生的额外废弃物。speed 策略显著提高了 calb 的催化效率、热稳定性和醇耐受性，将酯化活性的增强与操作稳健性的提升相结合，而不是仅优化单一催化参数。

29、工程化催化剂8x能够在含有高浓度乙醇等极性醇的水相体系中维持较高酯化活性，此类反应体系通常会同时面对酶活性、催化剂稳定性和酯化反应平衡的挑战。除明确组成的单一脂肪酸底物外，8x 还能够促进无溶剂体系中不同链长酯类的生成，表明 speed在优化提升脂肪酶酯化特性方面具有的应用潜力。

30、应用本发明的南极假丝酵母脂肪酶b突变体在水相条件下生成的脂肪酸乙酯与后续产物回收过程具有较好兼容性，并且该反应无需辅因子或化学计量的活化试剂，有助于简化反应体系并降低应用成本。此外，在无溶剂体系中，本发明的南极假丝酵母脂肪酶b突变体8x催化合成不同脂肪酸乙酯的转化率进一步提升，其中对底物己酸的转化率达到99.64%。