一种用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的引物组、试剂盒、应用及鉴别方法与流程

本发明涉及生物化学，具体涉及一种用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的引物组、试剂盒、应用及鉴别方法。

背景技术：

1、杧果（mangifera indica l.）为漆树科（anacardiaceae）杧果属栽培种，是重要的热带果树，种质资源的真实性直接关系到种质资源收集保存、核心种质构建、杂交组合配置、亲本选择及新品种选育的可靠性。扁桃（mangifera persiciforma c. y. wu et t. l.ming）与杧果同属漆树科杧果属，是杧果的近缘种，在我国南方作为园林树种、近缘种质或嫁接相关材料均可能被收集和保存。

2、杧果与扁桃均隶属于杧果属。在种质资源考察、异地引种、苗木交换及种质圃管护过程中，育种工作者往往需要在植株尚未开花结果的幼龄阶段完成物种的初步判别。该时期可用于鉴定的形态特征仅局限于株型、枝条、叶片等营养器官性状。而苗龄、光照条件、水肥管理、修剪方式与植株生长势均会对表型特征产生修饰效应；加之杧果属近缘物种在叶形、叶色及枝叶形态上存在较高的表型趋同，依靠单次肉眼观察开展鉴定极易受个人经验与材料生长状态干扰，进而造成种质甄别与资源收集过程中的误判。

3、一旦将材料以错误名称进入种质圃或育种流程，错误会沿着资源编号、采穗、繁殖、亲本选择、表型评价和分子分析继续传递。若等待开花结果后再纠正，不仅延长鉴定周期，还可能造成圃地、人工和育种世代成本浪费。标签脱落、登记转录错误或交换材料来源信息不完整时，也缺乏一种针对杧果与扁桃的简明复核手段。

4、为突破形态鉴定的局限，现有大量研究证实叶绿体基因片段、特异性 snp 位点可作为木本植物近缘物种快速鉴别的有效分子工具，已有不少针对蔷薇科、五加科等果树树种的鉴别专利可供参考。例如专利cn108998567a开发叶绿体trnk-uuu区段标记，用于区分蔷薇科的长柄扁桃（prunus pedunculata pall.）、蒙古扁桃（prunus mongolica maxim.）和榆叶梅（prunus triloba lindl.）；专利cn120082670a依托叶绿体snp位点结合焦磷酸测序技术，实现西洋参的真伪鉴别。值得注意的是，上述专利针对的均为蔷薇科或五加科物种，目前尚未开发出适用于漆树科杧果属，可精准区分栽培杧果与扁桃的特异性分子标记与鉴定方法，缺乏可直接应用的快速甄别体系。

5、形态学鉴定具有成本低和现场直观的优点，但对无果期材料的判定能力受限。ssr、mnp、全基因组snp或完整分子身份证可用于种内品种鉴定和遗传多样性分析，但通常需要较多位点、专用分型平台或较复杂的数据分析。通用dna条形码和完整叶绿体基因组分析能够提供物种关系信息，但不必然直接形成面向特定两种材料、可按固定pcr条件实施的少位点鉴别流程。基于此，提出本发明一种用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的引物组、试剂盒、应用及鉴别方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明公开一种用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的引物组、试剂盒、应用及鉴别方法。旨在解决杧果与扁桃在缺少花、果关键分类性状的苗期、无果期或营养生长期仅凭表观形态难以稳定区分杧果与其近缘种扁桃的问题，用于种质资源入圃核验、种质圃标签或档案纠错、材料交换后的身份复核、育种亲本与嫁接材料核验，以及杧果种质来源记录中的物种身份辅助确认。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明第一方面提供了用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的引物组，所述引物组选自snp-1、snp-2和snp-3三组引物对，其中，snp-1引物对包括正向引物seq id no.1和反向引物seq id no.2，snp-2引物对包括正向引物seq id no.3和反向引物seq id no.4，snp-3引物对包括正向引物seq id no.5和反向引物seq id no.6。

4、

5、优选地，所述snp-1引物对的位点，位于杧果mangifera indica l.参考叶绿体基因组的trns-uga-psbc基因间区；

6、所述snp-2引物对对应的位点位于杧果mangifera indica l.参考叶绿体基因组的rpl36-rps8基因间区；

7、所述snp-3引物对对应的位点位于杧果mangifera indica l.参考叶绿体基因组的ycf2基因上。

8、本发明第二方面提供了一种用于鉴别杧果与扁桃的叶绿体基因的试剂盒，所述试剂盒包含以上所述引物组中至少一对引物。

9、优选地，所述试剂盒还含有扩增引物组的pcr试剂，pcr反应体系为：为50μl的混合体系，包括25.0μl的2×pcr mix，1μl浓度为10μm的正向引物，1μl浓度为10μm的反向引物，1μl的模板dna和22.0μl的ddh2o。

