一种犬心丝虫重组蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程，具体涉及一种犬心丝虫重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、犬心丝虫病（canine dirofilaria immitis）是经蚊虫叮咬所传播之血液寄生虫症，可感染任何年龄的犬只，于猫和人类身上亦有发现。犬心丝虫的中间寄主为中华按蚊、白纹伊蚊、淡色库蚊等多种蚊，犬类由于被含有感染性幼虫的蚊叮咬而遭感染。成虫白色长线状（雄虫15cm、雌虫可达30cm），定居在右心室、肺动脉；大量虫体堵塞血流，造成右心衰竭、肺动脉高压。成虫在犬体内可存活5～7年。

2、患犬可发生慢性心内膜炎，心脏肥大及右心室扩张，严重时因静脉淤血导致腹水和肝肿大等病变。患犬表现为咳嗽，心悸亢进，脉细而弱，心内有杂音，腹围增大，呼吸困难。后期贫血增进，逐渐消瘦衰弱至死。

3、犬心丝虫病检测免疫学方法主要有直接凝集试验（dat）、间接免疫荧光抗体实验（ifat）、酶联免疫吸附法（elisa）和蛋白印迹等。直接凝集试验虽然经济、操作简便，但其特异性和敏感性都不够理想。另外还需要孵育以及制备倍比稀释血清，使其不适用于进行大批量样本检测。间接免疫荧光方法可用于流行病学调查、临床诊断以及治疗后效果评价。但它需要操作人员技术熟练和昂贵的设备，不适合基层推广应用。酶联免疫吸附试验和蛋白印迹法具有高敏感性和特异性，但其实验条件要求高，操作复杂，仅适用于实验室科研工作，不能用于基层推广应用。

4、分子生物学方法有pcr和qrt-pcr等，特异性和敏感性都较好，但仍存在一些局限，如需要热循环仪和优化实验条件，产物检测繁琐，需要专业的人员进行操作，不利于现场使用。

技术实现思路

1、为了克服现有检测方法对设备要求高、检测时间长、不适合用于常规检测的缺点，本发明提供了一种犬心丝虫重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白用于胶体金检测试剂条的制备，标记技术敏感性高、特异性好、稳定性强、操作简便，适合作为犬心丝虫的常规检测手段。

2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：

3、本技术第一方面提供一种犬心丝虫重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no. 5所示，在本技术的一些实施方案中，犬心丝虫重组蛋白采用截短的tdit33和截短的tsol这两个蛋白进行融合表达，利用由此得到的融合蛋白进行检测，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。

4、在本技术中，为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mrna有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。

5、本发明的第二方面提供了一种编码第一方面所述的犬心丝虫重组蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no. 6所示。

6、本技术第三方面提供一种表达载体，包括本技术第二方面任一所述的基因。

7、在本技术的一些实施方案中，所述表达载体为pet32a，其具有氨苄青霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(his)标签。

8、本技术的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本技术第三方面所述的表达载体。

9、进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

10、在本技术的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为bl21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。

11、本技术的第五方面提供一种制备本技术第一方面任一所述重组蛋白的方法，包括本技术第三方面相应宿主细胞进行蛋白表达的步骤。

12、进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

13、在本技术的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为bl21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。

14、在本技术的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：

15、s1、用含50μg/ml氨苄青霉素的lb培养基37℃培养所述大肠杆菌，

16、s2、当大肠杆菌培养液od600至0.5-0.7时，用终浓度为1mm的iptg进行诱导表达，诱导条件为：28~32℃，转速150~250rpm，3~5h；

17、s3、诱导结束后离心、破菌取上清纯化、复性所表达的重组蛋白。

18、优选地，步骤s2中在大肠杆菌培养液od600至0.6时进行诱导。

19、优选地，为了使得重组蛋白更好地保持活性位点，本技术选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度在30℃，诱导转速为200rpm，诱导的iptg浓度为1mm，这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。

20、优选地，步骤s3中，所述破菌使用超声破碎的方式进行，条件为400w，超声3s，间隔6s。采用本技术的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。

