一种微流控检测装置及其应用

本发明属于病原菌检测，具体涉及一种微流控检测装置及其应用。

背景技术：

1、大肠杆菌（escherichia coli）是食源性疾病的主要致病菌之一，同时也是水质卫生监测的重要指示菌。因此，快速、准确地检测大肠杆菌对于食品安全监控、饮用水卫生检测以及临床感染诊断具有重要意义。

2、目前，大肠杆菌的常规检测方法主要包括培养计数法、聚合酶链式反应（pcr）法和酶联免疫吸附测定（elisa）法等，这些检测方法均存在明显的缺陷，具体如下：培养计数法是检测大肠杆菌的“金标准”，但其操作流程繁琐、耗时长，通常需要24h～48h才能获得检测结果，难以满足快速检测的需求；pcr法和elisa法虽然在一定程度上缩短了检测时间，但仍存在操作复杂、需要专业技术人员和昂贵仪器设备等局限，且样品的前处理过程较为繁琐，难以实现现场快速检测。

3、近年来，微流控芯片技术因其微型化、集成化和自动化等优势，在微生物检测领域得到了广泛关注。微流控芯片能够在微米尺度的通道内实现样品的操控和反应，具有试剂消耗少、反应速度快、易于集成等优点。已有研究人员尝试将微流控芯片应用于大肠杆菌的富集、分离和检测，例如：有文献报道了基于微流控芯片的大肠杆菌富集装置，通过通孔膜的设置实现水中大肠杆菌的快速富集；有文献报道了集成电解裂解模块的微流控生物芯片，实现了“样品进-结果出”的一体化设计。

4、然而，现有的大肠杆菌微流控检测技术仍存在以下不足：1）多数微流控检测芯片仅聚焦于检测环节，缺乏将细菌培养、菌体分离与产物检测整合于一体的全流程集成方案，检测过程仍需要在多个独立设备之间转移样品，不仅操作繁琐，而且还增加了污染风险；2）现有检测方法多依赖核酸扩增、抗体识别或荧光标记等复杂手段，对试剂和仪器的要求较高，检测成本相对昂贵；3）部分基于显色反应的检测方法虽然操作简便，但尚未与微流控培养-分离系统有效整合，难以实现从样品到结果的一站式检测。

5、因此，开发一种集培养、分离、检测于一体的微流控检测装置对于实现大肠杆菌的快速、简便、低成本检测具有十分重要的意义。

6、以上陈述仅仅是提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种微流控检测装置及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、一种微流控检测装置，其组成包括第一注射泵、第二注射泵、第一微流控芯片、加热平台、第三注射泵、微孔过滤头、第二微流控芯片和紫外-可见分光光度计，第一注射泵和第二注射泵通过管道与第一微流控芯片的入口连接，第一微流控芯片贴合在加热平台表面，第三注射泵通过管道与第二微流控芯片的入口连接，微孔过滤头通过管道与第一微流控芯片的出口连接，且通过管道与第二微流控芯片的入口连接，紫外-可见分光光度计通过管道与第二微流控芯片的出口连接。

4、优选地，所述第一微流控芯片具有蛇形通道，通道的宽度为200μm～500μm，通道的深度为100μm～300μm。蛇形通道的设计极大地增加了混合路径长度和比表面积，有助于利用分子扩散和流体混沌对流实现待测样品与培养基的快速均匀混合。

5、优选地，所述第一微流控芯片中的蛇形通道的组成包括y型汇流段和蛇形混合培养通道。

6、优选地，所述第一微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷（pdms）。

7、优选地，所述第一微流控芯片是由包括以下步骤的制备方法制成：采用光固化工艺制备微流控芯片模板，再浇注微流控芯片制备原料后进行固化，再用打孔器在相应位置打孔形成入口和出口，再进行氧等离子体清洗。

8、优选地，所述微流控芯片模板的材质为聚四氟乙烯（ptfe）。

9、优选地，所述微孔过滤头中的滤膜的孔径为0.22μm～0.45μm。微孔过滤头用于分离菌体和代谢产物（截留菌体，使含有代谢产物的滤液进入第二微流控芯片）。

10、优选地，所述微孔过滤头中的滤膜的材质为聚醚砜（pes）或混合纤维素酯（mce）。利用物理筛分原理，在背压作用下尺寸较大的大肠杆菌菌体（直径约0.5μm～1μm，长约2μm～6μm）被截留在滤膜表面，而分子量较小的细菌代谢产物（例如：色氨酸酶分解色氨酸产生的吲哚类物质）则顺利透过滤膜进入下游反应芯片，进而实现了“菌体去除”与“产物富集”的在线分离，有效消除了活菌对后续光学检测的散射干扰。

