一种用于鉴定团头鲂雌雄性别的引物对、试剂盒及其应用、方法

本发明属于分子生物学，具体地涉及一种用于鉴定团头鲂雌雄性别的引物对、试剂盒及其应用、方法。

背景技术：

1、团头鲂 (megalobrama amblycephala) 属鲤形目，又称武昌鱼，其肉质鲜美且成活率高，是我国特有的草食性经济鱼类，全国每年的养殖产量约80万吨，是主要的淡水养殖品种之一。但是近年来，由于过度捕捞以及环境污染等问题，团头鲂天然种质资源遭到了破坏，种群数量锐减。获取团头鲂性别信息，对种群资源保护、选种保种、增养殖和科学研究极为重要。团头鲂群体两性的外部形态差异不明显，尤其是在非繁殖季节，此外也没有异形性染色体。传统的团头鲂性别鉴定方法主要包括繁殖季节外部特征观察、血浆性激素水平测定和性腺解剖观察。繁殖季节通过珠星有无、腹部形态及柔软程度判别雌雄，但该方法受时间的限制，且受性腺发育程度影响，准确性难以保证；血浆性激素水平测定虽可辅助判断性别，但在幼鱼阶段实用性不强；解剖观察性腺虽最为直接，但受到鱼类个体大小及性腺发育阶段影响，且这种方法导致个体不能存活和再次利用。

2、随着分子生物学技术的发展，基于pcr的分子标记鉴定方法因其操作简便、结果可靠、对鱼体损伤小等优势，逐渐成为鱼类性别鉴定的重要手段。目前已经公开的团头鲂性别鉴定方法中，均依赖于对团头鲂自身进行大规模全基因组重测序、雌雄基因组差减比较或全基因组关联分析，存在成本高、周期长等不足。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有技术中团头鲂性别鉴定方法成本高、周期长、依赖大规模测序的不足，本发明提供了一种新型、高效、低成本的用于鉴定团头鲂雌雄性别的引物对、试剂盒及其应用、方法。

2、技术方案：本发明所述的引物对包括正向引物m86-f和反向引物m86-r，其核苷酸序列为：

3、正向引物m86-f：5’-tatgtcaccttgtcccagcg-3’；

4、反向引物m86-r：5’-catgaatgatgcggacgagc-3’。

5、本发明还提供一种用于鉴别团头鲂雌雄性别的试剂盒，包括上述的引物对，还包括pcr所需试剂。

6、上述试剂盒中，优选的，还包括10×pcr 缓冲液、脱氧核苷酸混合物、taq dna聚合酶和灭菌水。

7、本发明还提供一种上述引物对在鉴定团头鲂雌雄性别中的应用。

8、本发明还提供一种pcr鉴定团头鲂雌雄性别的方法，包括以下步骤：

9、（1）提取待鉴定的团头鲂的基因组dna样品；

10、（2）以团头鲂的基因组dna样品为模板，利用权利要求1所述的引物对进行pcr扩增；

11、（3）将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

12、（4）根据电泳检测结果判断团头鲂雌雄性别，其中能扩增出86 bp片段的为雄性，不能扩增出相应片段为雌性。

13、上述方法中，优选的，步骤（1）中，dna样品来源于待鉴定的团头鲂的鳍条。

14、上述方法中，优选的，步骤（2）中，所述pcr扩增的反应体系如下：总体系为50 μl，10×pcr 缓冲液 5 μl，taq dna聚合酶0.25 μl，dna模板0.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，脱氧核苷酸混合物4 μl，灭菌水补足至50 μl。

15、上述方法中，优选的，步骤（2）中，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预热1 min，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸反应45 s，循环35次。72℃延伸5 min，4℃保存。

16、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明基于已公开的鱼类雄性特异片段，通过生物信息学同源比对定位至团头鲂基因组，获得团头鲂的同源序列并设计扩增引物，具有来源明确、成本低、周期短、操作简便等优势。本发明通过生物信息学同源比对获得性别特异标记，成本显著降低，并且引物扩增产物仅为86 bp，扩增效率更高。

1.一种用于鉴定团头鲂雌雄性别的引物对，其特征在于：所述引物对包括正向引物m86-f和反向引物m86-r，其核苷酸序列为：

2.一种用于鉴别团头鲂团头鲂雌雄性别的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括10×pcr 缓冲液、脱氧核苷酸混合物、taq dna聚合酶和灭菌水。

4.一种权利要求1所述引物对在鉴定团头鲂雌雄性别中的应用。

5.一种pcr鉴定团头鲂雌雄性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，dna样品来源于待鉴定的团头鲂的鳍条。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述pcr扩增的反应体系如下：总体系为50 μl，10×pcr 缓冲液 5 μl，taq dna聚合酶0.25 μl，dna模板0.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，脱氧核苷酸混合物4 μl，灭菌水补足至50 μl。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述pcr扩增的反应程序为：95℃预热1 min，95℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸反应45 s，循环35次。72℃延伸5min，4℃保存。