用于检测尿液中的HPV生物标志物的组合物和方法

本公开提供了与检测和测量同hpv感染或hpv相关癌症相关的人乳头瘤病毒(hpv)(例如，病毒核酸、无细胞肿瘤来源dna (ctdna)、经肾无细胞肿瘤dna (tr-ctdna)等)有关的组合物、方法和试剂盒。具体而言，本公开提供了用于诊断、治疗和/或预防人乳头瘤病毒相关口咽鳞状细胞癌(hpv+opscc)或其他hpv相关癌症的新型组合物、方法和试剂盒。

背景技术：

1、hpv感染与包括宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌在内的若干癌症相关。此外，与hpv有关的口咽鳞状细胞癌(hpv+ opscc)是一种日益严重的流行病，尽管hpv疫苗已经问世，但由于在美国该疫苗的采用率相对较低，该流行病未来几十年内仍将是一个日益恶化的公共健康问题。表现出高危hpv+ opscc的患者很可能出现疾病复发，并且一旦复发，患者的5年生存率极低，仅为3-26%。

2、来自其他实体瘤的数据表明，在治疗后监测(pts)期间，在ct扫描可检测的疾病出现之前，通过基于生物体液的生物标志物检测到的复发(例如，“生物化学复发”)有可能通过挽救疗法实现治愈。与此一致的是，当疾病体积较小时，局部复发的opscc的存活率提高，表明hpv + opscc复发的较早期检测将改善结果。然而，目前hpv+ opscc pts的标准治疗是定期进行临床检查，这需要复发性肿瘤相对较大才能检测。不幸的是，虽然已经尝试过基于ct扫描的pts，但其灵敏度低、假阳性率高，并且没有提高生存率。

3、需要改进的与hpv有关的癌症的检测策略。

技术实现思路

1、本文提供了与检测和测量同hpv感染或hpv相关癌症相关的人乳头瘤病毒(hpv)(例如，病毒核酸、无细胞肿瘤来源dna (ctdna)、经肾无细胞肿瘤dna (tr-ctdna)等)有关的组合物、方法和试剂盒。具体而言，本公开提供了用于诊断、治疗和/或预防人乳头瘤病毒相关口咽鳞状细胞癌(hpv+opscc)或其他hpv相关癌症的新型组合物、方法和试剂盒。

2、本专利公开内容中每一章节的描述(无论任何标题或子标题如何)均旨在与所有其他章节结合阅读。此外，在本公开的每个章节中描述的各种实施方案可以各种不同的方式组合，并且所有此类组合旨在落入本发明的范围内。

3、本公开的实施方案包括用于在hpvctdna和/或tr-ctdna测定中使用的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含检测一个或多个hpv靶区域的一种或多种寡核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸被设计为扩增和/或检测高危hvp类型(例如，hpv16、hpv18、hpv31、hpv33和/或hpv39)的一个或多个靶区域。在一些实施方案中，该hpv靶区域是单链或双链的。在一些实施方案中，该寡核苷酸被用于单链或双链dna的扩增和定量。在一些实施方案中，该单链或双链dna来自患有与hpv有关的疾病或疾患(例如癌症(例如hpv + opscc))的受试者。