11、优选地，所述第二微流控芯片具有蛇形通道，通道的宽度为200μm～500μm，通道的深度为100μm～300μm。蛇形通道的设计保证了足够的反应停留时间，确保显色反应充分完全。

12、优选地，所述第二微流控芯片中的蛇形通道的组成包括y型汇流段和蛇形反应通道。

13、优选地，所述第二微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷。

14、优选地，所述第二微流控芯片是由包括以下步骤的制备方法制成：采用光固化工艺制备微流控芯片模板，再浇注微流控芯片制备原料后进行固化，再用打孔器在相应位置打孔形成入口和出口，再进行氧等离子体清洗。

15、优选地，所述微流控芯片模板的材质为聚四氟乙烯（ptfe）。

16、优选地，所述管道的材质为硅橡胶。

17、优选地，所述管道的内径为0.1mm～0.5mm。

18、一种检测大肠杆菌的方法，采用的检测装置为上述微流控检测装置，具体包括以下步骤：

19、1）将标准大肠杆菌梯度浓度溶液和蛋白胨水培养基分别通过第一注射泵和第二注射泵送入第一微流控芯片，并开启加热平台进行孵育，得到培养后的混浊菌液；

20、2）将培养后的混浊菌液送入微孔过滤头进行过滤，得到含代谢产物的滤液；

21、3）将含代谢产物的滤液送入第二微流控芯片，并通过第三注射泵将显色剂溶液送入第二微流控芯片进行显色反应，得到显色反应液；

22、4）将显色反应液送入紫外-可见分光光度计测定吸光度值，再建立吸光度值-大肠杆菌浓度标准曲线；

23、5）将待测样品溶液进行步骤1）～4）的操作测定吸光度值，再根据吸光度值-大肠杆菌浓度标准曲线得到待测样品的大肠杆菌浓度。

24、优选地，步骤1）所述标准大肠杆菌梯度浓度溶液、蛋白胨水培养基的流速比为1:5～10。

25、优选地，步骤1）所述标准大肠杆菌梯度浓度溶液的流速为10μl/min～100μl/min。

26、优选地，步骤1）所述蛋白胨水培养基的流速为10μl/min～100μl/min。

27、优选地，步骤1）所述孵育在温度为36.5℃～37.5℃的条件下进行，孵育时间为20min～30min。

28、优选地，步骤3）所述显色剂溶液中的显色剂为对二甲氨基苯甲醛。

29、优选地，步骤3）所述显色剂溶液的浓度为350mm～450mm。

30、优选地，步骤4）所述显色反应液的检测波长为540nm～570nm。

31、一种如上所述的微流控检测装置用于检测食品或环境中的大肠杆菌的应用。

32、本发明的有益效果是：本发明的微流控检测装置集细菌培养、菌体分离与显色检测三个环节于一体，实现了“样本进-结果出”的全封闭、自动化在线检测，有效避免了多设备间样品转移带来的繁琐操作和交叉污染风险，适合用于大肠杆菌的快速、简便、低成本检测。

33、具体而言：

34、1）高度集成化与自动化（一站式检测）：本发明将细菌培养、菌体分离与显色检测三个环节集成于同一微流控检测装置内，通过三个注射泵的协同和微孔过滤头的在线分离实现了“样本进-结果出”的全封闭、自动化在线检测，有效避免了多设备间样品转移带来的繁琐操作和交叉污染风险；

35、2）检测时间显著缩短：本发明依托微流控芯片极大的比表面积和微米级通道的快速传质特性，结合优化的培养温度（37℃）和精准的培养时间（20min），可以将检测周期缩短至30min以内，极大地提升了检测时效，适于现场快速筛查；

36、3）成本低、操作简单：本发明摆脱了对昂贵核酸扩增仪器（pcr）和抗体的依赖，仅需要采用注射泵、加热平台、微孔过滤头和紫外-可见分光光度计这些常规仪器，且采用的试剂为廉价的蛋白胨水培养基和二甲基氨基苯甲醛，大幅降低了单次检测的成本和门槛，对基层检测机构及资源有限地区极为友好；

37、4）灵敏度高、线性范围宽：本发明通过精确控制反应条件，建立的线性模型（y=0.1588x-0.3473，x为log ce.coli，相关系数r2=0.98）覆盖了多个数量级，不仅灵敏度高，而且定量准确，能够满足复杂样品中不同浓度大肠杆菌的定量分析需求。