10、本发明第三方面提供了以上所述的引物组或以上所述的试剂盒在鉴别杧果与扁桃品种中的应用。

11、本发明第四方面提供了采用以上所述的引物组或以上所述的试剂盒鉴别杧果与扁桃品种的方法，包括以下步骤：

12、（1）获取叶片样品；

13、（2）提取叶片样品的dna；

14、（3）对所述dna进行pcr扩增；

15、（4）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

16、（5）将扩增产物进行测序；

17、（6）将待测序列与参照型和验证型进行比对，获得初步判定结果；

18、（7）根据初步判定结果进行多组对比，获得联合复核结果。

19、优选地，步骤（3）中，采用snp-1引物对、snp-2引物对和snp-3引物对中任意一对进行扩增；步骤（7）中，多组比对包括：另外采用snp-1引物对、snp-2引物对和snp-3引物对中任意一对或两对组合进行扩增和测序验证，且与步骤（3）所采用的引物对不同，获得联合复核结果。

20、优选地，采用snp-1引物进行pcr扩增的程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s 33个循环，52℃的退火30s 33个循环，72℃延伸30s 33个循环，72℃终延伸5min，4℃保存；

21、采用snp-2引物对和snp-3引物进行pcr扩增的程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s 33个循环，58℃的退火30s 33个循环，72℃延伸30s 33个循环，72℃终延伸5min，4℃保存。

22、优选地，步骤（4）或步骤（7）中，pcr扩增的产物在110 v条件下电泳40 min，目的条带位于250-500 bp范围。

23、优选地，判定规则如下：

24、（1）杧果型：所检测目标区段的有效序列与经验证的杧果参照型一致；联合检测时，各有效标记均支持杧果型；

25、（2）扁桃型：所检测目标区段的有效序列与经验证的扁桃参照型一致；联合检测时，各有效标记均支持扁桃型；

26、（3）待复核：扩增失败、峰图质量不足、标记间结论冲突、出现未记录序列型，或样品可能为混合材料。

27、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

28、（1）鉴别阶段显著提前：本发明通过提取叶片的叶绿体，采用三组pcr引物对叶绿体目标区段位点进行扩增，结合多态性目标区段和测序实现杧果和扁桃的品种鉴别，使鉴别窗口从传统的花果期提前到苗期、幼树期或非结果季节，无需等待花果性状形成即可完成物种身份核验，从根本上摆脱了对物候期的依赖，实现种质资源早期快速核验。

29、（2）靶向性强：本发明针对杧果与扁桃这一特定近缘种对设置目标区段和引物对，避免了通用dna条形码在种间分辨率不足时需反复筛选合适标记的繁琐过程，显著提高了检测的准确性和效率。

30、（3）取样微量：本发明以少量叶片组织提取dna为检测对象，无需破坏整株材料或采集果实，对种质资源、幼树及尚未进入生殖期的材料，最大限度降低对活体资源的损伤，保留了待检材料的完整性，符合种质资源可持续利用原则。

31、（4）流程可复核：本发明构建包含三组引物标记可单独用于初筛，也可组合使用进行交叉验证；对关键材料采用“多标记一致性”判读策略，显著提升鉴定结论的可靠性与可追溯性，满足科研与监管对数据可复核的要求。

32、（5）便于标准化操作：本发明采用固定引物序列、pcr反应体系、退火条件、测序及判读标准，整套流程具有良好的可重复性和可推广性，适合编制为种质圃入圃核验标准操作规程（sop），便于不同实验室间结果互认。

33、（6）降低种质管理风险：本发明可在早期及时发现扁桃混入杧果种质资源圃的情况，纠正标签错误或档案冲突，减少错误材料对育种选择、性状评价和遗传多样性分析数据的连锁影响，从源头上避免错误种质进入育种试验、性状评价及品种审定流程，显著降低因材料误用导致的科研数据失真、育种周期延长及经济损失，保障种质资源管理的准确性和可靠性。

34、（7）支持来源核验：本发明在物种层面为材料来源记录提供分子水平的独立证据，可与形态学鉴定、栽培档案相互印证；本发明方法用于杧果与扁桃种间鉴别，不替代品种级核基因组指纹分析（如ssr、snp等），为后续精细化的品种鉴定和亲缘关系分析预留了技术衔接空间。

35、（8）成本可控：本发明基于常规pcr扩增与sanger等测序平台，无需高通量测序设备或复杂生物信息学分析流程，检测成本较低，适合在种质资源圃、基层农技推广机构及区域性检测中心推广应用。