一种长效单修饰聚乙二醇化双重氨基酸降解活性的欧文氏菌天冬酰胺酶缀合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，涉及欧文氏菌天冬酰胺酶（erwiniachrysanthemi asparaginase）的定点突变体与单一40 kda聚乙二醇高分子结合的缀合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、欧文氏菌l-天冬酰胺酶兼具l-天冬酰胺酶、l-谷氨酰胺酶双重催化活性，可降解循环内l-天冬酰胺和l-谷氨酰胺。其于2011年获fda批准用于急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblastic leukemia, all）二线治疗，尤其适用于对一线大肠杆菌来源的天冬酰胺酶（e.coli asparaginase）产生过敏反应的患者（pieters, r., hunger, s. p., boos, j.,rizzari, c., silverman, l., baruchel, a., ... & pui, c. h. (2011). l‐asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on erwiniaasparaginase. cancer, 117(2), 238-249.）。为延长欧文氏菌天冬酰胺酶在体内的半衰期，研究人员对其进行了随机聚乙二醇化修饰，得到衍生物pegcrisantaspase（pegc），用于治疗急性髓系白血病（aml）和胰腺癌导管腺癌等非l-天冬酰胺营养缺陷型癌症（liu, y.,bollino, d. r., bah, o. m., strovel, e. t., le, t. v., zarrabi, j., ... &emadi, a. (2025). a phase 1 study of the amino acid modulatorpegcrisantaspase and venetoclax for relapsed or refractory acute myeloidleukemia. blood, 145(5), 486-496. liu, y., bollino, d., bah, o. m., strovel,e. t., zarrabi, j., philip, s., ... & emadi, a. (2023). overcoming venetoclax(ven) resistance through glutamine (gln) depletion: final analysis of thephase 1 trial of ven and pegcrisantaspase (pegc) combination in relapsed andrefractory (r/r) acute myeloid leukemia (aml). blood, 142, 60. bollino, d.,hameed, k., bhat, a., zarrabi, a., casildo, a., ma, x., ... & emadi, a.(2024). long-acting erwinia chrysanthemi, pegcrisantaspase, induces alternateamino acid biosynthetic pathways in a preclinical model of pancreatic ductaladenocarcinoma. cancer & metabolism, 12(1), 19.）。经5 kda分子聚乙二醇化修饰后，欧文氏菌天冬酰胺酶的剂量可从fda认可的25000 u/m2降至750 u/m2，单次给药体内药效可维持约1周（liu, y., bollino, d. r., bah, o. m., strovel, e. t., le, t. v.,zarrabi, j., ... & emadi, a. (2025). a phase 1 study of the amino acidmodulator pegcrisantaspase and venetoclax for relapsed or refractory acutemyeloid leukemia. blood, 145(5), 486-496.）。现有i期临床pegc联用venetoclax治疗复发难治aml的数据显示，获得完全缓解受试者的血浆l-谷氨酰胺浓度最低（liu, y.,bollino, d., bah, o. m., strovel, e. t., zarrabi, j., philip, s., ... &emadi, a. (2023). overcoming venetoclax (ven) resistance through glutamine(gln) depletion: final analysis of the phase 1 trial of ven andpegcrisantaspase (pegc) combination in relapsed and refractory (r/r) acutemyeloid leukemia (aml). blood, 142, 60.）。现有随机 peg 修饰工艺存在明显短板：pegc经随机的聚乙二醇化修饰后，不但降低了其消耗癌细胞依赖的l-谷氨酰胺的效率，难以在急性髓系白血病的患者（liu, y., bollino, d. r., bah, o. m., strovel, e. t.,le, t. v., zarrabi, j., ... & emadi, a. (2025). a phase 1 study of the aminoacid modulator pegcrisantaspase and venetoclax for relapsed or refractoryacute myeloid leukemia. blood, 145(5), 486-496. liu, y., bollino, d., bah, o.m., strovel, e. t., zarrabi, j., philip, s., ... & emadi, a. (2023).overcoming venetoclax (ven) resistance through glutamine (gln) depletion:final analysis of the phase 1 trial of ven and pegcrisantaspase (pegc)combination in relapsed and refractory (r/r) acute myeloid leukemia (aml).blood, 142, 60.）、小鼠的胰腺异种移植瘤模型（bollino, d., hameed, k., bhat, a.,zarrabi, a., casildo, a., ma, x., ... & emadi, a. (2024). long-acting erwiniachrysanthemi, pegcrisantaspase, induces alternate amino acid biosyntheticpathways in a preclinical model of pancreatic ductal adenocarcinoma. cancer &metabolism, 12(1), 19.）和白血病和淋巴瘤细胞（chien, w. w., allas, s.,rachinel, n., sahakian, p., julien, m., le beux, c., ... & salles, g. (2014).pharmacology, immunogenicity, and efficacy of a novel pegylated recombinanterwinia chrysanthemi-derived l-asparaginase. investigational new drugs, 32(5), 795-805.）维持长效而又低的血浆l-谷氨酰胺浓度，而且，因随机性聚乙二醇化修饰容易造成批次与批次之间的差异，增加药物生产成本。