4、在一些实施方案中，hpv相关核酸的单链或双链区域包含约10个核苷酸(或碱基对/bp)至约100个碱基对。在一些实施方案中，包含hpv相关核酸序列的单链或双链区域为约5个核苷酸(或碱基对/bp)、约10个核苷酸(或碱基对/bp)、约15个核苷酸(或碱基对/bp)、约20个核苷酸(或碱基对/bp)、约25个核苷酸(或碱基对/bp)、约30个核苷酸、(或碱基对/bp)约35个核苷酸(或碱基对/bp)、约40个核苷酸(或碱基对/bp)、约45个核苷酸(或碱基对/bp)、约50个核苷酸(或碱基对/bp)、约55个核苷酸(或碱基对/bp)、约60个核苷酸(或碱基对/bp)、约65个核苷酸(或碱基对/bp)、约70个核苷酸(或碱基对/bp)、约75个核苷酸(或碱基对/bp)、约80个核苷酸(或碱基对/bp)、约85个核苷酸(或碱基对/bp)、约90个核苷酸(或碱基对/bp)、约95个核苷酸(或碱基对/bp)、约100个核苷酸(或碱基对/bp)、约110个核苷酸(或碱基对/bp)、约120个核苷酸(或碱基对/bp)、约130个核苷酸(或碱基对/bp)、约140个核苷酸(或碱基对/bp)、约150个核苷酸(或碱基对/bp)、约160个核苷酸(或碱基对/bp)、约170个核苷酸(或碱基对/bp)、约180个核苷酸(或碱基对/bp)、约190个核苷酸(或碱基对/bp)、约200个核苷酸(或碱基对/bp)、约220个核苷酸(或碱基对/bp)、约240个核苷酸(或碱基对/bp)、约260个核苷酸(或碱基对/bp)、约280个核苷酸(或碱基对/bp)、约300个核苷酸(或碱基对/bp)、约320个核苷酸(或碱基对/bp)、约340个核苷酸(或碱基对/bp)、约360个核苷酸(或碱基对/bp)、约380个核苷酸(或碱基对/bp)、约400个核苷酸(或碱基对/bp)、约420个核苷酸(或碱基对/bp)、约440个核苷酸(或碱基对/bp)、约460个核苷酸(或碱基对/bp)、约个核苷酸(或碱基对/bp)、约480个核苷酸(或碱基对/bp)、约500个核苷酸(或碱基对/bp)、约520个核苷酸(或碱基对/bp)、约540个核苷酸(或碱基对/bp)、约560个核苷酸(或碱基对/bp)、约580个核苷酸(或碱基对/bp)、约600个核苷酸(或碱基对/bp)、约620个核苷酸(或碱基对/bp)、约640个核苷酸(或碱基对/bp)、约660个核苷酸(或碱基对/bp)、约680个核苷酸(或碱基对/bp)、约700个核苷酸(或碱基对/bp)、约720个核苷酸(或碱基对/bp)、约740个核苷酸(或碱基对/bp)、约760个核苷酸(或碱基对/bp)、约780个核苷酸(或碱基对/bp)、约800个核苷酸(或碱基对/bp)、约820个核苷酸(或碱基对/bp)、约840个核苷酸(或碱基对/bp)、约860个核苷酸(或碱基对/bp)、约880个核苷酸(或碱基对/bp)、约900个核苷酸(或碱基对/bp)、约920个核苷酸(或碱基对/bp)、约940个核苷酸(或碱基对/bp)、约960个核苷酸(或碱基对/bp)、约980个核苷酸(或碱基对/bp)、约1000个核苷酸(或碱基对/bp)。

5、在一些实施方案中，该寡核苷酸由以下中的一者或多者组成：seq id no: 1、seqid no: 2、seq id no: 3、seq id no: 4、seq idno: 5、seq id no: 6、seq id no: 7和seqid no: 10，或与它们具有至少90%序列同一性的序列。

6、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与以下中的任一者或多者具有至少90%序列同一性的正向引物：seq id no: 1、2、3、4、10。在一些实施方案中，该正向引物还包含异碱基(例如，5'甲基异脱氧胞嘧啶(me-异dc)或异dg)。

7、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与seq id no:5具有至少90%序列同一性的第一反向引物。

8、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与seq id no: 6具有至少90%序列同一性的第二反向引物。

9、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与seq id no: 7具有至少90%序列同一性的探针。在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与seq id no: 7具有至少40%序列同一性、与seq id no: 7具有至少45%序列同一性、与seq id no: 7具有至少50%序列同一性、与seq id no: 7具有至少55%序列同一性、与seq id no: 7具有至少60%序列同一性、与seq id no: 7具有至少65%序列同一性、与seq id no: 7具有至少70%序列同一性、与seq id no: 7具有至少75%序列同一性、与seq id no: 7具有至少80%序列同一性、与seqid no: 7具有至少85%序列同一性的探针。在一些实施方案中，该探针被生物素化。在一些实施方案中，该探针在链霉亲和素包被的表面上被固定化。在一些实施方案中，该探针包含可检测的标记。在一些实施方案中，该探针包含小沟粘合剂(mgb)部分。在一些实施方案中，该探针包含非荧光猝灭剂(例如，3' eclipse暗猝灭剂(edq))。在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是与seq id no: 7具有至少90%序列同一性并具有可检测的标记、mgb部分和非荧光猝灭剂的探针。

10、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸是具有可检测的标记、与seq id no:7具有至少40%序列同一性的生物素化探针，并且在链霉亲和素包被的表面上被固定化。

