一种基因工程化马克斯克鲁维酵母、构建方法与应用与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种基因工程化马克斯克鲁维酵母、构建方法与应用。

背景技术：

1、类胡萝卜素（carotenoids）是一类天然存在的脂溶性黄色、橙红色或红色色素，由植物、藻类以及部分细菌和真菌合成，因其具有出色的抗氧化性、着色性和生物活性，在食品与饲料、医药、化妆品等领域得到了广泛应用。由于其重要的应用价值，近年来基于代谢工程和合成生物学技术生产此类色素引起了广泛关注，但实现高效、低成本的生产仍面临挑战。类胡萝卜素是植物进行光合作用的重要色素，根据化学结构特性和所含官能团的差异，可分为胡萝卜素和叶黄素，其中胡萝卜素包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、番茄红素等烃类化合物；叶黄素包括玉米黄质、虾青素、紫黄质等含氧烃类化合物；经氧化裂解产生的类胡萝卜素（如藏红花酸、藏红花素、β-紫罗兰酮、视黄醇等）则归为脱辅基类胡萝卜素。其中藏红花素为水溶性类胡萝卜素，相较于其他常见的脂溶性色素更易被吸收，在抗氧化、抗炎和神经保护作用方面有更好的功效。

2、目前类胡萝卜素主要通过植物提取或化学合成得到，但植物提取存在原料供应不稳定、使用有毒溶剂等问题，而化学合成会加剧环境恶化，成本也较高。相比之下，微生物合成提供了一种更具前景的替代方案。借助合成生物学技术，可在工程化微生物宿主中实现番茄红素及其衍生物的高效生产。与传统方式相比，微生物合成显著降低了对天然植物资源的依赖，可在生物反应器中实现连续稳定的生产，降低成本，减少环境污染，契合绿色化学原则及可持续的发展方向。

3、马克斯克鲁维酵母（

kluyveromyces marxianus）作为一种非常规酵母，是一种有前景的生产异源蛋白的细胞工厂，相对于传统的酿酒酵母而言，它是crabtree阴性酵母，不进行有氧乙醇发酵，可以避免乙醇在有氧条件下形成有毒的副产品。同时在高温（>40℃）条件下仍能快速生长，在工业生产中能有效降低冷却生物反应器的成本并降低污染风险。此外，马克斯克鲁维酵母还具有利用乳糖和菊粉等多种糖类的能力，生产菊粉酶、β-半乳糖苷酶等高价值的酶及乙醇、乳酸、脂肪酸等化工产品。因其食品安全地位、遗传背景清晰、合成生物学工具丰富等优势被视为理想的异源表达宿主。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基因工程化马克斯克鲁维酵母、构建方法与应用。

2、一种基因工程化马克斯克鲁维酵母的构建方法，是将经过密码子优化后的外源基因thmg基因、y215crtby基因整合至出发菌株的adh2位点，将经过密码子优化后的外源基因prcrte基因、y215crti基因整合至出发菌株的gpd1位点。

3、外源基因均根据

kluyveromyces marxianus进行密码子优化，所述thmg基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述y215crtby基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述prcrte基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，y215crti基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。所述thmg基因原始来源于酿酒酵母，crtby基因和crti基因原始来源于红酵母，密码子优化后分别命名为y215crtby基因和y215crti基因，crte基因原始来源于红发夫酵母，密码子优化后命名为prcrte基因。

4、所述的出发菌株为马克斯克鲁维酵母（

kluyveromyces marxianus）nbrc1777。

5、由本发明的构建方法得到的马克斯克鲁维酵母（

kluyveromyces marxianus）基因工程菌y215l，于2026年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no:m2026966，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

6、本发明提供的基因工程菌y215l在发酵生产番茄红素中的应用。

7、进一步地，在产天然色素时，基因工程菌y215l的发酵培养基为：葡萄糖80 g/l、甘油10 g/l、酵母粉5 g/l、磷酸二氢钾0.8 g/l、七水硫酸镁0.41 g/l、二水氯化钙0.66 g/l。发酵条件为：先在42℃、200 rpm下发酵12 h，然后在30℃、200 rpm下发酵108 h。需要说明的是，本发明基因工程菌y215l的发酵培养基和发酵条件可以根据需要进一步优化。

8、本发明还提供了基因工程菌y215l在制备促进成纤维细胞增殖的产品中的应用，在制备清除自由基的产品中的应用，在制备具有抗光老化作用的产品中的应用，在制备促进成纤维细胞ecm基质分泌能力和/或促进成纤维细胞抗衰老相关mrna表达的产品中的应用。具体地，其能有效促进成纤维细胞i型胶原的mrna表达，有效促进成纤维细胞fn1的mrna表达，显著促进成纤维细胞cd44的mrna表达。

9、所述产品是以基因工程菌y215l的发酵产物菌体为原料制备。所述的产品的类型不限于化妆品。

10、本发明优点在于：

11、本发明提供了一种新的应用于马克斯克鲁维酵母的基因改造方法，通过表达外源的产色素基因，构建得到的菌株y215l能够高效生产天然色素番茄红素。基因工程菌y215l能促进成纤维细胞增殖，清除自由基，具有抗光老化、抗氧化作用，促进成纤维细胞ecm基质分泌能力，促进成纤维细胞抗衰老相关mrna表达，具有显著的工业应用价值。

1.一种基因工程化马克斯克鲁维酵母的构建方法，其特征在于，是将经过密码子优化后的外源基因thmg基因、y215crtby基因整合至出发菌株的adh2位点，将经过密码子优化后的外源基因prcrte基因、y215crti基因整合至出发菌株的gpd1位点；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的出发菌株为马克斯克鲁维酵母（kluyveromyces marxianus）nbrc1777。

3.一株根据权利要求1所述的构建方法得到的马克斯克鲁维酵母（kluyveromyces marxianus）基因工程菌y215l，所述基因工程菌y215l于2026年5月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no: m2026966，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

4.权利要求3所述的基因工程菌y215l在发酵生产番茄红素中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌y215l的发酵培养基为：葡萄糖80 g/l、甘油10 g/l、酵母粉5 g/l、磷酸二氢钾0.8 g/l、七水硫酸镁0.41 g/l、二水氯化钙0.66 g/l。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌y215l的发酵条件为：先在42℃、200 rpm下发酵12 h，然后在30℃、200 rpm下发酵108 h。

7.权利要求3所述的基因工程菌y215l在制备促进成纤维细胞增殖的产品中的应用。

8.权利要求3所述的基因工程菌y215l在制备清除自由基的产品、在制备具有抗光老化作用的产品中的应用。

9.权利要求3所述的基因工程菌y215l在制备促进成纤维细胞ecm基质分泌能力和/或促进成纤维细胞抗衰老相关mrna表达的产品中的应用。

10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述产品是以基因工程菌y215l的发酵产物菌体为原料制备。