技术实现思路

1、针对现有随机聚乙二醇化欧文氏菌天冬酰胺酶存在谷氨酰胺消耗活性下降、产物批次差异大及药物效率有限等技术缺陷，本发明旨在提供一种高效、低免疫原性、长效的单聚乙二醇化欧文氏菌天冬酰胺酶缀合物及其制备工艺与新用途。本发明在保留酶体高效氨基酸降解活性的同时，提升药物体内稳定性与用药安全性，拓展肿瘤治疗应用场景。

2、本发明提供一种长效单修饰聚乙二醇化双重氨基酸降解活性的欧文氏菌天冬酰胺酶（命名为ngasparaginase40b、ngasparaginase40l），属于定点单聚乙二醇化修饰蛋白。该改性天冬酰胺酶基于野生型欧文氏菌天冬酰胺酶进行定点基因突变改造，突变位点为s316c（316位丝氨酸→半胱氨酸）；其编码基因序列如seq id no:1所示，对应的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明采用定点单聚乙二醇化修饰策略，相较于传统随机peg修饰技术，可精准实现单分子peg定点偶联，彻底规避随机修饰带来的产物异质性、批次差异大的问题。同时，定点修饰方式可完全保留欧文氏菌天冬酰胺酶天然的高l-谷氨酰胺消耗活性，维持其双重氨基酸消耗功能；且通过单一peg分子定点包裹修饰，可有效屏蔽酶蛋白抗原位点，减少机体自身抗体的识别与攻击，显著降低药物免疫原性，大幅提升药物体内作用效率与长效性。

4、本发明采用的聚乙二醇（peg）分子量为40 kda，包含线型、支链型两种类型，分别对应制备得到ngasparaginase40l（线型peg修饰）、ngasparaginase40b（支链型peg修饰）。在聚乙二醇化反应体系中，改性蛋白与peg分子的摩尔配比优选为1:1.5，可稳定实现单分子定点修饰效率，避免多聚修饰或修饰不完全的问题。

5、本发明还公开了上述单聚乙二醇化修饰蛋白的专属纯化方法，采用阴阳离子柱串联纯化工艺：优先通过q柱进行初步纯化，去除杂蛋白、核酸及大部分杂质，再经sp柱精细精制，最终获得高纯度、均一性的单定点peg修饰欧文氏菌天冬酰胺酶，有效保证产物批次一致性。

6、本发明制备的长效单修饰聚乙二醇化双重氨基酸降解活性的欧文氏菌天冬酰胺酶缀合物，具备高氨基酸消耗活性、低免疫原性、长效稳定的优势，可应用于实体瘤治疗，尤其适用于肺癌、肠癌的临床治疗，突破了传统欧文氏菌天冬酰胺酶仅用于血液肿瘤的应用局限，拓展了该类酶制剂的抗肿瘤应用场景。

7、本发明的有益效果：

8、本发明通过s316c定点基因突变实现与40 kda聚乙二醇的特异性定点结合，制得单聚乙二醇化蛋白ngasparaginase40b和ngasparaginase40l。本发明通过s316c定点突变实现单点、均一的聚乙二醇修饰，在有效延长药物体内半衰期的同时，完整保留了天冬酰胺酶高效消耗l-谷氨酰胺的活性，突破了现有技术的应用局限，可有效应用于多种实体肿瘤的治疗。本发明产品实现定点单聚乙二醇修饰（区别于无规随机peg修饰），具备极高的反应特异性。