11、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸包含：正向引物，该正向引物与以下中的任一者或多者具有至少90%序列同一性：seq id no: 1、2、3、4、10，并且包含5'甲基异脱氧胞嘧啶(me-异dc)；第一反向引物，该第一反向引物与seq id no: 5具有至少90%序列同一性；第二反向引物，该第二反向引物与seq id no: 6具有至少90%序列同一性；和探针，该探针与seq id no: 7具有至少90%序列同一性，并且包含可检测的标记。

12、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸包含以下中的两者或更多者：正向引物，该正向引物与以下中的任一者或多者具有至少90%序列同一性：seq id no: 1、2、3、4、10，并且包含5'甲基异脱氧胞嘧啶(me-异dc)；第一反向引物，该第一反向引物与seq idno: 5具有至少90%序列同一性；第二反向引物，该第二反向引物与seq id no: 6具有至少90%序列同一性；和探针，该探针与seq id no: 7具有至少90%序列同一性，并且包含可检测的标记。

13、在一些实施方案中，该一种或多种寡核苷酸包含以下中的每一者：正向引物，该正向引物与以下中的任一者或多者具有至少90%序列同一性：seq id no: 1、2、3、4，并且包含5'甲基异脱氧胞嘧啶(me-异dc)；第一反向引物，该第一反向引物与seq id no: 5具有至少90%序列同一性；第二反向引物，该第二反向引物与seq id no: 6具有至少90%序列同一性；和探针，该探针与seq id no: 7具有至少90%序列同一性，并且包含可检测的标记。

14、在一些实施方案中，该正向引物和该第一反向引物在第一低退火温度下与靶hpv序列退火，并且其中该第二反向引物在第二低退火温度下与该正向引物的环区域退火。

15、在一些实施方案中，第一低退火温度为约30摄氏度、31摄氏度、32摄氏度、33摄氏度、34摄氏度、35摄氏度、36摄氏度、37摄氏度、38摄氏度、39摄氏度、40摄氏度、41摄氏度、42摄氏度、43摄氏度、44摄氏度、45摄氏度、46摄氏度、47摄氏度、48摄氏度、49摄氏度、50摄氏度、51摄氏度、52摄氏度、53摄氏度、54摄氏度、55摄氏度、56摄氏度、57摄氏度、58摄氏度、59摄氏度、60摄氏度。

16、在一些实施方案中，第二低退火温度为约40摄氏度、41摄氏度、42摄氏度、43摄氏度、44摄氏度、45摄氏度、46摄氏度、47摄氏度、48摄氏度、49摄氏度、50摄氏度、51摄氏度、52摄氏度、53摄氏度、54摄氏度、55摄氏度、56摄氏度、57摄氏度、58摄氏度、59摄氏度、60摄氏度、61摄氏度、62摄氏度、63摄氏度、64摄氏度、65摄氏度、66摄氏度、67摄氏度、68摄氏度、69摄氏度、70摄氏度。

17、在一些实施方案中，该一个或多个靶区域选自由以下组成的组：seq id no: 8、seq id no: 9和seq id no: 11。

18、在一些实施方案中，该一个或多个靶区域是hpv16 e6基因。

19、本公开的实施方案还包括检测和/或定量来自受试者的样品(例如，羊水、腹水、胆汁、母乳、初乳、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、透析液、眼房水、眼玻璃体液、粪便、穿刺液、心包液、腹膜液、血浆、胸膜液、精液、血清、滑液、泪液、胸腔穿刺液、血液、唾液、漱口液或尿液)中hpv相关核酸(例如病毒核酸和/或ctdna和/或tr-ctdna)的方法。

20、在一些实施方案中，本文提供了用于检测和/或定量hpv亚型16 (hpv16)核酸、hpv亚型18(hpv18)核酸、hpv亚型31(hpv31)核酸和/或hpv亚型39(hpv39)核酸(例如，病毒核酸和/或ctdna和/或tr-ctdna)的方法。在一些实施方案中，对尿液样品中的hpv核酸进行分析。

21、在一些实施方案中，该方法包括检测和/或定量来自受试者的样品中具有少于五十(50)个核苷酸的hpv相关核酸。在一些实施方案中，该hpv相关核酸包含约10个核苷酸(或碱基对/bp)至约100 bp。在一些实施方案中，该hpv相关核酸具有少于100个(例如，少于90个、少于80个、少于70个、少于60个、少于50个、少于50个、少于40个、少于30个、少于20个)核苷酸或碱基对。

