基于RanBP1的基因治疗在阿尔茨海默病神经再生中的应用的制作方法

本申请涉及基因治疗及神经退行性疾病领域。具体而言，本申请涉及一种包含编码ran结合蛋白1 (ranbp1)的核苷酸序列的表达载体及其在制备用于促进神经退行性疾病患者神经元再生的药物中的用途。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是影响范围最广的神经退行性疾病，其核心症状为记忆丢失和认知能力下降，导致这些症状的主要原因来自于神经元的退行性死亡。在健康人大脑的海马区中，成体神经元再生是在衰老过程中维持认知能力的重要机制；然而在ad患者中，这些成体再生神经元大量死亡，直接导致了认知能力的恶化。

2、目前针对ad的传统治疗手段存在诸多不足：

3、1. 神经递质补充疗法。该疗法包括使用胆碱酯酶抑制剂(cheis)多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏等，以及谷氨酸受体拮抗剂美金刚等，但这一类药物并不能延缓ad病理进程，也不能逆转神经元退行性死亡。

4、2. 单克隆抗体(清除aβ蛋白)疗法。虽然抗aβ抗体可以一定程度上延缓疾病进程，但其费用高昂、对认知能力的改善作用也非常有限，且伴随有淀粉样蛋白相关影像异常(aria)等严重的毒副作用。单克隆抗体疗法虽然可以有效清除细胞外的aβ沉积，但其同样无法让受损神经元恢复功能。

5、3. 补充神经营养因子(如bdnf)疗法。神经营养因子比如脑源神经营养因子bdnf和神经生长因子ngf补充可以促进海马区中神经前体细胞分化以形成新的神经元。然而，ad患者大脑内的神经前体细胞自身已经发生大量死亡，导致补充神经营养因子的方法只能部分改善病症，而且长期补充神经营养因子具有显著的促癫痫副作用。

6、因此，开发用于预防、改善或治疗神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的药物具有重要的生物学和医学价值。

技术实现思路

1、本申请开发了一种在大脑海马区过表达的表达载体，用于在体内特异性地过表达ran结合蛋白1 (ranbp1)，以实现对神经退性疾病的干预和治疗，从而为阿尔茨海默病的预防与治疗提供新的策略。

2、第一方面，本申请提供了表达载体，其包含编码ran结合蛋白1 (ranbp1)的核苷酸序列。

3、第二方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的表达载体和药学上可接受的成分。

4、第三方面，本申请提供了第一方面所述的表达载体或第二方面所述的药物组合物在制备用于以下中的一种或多种的药物中的用途：

5、1) 预防或减少受试者的神经元细胞质内tar dna结合蛋白43 (tdp-43)的积聚；

6、2) 预防或减轻受试者的神经元中tdp-43对神经元的毒性；

7、3) 预防或减少受试者的神经元损伤；

8、4) 预防或减少受试者的神经元死亡；

9、5) 促进受试者的神经元再生；

10、6) 增加受试者的神经元树突的分枝数量；

11、7) 增加受试者的神经元树突的分枝长度；和

12、8) 预防、改善或治疗受试者的神经退行性疾病。

13、本申请通过在大脑海马区齿状回结构特异性表达编码ranbp1的基因，产生了以下至少一种有益效果，从而用于预防、改善或治疗受试者的神经退行性疾病：

14、1)减少了受试者成体再生神经元细胞质中tdp-43的积聚；

15、2)减轻了受试者成体再生神经元细胞质中tdp-43对成体再生神经元的毒性；

16、3)增加受试者成体再生神经元树突的分枝数量和长度；

17、4)减少了受试者成体再生神经元的损伤；

18、5)减少了受试者成体再生神经元的死亡；

19、6)促进了受试者成体再生神经元的再生；

20、7)单次原位注射即可维持较长时间的外源基因水平，极大减少了给药频率；

21、8)采用脑部局部立体定位原位注射，直接绕过了传统外周给药面临的血脑屏障阻碍；

22、9)结合海马区齿状回结构的天然屏障包裹作用，外源基因被限制性表达在局部靶区内，这使得aav载体的使用量实现指数级下降，降低了制备成本；

23、10)避免了过量aav载体累积在肝脏中造成的肝脏毒性；

24、11)  避免了对正常神经元的影响；和

25、12)规避了神经营养因子所导致的神经元过度兴奋和癫痫风险。

1.表达载体，其包含编码ran结合蛋白1 (ranbp1)的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述编码ranbp1的核苷酸序列包含与seq idno: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的核苷酸序列，或者由与seq id no: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的核苷酸序列组成；优选地，所述编码ranbp1的核苷酸序列由seq id no: 1所示的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其中所述编码ranbp1的核苷酸序列可操作地连接至哺乳动物细胞通用型启动子；优选地，所述哺乳动物细胞通用型启动子为cag启动子、cmv启动子或ef1a启动子；更优选地，所述哺乳动物细胞通用型启动子为cag启动子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体选自以下中的任一种：腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述腺相关病毒载体为血清型rh10、2、1、5、6、8或9腺相关病毒载体；优选地，所述腺相关病毒载体为血清型rh10腺相关病毒载体。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的表达载体，其还包含以下中的至少一种：编码绿色荧光标记蛋白的核苷酸序列、转录后调控元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre))、反向末端重复序列(itr)和polya核苷酸序列。

7.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的表达载体和药学上可接受的成分。

8.权利要求1-6中任一项所述的表达载体或权利要求7所述的药物组合物在制备用于以下中的一种或多种的药物中的用途：

9.根据权利要求8所述的用途，其中

10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症、原发性侧索硬化、脊髓小脑性共济失调、散发性成年起病小脑变性或亨廷顿病。