甲基化标志物组及其在尿路上皮癌风险预测中的应用的制作方法

本技术涉及生物，尤其涉及甲基化标志物组及其在尿路上皮癌风险预测中的应用。

背景技术：

1、尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，是最常见的泌尿系统肿瘤。尿路上皮癌包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，其中膀胱癌占比最高，达到90％以上。血尿是膀胱癌最常见、最早期的症状，这种血尿往往是无痛的、间歇性的，能自行减轻或停止，极其容易造成疾病已经痊愈的错觉。膀胱癌具有生存期长、易复发(50％-70％的患者在5年内复发)的特点，因此进行膀胱癌筛查和复发监测是非常有必要的。

2、尿路上皮癌的检测目前常用的方法包括尿脱落细胞学检查、尿肿瘤标志物检测、影像学检查和内镜检查等。然而，相关的检测方法仍存在一些不足，如检测灵敏度、特异性不足等。

技术实现思路

1、本技术是基于发明人对下列问题的发现而作出的：

2、尿脱落细胞学检查是膀胱癌诊断和术后随访的重要方法之一，其敏感性为13％～75％，特异性为85％～100％，对g1和低级别肿瘤的敏感性仅16％。除了灵敏度低，尿脱落细胞学检查的性能还受到脱落细胞少、尿路感染、结石或膀胱灌注治疗等因素影响。

3、尿肿瘤标志物检测包括核基质蛋白22(nmp22)和膀胱肿瘤抗原(btastat及btatrak)等，因尿液肿瘤标志物检测的敏感性高但特异性较低，临床上尚未广泛应用。

4、影像学检查包括超声检查、ct及ct尿路造影(computed tomographyurography，ctu)、磁共振成像(mri)及磁共振尿路成像(magneticresonanceurography，mru)等。膀胱镜检查和活检是目前诊断膀胱癌最可靠的方法，也是术后复发监测的主要手段之一。但影像学和内镜检查费用昂贵，受限于设备和医师等医疗资源，无法大规模进行筛查，且部分检查可能对受检者带来伤害，如膀胱镜检查有可能引起泌尿男生殖系统感染、尿道及膀胱出血、尿道损伤和尿道狭窄等并发症，依从性较差，反复地监测更是对患者带来巨大的负担。

5、本技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。有鉴于此，本技术提供了一种甲基化标志物组，用于尿路上皮癌的检测具有高灵敏度、高特异性等优势。

6、具体而言，本技术技术方案如下所示：

7、在本技术的第一方面，本技术提出了一种甲基化标志物组。根据本技术的实施例，该甲基化标志物组包括：以hg19为参考基因组，具有如1)-17)所示的染色体区域中的至少之一；1)chr1：119528469-119530711；2)chr1：36042374-36043443；3)chr10：112838029-112838910；4)chr10：105344152-105344747；5)chr11：2890715-2891126；6)chr12：54348801-54349427；7)chr17：40700226-40700922；8)chr17：41363502-41364563；

8、9)chr18：46354015-46354306；10)chr19：45655294-45657245；11)chr2：63282360-63284369；12)chr3：147113840-147115561；13)chr5：140802400-140802884；14)chr7：27225125-27225962；15)chr8：57358060-57359512；16)chr8：57359216-57359347；17)chr8：144789639-144790191。

9、相比于传统的尿脱落细胞学检查、尿肿瘤标志物检测以及影像学检查方法，基于上述甲基化标志物中的一种或多种进行尿路上皮癌的检测，能够有效提升检测的灵敏度和特异性，提升尿路上皮癌的早诊率，减少假阳性导致的焦虑和过度治疗，节省成本，提高患者的依从性，可用于大规模医疗筛查。

10、可以理解的是，前述甲基化标志物包括但不限于选取1)-17)的子集、简单替换、简单增加等。

11、可以理解的是，上述甲基化标志物的表示为本领域技术人员的常规表示。示例性地，chr1：119528469-119530711表示1号染色体的第119528469位-第119530711位。其余甲基化标志物的表示方式相同，在此不再赘述。

12、需要说明的是，本技术以hg19为参考基因组，基于染色体编号以及该编号下的染色体位置，本领域技术人员可以知晓其具体序列，本技术在此不再展示1)-17)的具体序列。

13、需要说明的是，本技术仅展示了以hg19为参考基因组的甲基化标志物。本领域技术人员可以理解的是，基于本技术公开的是以hg19为参考基因组的甲基化标志物，基于其他参考基因组(如hg38、grch36、grch37、grch38等)获得的甲基化标志物也在本技术的保护范围内。

14、在本技术的一些优选示例中，前述甲基化标志物组由1)-17)所示的染色体区域中的全部或部分组成。基于甲基化标志物组的全部或部分进行尿路上皮癌的检测，能够有效提升检测灵敏度和特异性。

15、在本技术的一些更优先示例中，前述甲基化标志物组由1)-17)所示的染色体区域中的全部组成。基于甲基化标志物组的全部进行尿路上皮癌的检测，能够显著提升检测灵敏度和特异性。

