一种基于DNA甲基化的体外DNA复制调控系统

本发明涉及生物，具体涉及一种基于dna甲基化状态调控体外dna复制轮数的系统、方法及其用途，尤其适用于体外可控dna复制、等温dna扩增、dna测序文库制备以及人工细胞构建。

背景技术：

1、dna复制是遗传信息传递的核心分子过程。在体外实现dna的精准、可控复制，是合成生物学功能元件构建、人工细胞合成及dna甲基化检测技术开发的重要基础，也是当前体外分子操作技术领域的核心需求之一。

2、现有体外dna复制调控技术仍存在明显局限，难以满足多场景应用需求：barthel等人（acs synthetic biology, 2025）报道的ttcdr系统，利用tetr阻遏蛋白在转录/翻译层面调控phi29 dna聚合酶的合成，属于间接调控模式；一旦聚合酶已完成表达并启动复制，该方案无法对正在进行的复制过程实施即时阻断，也无法对dna复制的次数进行精准调控。kanoh等人（scientific reports, 2025）在体外重构了包含seqa、dam、dnaa、hda等多种调控蛋白的染色体复制调控体系（rcr系统），虽证实seqa-dam模块可阻断半甲基化dna的再复制，但其体系组成复杂（至少包含26种蛋白质），且调控靶点为oric起始复合物，仅适用于携带特定oric序列的dna模板，模板通用性差。尤为重要的是，kanoh等人的rcr系统中，seqa-dam模块仅能实现一次性的被动阻断（使复制停止于第一轮），其并未公开通过交替控制中断与重启来主动设定并精确控制复制轮数n的技术方案，也未公开将该模块从oric依赖型复杂体系中独立出来，用于不含oric序列的任意dna模板可控复制的技术启示。

3、因此，本领域亟需开发一种体系组成精简、可对复制延伸过程实现即时中断与重启、能够精确控制复制次数，且适用于任意不含有oric序列的双链dna模板的新型体外dna复制调控系统，以填补当前技术空白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有体外dna复制调控技术存在的上述不足，提供一种体系精简、能够在dna模板水平对复制延伸过程实施即时中断与重启、并可精确控制dna完整复制轮数的基于dna甲基化的体外dna复制调控系统、方法及用途。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于dna甲基化的体外dna复制调控系统，包括：

4、（a）dna聚合酶，其能对双链甲基化dna进行复制并生成半甲基化dna；

5、（b）半甲基化dna结合蛋白，其能特异性结合所述半甲基化dna，并阻止其与所述dna聚合酶结合，中断复制；

6、（c）dna甲基转移酶及其甲基供体，所述dna甲基转移酶能在所述甲基供体存在下催化所述半甲基化dna转化为双链甲基化dna，重启复制；

7、其中，所述半甲基化dna结合蛋白与所述dna甲基转移酶被配置为能够以可控的时序交替地作用于所述半甲基化dna，从而通过交替重复所述中断与重启，将同一dna模板的复制轮数精确控制为所需的正整数n。

8、结合本发明的第一方面，一些实施方式中，所述dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。

9、结合本发明的第一方面，一些实施方式中，所述半甲基化dna结合蛋白为seqa蛋白或与其具有90%以上序列同一性的同源蛋白，所述dna甲基转移酶为dam甲基转移酶，所述半甲基化dna包含gatc序列，所述seqa蛋白以二聚体或多聚体形式结合半甲基化gatc位点。

10、结合本发明的第一方面，一些实施方式中，所述半甲基化dna结合蛋白为vsr蛋白或其功能同源蛋白，所述半甲基化dna包含ccagg或其互补序列cctgg序列，所述vsr蛋白特异性结合半甲基化ccagg或其互补序列cctgg位点；所述dna甲基转移酶为dcm甲基转移酶。

11、结合本发明的第一方面，一些实施方式中，所述seqa蛋白的氨基酸序列如seq idno:1所示。

12、结合本发明的第一方面，一些实施方式中，所述甲基供体为s-腺苷甲硫氨酸；所述系统还包括能够与dna结合后产生荧光信号增强的荧光染料，用于实时监测复制过程中dna量的动态变化。

13、第二方面，本发明提供一种体外dna复制轮数的控制方法，包括以下步骤：

14、复制步骤：利用dna聚合酶对双链甲基化dna进行复制，生成半甲基化dna；

15、中断步骤：使半甲基化dna结合蛋白特异性结合所述半甲基化dna，以阻止所述半甲基化dna与所述dna聚合酶结合，中断复制；

16、重启步骤：使dna甲基转移酶在甲基供体存在下催化所述半甲基化dna转化为双链甲基化dna，启动新一轮复制；

17、交替重复所述中断步骤和重启步骤n次，将同一dna模板的复制轮数精确控制为n，n为正整数。

18、第三方面，本发明提供第一方面所述的系统在体外dna复制轮数控制或等温dna扩增中的用途。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、（1）本发明直接在dna模板水平进行调控，复制产生半甲基化dna后，半甲基化dna结合蛋白可识别并结合半甲基化dna，物理性阻断dna聚合酶与半甲基化dna的结合，对正在进行的复制过程实现即时中断，避免了间接调控（如调控聚合酶合成）无法阻断已起始复制的问题。

21、（2）通过半甲基化dna结合蛋白的中断作用与dna甲基转移酶的重启作用交替进行，可在预设时间点中断复制并在需要时重新启动，实现dna完整复制次数的精确控制，避免了现有体系一旦启动即持续复制至底物耗尽的缺陷。

22、（3）本发明体系组成精简，仅需三种核心功能性蛋白（dna聚合酶、半甲基化dna结合蛋白、dna甲基转移酶）和一种辅底物（甲基供体）即可实现受控复制，组分数量远少于现有rcr系统（至少26种蛋白质），适用于合成细胞等需要精简系统的应用场景。

23、（4）本发明直接调控dna聚合酶与dna的结合状态，不依赖oric起始复合物或dnaa等起点依赖型复制调控蛋白，也不含oric序列及大肠杆菌染色体复制周期所需的dnaa、dnab、dna聚合酶ⅲ等组分，适用于任意不含有oric序列的双链dna模板，模板通用性好。

24、（5）本发明体系可加入yo-pro-1等荧光染料，通过荧光信号变化实时监测复制进程中dna量的动态变化，为判断中断与重启时机提供参考。

1.一种基于dna甲基化的体外dna复制调控系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述半甲基化dna结合蛋白为seqa蛋白或与其具有90%以上序列同一性的同源蛋白，所述dna甲基转移酶为dam甲基转移酶，所述半甲基化dna包含gatc序列，所述seqa蛋白以二聚体或多聚体形式结合半甲基化gatc位点。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述半甲基化dna结合蛋白为vsr蛋白或其功能同源蛋白，所述dna甲基转移酶为dcm甲基转移酶。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述半甲基化dna包含ccagg或其互补序列cctgg序列，所述vsr蛋白特异性结合半甲基化ccagg或其互补序列cctgg位点。

6.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述seqa蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述甲基供体为s-腺苷甲硫氨酸。

8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还包括能够与dna结合后产生荧光信号增强的荧光染料，用于实时监测复制过程中dna量的动态变化。

9.一种体外dna复制轮数的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.权利要求1至8中任一项所述的系统在体外dna复制轮数控制或等温dna扩增中的用途。