21、在本技术中，重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本技术的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了his标签，一步纯化能够达到较高的纯度。

22、优选地，纯化中，过柱缓冲液中的上样缓冲液为50mm tris，0.15m nacl，ph 8.0，洗脱缓冲液为50mm tris，0.15m nacl，0.5m imidazole，ph 8.0；纯化结束后收集到的目的蛋白用10mm pbs，ph 7.4透析，每隔12h换一次透析液，共透析3次，透析后蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤除菌，用bradford法测定蛋白浓度，于-20℃保存备用。

23、本技术第六方面提供本技术第一方面任一所述的重组蛋白在制备用于检测犬心丝虫相关产品中的应用。

24、在本发明的一些实施方案中，用于检测犬心丝虫产品包括检测犬心丝虫的试剂盒、试剂、检测条、检测卡。

25、本技术第七方面提供一种用于检测犬心丝虫的试剂盒，包括本技术第一方面所述的重组蛋白。

26、在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中包含采用第一方面所述的重组蛋白制备得到的检测条或检测卡。

27、进一步地，所述试剂盒还包括鸡igy和羊抗鸡igy。

28、在本技术的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测犬心丝虫的抗体，进一步诊断犬心丝虫。

29、胶体金标记免疫分析法是近年来兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染且无需培训，与传统方法相比更为适合现场检测。与传统方法相比，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。

30、在本技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条/检测卡，所述检测条/检测卡的试剂方法如下:

31、（1）在三角烧瓶中加入1000ml超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10%氯金酸（sigma）1ml，再加入10%柠檬酸三钠溶液1ml，继续加热沸腾15min，然后冷却至室温。

32、（2）在冷却后的金水中加入0.2m k2co3调节至ph 8.0，加入重组抗原，搅拌15min后加入bsa溶液，再次搅拌30min后10000rpm离心20min，将沉淀用金标稀释液重悬。

33、（3）在金水中加入0.2m k2co3调节至ph7.0，加入鸡igy，搅拌15min后加入bsa溶液，再次搅拌30min后10000rpm离心20min，将沉淀用金标稀释液重悬；

34、（4）将第（2）和（3）步标记后的金溶液混合后浸泡玻璃纤维，冻干后得到金标垫；

35、（5）用点膜稀释液稀释分别将各稀释至0.5mg/ml，用相同稀释液稀释羊抗鸡igy多抗至1.0mg/ml，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜，其中点膜稀释液为10mm pbs，1%蔗糖，ph7.4；

36、（6）将以上金标垫、包被好的硝酸纤维素膜及滤纸、样品垫、卡壳等组装成胶体金检测试剂条/检测卡。

37、其中金标稀释液为20mm tris、0.5% bsa、0.1% tritonx-100、0.01% proclin300，ph 8.0溶液。

38、在使用时，滴加犬血液类样本至加样孔，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下:

39、①仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；

40、②有两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；

41、③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，应当更换新试纸条重新测试。

42、在本技术的一些实施方案中，所述生物样本为全血、血清或血浆，或任何其他可能包含犬心丝虫的抗体的体液。

43、本发明的有益效果

44、相对于现有技术，本技术具有以下有益效果：

45、本技术通过表达犬心丝虫tdit33(truncated-dit33)蛋白和/或tsol(truncated-sol)截短蛋白及截短蛋白tdit33-tsol融合蛋白，发现融合蛋白在检测犬心丝虫抗体时，具有较高的灵敏度和更好的特异性，进一步提高了检测的准确度。

46、本技术的重组蛋白在大肠杆菌表达系统中得到，具有生产周期短、产量高、成本低、特异性好的优点，并且重组蛋白上的his标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性。以本技术的重组融合蛋白，可以利用双抗原夹心金标法检测犬心丝虫的抗体，进一步诊断犬心丝虫。

47、本技术的试剂盒包括利用所述重组蛋白制备的胶体金试纸条，用于检测犬心丝虫的抗体，具有灵敏度、特异性强、准确度高的优点，并且操作简便，适合作为犬心丝虫病常规检测手段。