22、在一些实施方案中，该检测和/或定量包括使用至少一种发夹引物(例如，包含seqid no: 1、2、3、4、10中的任一者或多者的引物)进行的核酸扩增。在一些实施方案中，该检测和/或定量包括数字扩增。在一些实施方案中，数字扩增包括数字pcr。在一些实施方案中，该扩增包括使样品与发夹引物和第二引物(例如，seq id no: 5、6)接触。

23、在一些实施方案中，该检测和/或定量包括使由发夹引物和第二引物产生的扩增子与一个或多个探针(例如，seq id no: 7)接触。

24、在一些实施方案中，受试者先前已被诊断为患有hpv感染或hpv相关疾病或疾患。在一些实施方案中，受试者已接受过疫苗、抗病毒药物或抗癌疗法的治疗。在一些实施方案中，hpv核酸在施用疗法之前和/或之后被检测。在一些实施方案中，测定结果被用于修改疗法(例如，改变剂量、改变药物、停止治疗等)。

25、本公开的实施方案还包括使来自受试者的样品(例如，尿液)与所述寡核苷酸中的一种或多种寡核苷酸接触的方法。在一些实施方案中，该样品包含hpv相关核酸(例如，病毒核酸和/或ctdna和/或tr-ctdna)。在一些实施方案中，该样品包含hpv亚型16(hpv16)核酸、hpv亚型18(hpv18)核酸、hpv亚型31(hpv31)核酸和/或hpv亚型39(hpv39)核酸。

26、在一些实施方案中，接触包括：(i)提供所述寡核苷酸中的一种或多种寡核苷酸；(ii)将来自所述样品的多个hpv dna以其中每个液滴中平均仅存在0或1个该dna分子的浓度分级分离成液滴；(iii)用所述寡核苷酸扩增每个液滴中的hpv dna以产生扩增子信号；以及(iv)检测每个液滴中的任何扩增子信号。在一些实施方案中，通过乳化将dna分级分离成微液滴。在一些实施方案中，使用核酸扩增方法扩增dna。

27、在一些实施方案中，该核酸扩增方法包括聚合酶链反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)或多重置换扩增(mda)。在一些实施方案中，该接触包括进行定量pcr(qpcr)测定。在一些实施方案中，该qpcr测定包括数字pcr测定。

28、在一些实施方案中，该数字pcr测定包括液滴数字pcr (ddpcr)测定。

29、在一些实施方案中，样品包含ctdna和/或tr-ctdna hpv靶核酸，并且寡核苷酸与hpv靶核酸杂交。在一些实施方案中，对hpv靶核酸或其衍生的产物(例如扩增子)进行测序。在一些实施方案中，测序技术是下一代测序技术。术语“下一代测序”是指执行核酸测序的高度并行化方法，并且包括合成测序或连接测序平台(例如由illumina、lifetechnologies、pacific biosciences和roche等公司所采用)。下一代测序方法还可包括但不限于纳米孔测序方法(诸如由oxford nanopore所提供)或基于电子检测的方法(诸如由life technologies商业化的ion torrent技术)。在一些实施方案中，本文所述的引物中的一种或多种引物还包括附加序列(例如，条形码、接头等)，该附加序列可用于测序文库制备、测序和分析。适合的核酸测序技术包括但不限于边合成边测序(参见例如meyer和kircher, "illumina sequencing library preparation for highly multiplexedtarget capture and sequencing," cold spring harbor protocols 2010 (6))；单分子实时测序(参见例如levene等人，"zero-mode waveguides for single-moleculeanalysis at high concentrations,” science. 299(5607): 682–6 (2003))；离子半导体测序(参见例如rusk, “torrents of sequence,” nat. methods 8, 44 (2011))；焦磷酸测序(参见例如wicker等人，“454 sequencing put to the test using the complexgenome of barley,” bmc genomics, 7:275, 2006)；边连接边测序(solid测序) (参见例如margulies等人，“genome sequencing in microfabricated high-density picolitrereactors,” nature, 437:376–80 (2005))；纳米孔测序(参见例如goodwin等人，“oxfordnanopore sequencing, hybrid error correction, and de novo assembly of aeukaryotic genome,” genome res., 25(11):1750-6 (2015))；链终止测序(桑格测序)(参见例如sanger等人，"dna sequencing with chain-terminating inhibitors, "proceedings of the national academy of sciences of the united states ofamerica, 74 (12): 5463–5467 (1977))；以及用质谱测序(参见例如edwards等人，"mass-spectrometry dna sequencing," mutation research, 573(1–2): 3–12 (2005))。