16、在本技术的第二方面，本技术提出了第一方面的甲基化标志物组在如下任一中的应用，(b1)制备用于诊断或辅助诊断尿路上皮癌的产品；(b2)制备用于在临床症状之前预警尿路上皮癌的产品；(b3)制备用于区分或辅助区分尿路上皮癌和正常样本的产品。

17、本技术的甲基化标志物组用于制备辅助诊断尿路上皮癌样本的产品具有高灵敏度和高特异性。

18、在本技术的第三方面，本技术提出了用于检测第一方面的甲基化标志物组的试剂在制备检测产品中的应用，所述检测产品用于诊断尿路上皮癌。

19、基于检测本技术甲基化标志物组的试剂制备的检测产品可用于高灵敏度、高特异性检测尿路上皮癌。

20、在本技术的一些示例中，前述试剂包括：引物组和探针组。

21、在本技术的一些示例中，前述检测产品包括：试剂盒、试纸条或芯片。

22、在本技术的第四方面，本技术提出了一种尿路上皮癌发生风险预测方法。根据本技术的实施例，该方法包括：获取生物样本中超甲基化差异甲基化区域甲基化率的检测结果；将所述检测结果输入至风险预测模型中，确定所述生物样本的尿路上皮癌发生风险；其中，所述超甲基化差异甲基化区域(hyper-dmr)如第一方面所示。

23、基于前述方法进行尿路上皮癌发生风险预测，能够有效提升尿路上皮癌诊断效率和诊断准确性，节省诊断时间和人工成本，适宜大规模筛查。

24、在本技术的一些示例中，前述生物样本选自组织或体液。前述的体液可以选自血液、唾液、组织或尿液等。在本技术的一些优选示例中，前述生物样本选自尿液样本或来自于尿液的核酸样本。基于尿液样本或来自尿液的核酸样本，避免了侵入性的内镜检查，能够有效减少受检者的身心负担，提高检测依从性。

25、在本技术的一些示例中，前述超甲基化差异甲基化区域甲基化率是基于超甲基化差异甲基化区域内甲基化位点中甲基化胞嘧啶和所有胞嘧啶确定的。

26、在本技术的一些示例中，前述超甲基化差异甲基化区域甲基化率是基于超甲基化差异甲基化区域内甲基化位点中甲基化胞嘧啶占所有胞嘧啶的比值确定的。通过标准化甲基化率的计算方式，确保了检测结果的可重复性和稳定性。

27、在本技术的一些示例中，前述风险预测模型是通过如下方式训练获得的：获取训练集数据，所述训练集数据包括：训练样本的超甲基化差异甲基化区域甲基化率；采用机器学习模型对所述训练集数据进行建模，构建所述风险预测模型。基于本技术方法训练的模型能够用于准确预测尿路上皮癌的发生风险。

28、需要说明的是，本技术的风险预测模型为通过本领域常规的方法对机器学习模型进行训练获得，例如，通过python scikit-learn工具包对随机森林模型进行10折交叉验证构建获得。

29、在本技术的一些示例中，前述机器学习模型选自岭回归、lasso回归、逻辑回归、随机森林或支持向量机。

30、在本技术的一些示例中，前述检测结果基于甲基化特异性pcr、数字pcr定量、荧光定量pcr、dna甲基化芯片、焦磷酸测序、高通量测序、三代测序、单分子测序或靶向dna甲基化测序获得。在本技术的一些优选示例中，前述检测结果是通过高通量甲基化测序获得的。

31、在本技术的第五方面，本技术提出了一种尿路上皮癌发生风险的辅助诊断方法。根据本技术的实施例，该方法包括：获取生物样本中超甲基化差异甲基化区域的甲基化数据；基于所述甲基化数据，分析所述超甲基化差异甲基化区域的甲基化水平或状态；基于所述甲基化水平或状态，确定所述生物样本的尿路上皮癌发生风险，其中，所述超甲基化差异甲基化区域如本技术第一方面所示。

32、基于前述方法进行尿路上皮癌发生风险辅助诊断，能够有效提升尿路上皮癌诊断效率和诊断准确性，节省诊断时间和人工成本，适宜大规模筛查。

33、在本技术的一些示例中，前述生物样本选自组织或体液。前述的体液可以选自血液、唾液、组织或尿液等。在本技术的一些优选示例中，前述生物样本选自尿液样本或来自于尿液的核酸样本。基于尿液样本或来自尿液的核酸样本，避免了侵入性的内镜检查，能够有效减少受检者的身心负担，提高检测依从性。

34、在本技术的一些示例中，前述甲基化数据基于甲基化特异性pcr、数字pcr定量、荧光定量pcr、dna甲基化芯片、焦磷酸测序、高通量测序、三代测序、单分子测序或靶向dna甲基化测序获得。

35、在本技术的一些示例中，基于所述甲基化数据，分析所述超甲基化差异甲基化区域的甲基化状态，包括但不限于对比所述甲基化标志物的ct值、对比△ct值(标志物与内参基因的ct值差值)、对比溶解曲线、对比序列信息、计算甲基化率或与标准品对比结果等。

36、在本技术的一些示例中，还可以通过设定阳性判断值/阈值，或通过判断甲基化状态来进行尿路上皮癌发生风险辅助诊断。

37、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。