30、在一些实施方案中，所述接触包括：进行定量的通过平衡泊松采样的单分子识别(single molecule recognition through equilibrium poisson sampling, simreps)测定。术语“通过平衡泊松采样的单分子识别”是指用于检测和/或定量单个未经标记的分子(例如，ctdna和/或tr-ctdna)的无扩增方法(例如，直接检测方法)。适合的simreps技术包括但不限于单分子动力学指纹图谱技术(例如，参见stephen l. hayward等人,ultraspecific and amplification-free quantification of mutant dna by single-molecule kinetic fingerprinting, j am chem soc. 2018年9月19日;140(37):11755-11762.；alexander johnson buck等人, kinetic fingerprinting to identify andcount single nucleic acids, nat biotechnol.2015年7月; 33(7):730-2；以及kunalkhanna等人, rapid kinetic fingerprinting of single nucleic acid molecules bya fret-based dynamic nanosensor, biosens bioelectron. 2021年10月15日:190:113433)。

31、在一些实施方案中，所述接触包括：(i)提供所述寡核苷酸中的一种或多种寡核苷酸；(ii)将所述寡核苷酸中的所述一种或多种寡核苷酸固定化到表面上；(iii)使所述样品中的hpv dna反复瞬时结合到与所述表面结合的所述一种或多种寡核苷酸，以产生动力学指纹；以及(iv)检测任何动力学指纹。

32、在一些实施方案中，hpv dna与探针一起被固定化。在一些实施方案中，所述一种或多种寡核苷酸是如本文所述的探针。

33、在一些实施方案中，本文提供了检测hpv核酸和/或ctdna和/或tr-ctdna，并且在一些实施方案中，还包括如果在样品中检测到hpv，则用癌症监测、疗法或其他干预对受试者进行治疗的步骤的方法。在一些实施方案中，癌症治疗包括成像技术、临床检查、切除治疗、冷冻疗法、热消融、放射疗法、化学疗法和/或挽救疗法。在一些实施方案中，该治疗是在ct扫描可检测的癌症出现之前提供的。

34、在一些实施方案中，本文提供了检测hpv核酸和/或ctdna，并且在一些实施方案中，还包括如果在样品中未检测到hpv，则用hpv疫苗对受试者进行治疗的步骤的方法。在一些实施方案中，该方法还包括对所述样品中存在的hpv核酸进行测序。

35、本公开的实施方案还包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包含一种或多种如本文所述的寡核苷酸和/或寡核苷酸集合。在一些实施方案中，试剂盒还可包括纯化、分离、检测和/或定量hpv核酸和/或ctdna和/或tr-ctdna所必需、有用或足够的试剂。例如，试剂盒还可包括扩增试剂，包括缓冲液和酶。在一些实施方案中，如果需要或期望，试剂盒还可包括对照样品。在一些实施方案中，试剂盒可包括包含对靶ctdna和/或tr-ctdna具有特异性的捕获试剂(例如寡核苷酸)的固体表面(例如，珠)。在一些实施方案中，试剂盒还可包括用于容纳或储存样品、试剂或反应混合物的容器(例如，用于血浆样品的容器或盒、用于无细胞dna样品的容器等)。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括一种或多种用于协助获取或操作测试样品的一种或多种工具，诸如注射器。在适当的情况下，试剂盒可以含有反应容器、混合容器和其他有助于试剂制备的组件(例如，用于混合pcr用试剂的容器)。在一些实施方案中，试剂盒还可包括该试剂盒的使用说明书。试剂盒中包括的说明书可以贴在包装材料上，或者可以作为包装插页纳入，或者可以从作为试剂盒包装或插页材料的一部分列出的特定网站查看或下载。虽然说明书通常包含书面或打印材料，但它们并不限于这些。本公开涵盖能够存储此类说明书并且将其传达至终端用户的任何介质。此类介质包括但不限于，电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，cd-rom)等等。如本文所用，术语“说明”可以包括提供说明的互联网网站的地址。