靶向人EPCAM的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其应用

本发明属于免疫治疗，具体的，涉及靶向人epcam的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其应用。

背景技术：

1、上皮细胞黏附分子(epthelial cell adhesion molecule，epcam),又称为cd326，是一种40kd的跨膜糖蛋白。epcam在多种上皮细胞来源的肿瘤中高表达，包括多种腺癌，例如结肠、胃、胰腺、肺、卵巢、乳腺等。epcam作为信号传导分子，其下游激活wnt信号通路，从而调控膜内蛋白的裂解，进而导致肿瘤的发生。在肿瘤组织中，epcam的表达从基底层改变为在细胞膜表面均匀表达，从而使其更容易在细胞或者抗体疗法中作为靶点。

2、尽管现有技术已公开多种epcam car-t构建方案，但仍存在如下不足：

3、(1)现有技术中用于构建epcam car的抗原结合结构域来源多样，缺少基于特定抗epcam抗体可变区、并在特定car框架中获得明确优效结果的构建方案；(2)现有技术虽公开了cd28或4-1bb等共刺激结构域可用于epcam car设计，但对于在同一epcam抗原结合结构域背景下，不同共刺激结构域构型的功能差异，尤其是体内外比较验证，公开仍不充分；(3)现有技术中缺少一种基于3-17i来源vh/vl构建的epcam car，并在小鼠t细胞体系及mc38-epcam模型中证明其具有良好体外杀伤活性和体内抑瘤效果的完整技术方案；(4)现有技术中对于该类car分子、核酸、载体、工程化t细胞及医药用途的一体化保护布局仍有进一步优化空间。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于特定抗epcam抗体来源可变区构建的嵌合抗原受体(car)及其工程化t细胞，使其能够在t细胞中稳定表达并特异性识别epcam阳性靶细胞，从而有效杀伤epcam阳性肿瘤细胞，并在体内发挥抑制epcam阳性肿瘤生长的作用。

2、为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了一种靶向人epcam的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含靶向人epcam的抗体的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:13-15所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:16-18所示。

4、进一步地，所述嵌合抗原受体包含scfv，所述scfv的氨基酸序列如seq id no:10所示。

5、进一步地，所述重链可变区还包括fr1、fr2、fr3、fr4，所述fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列如seq id no:19-22所示或与seq id no:19-22所示氨基酸序列至少80%序列一致性。

6、进一步地，所述轻链可变区还包括fr1、fr2、fr3，所述fr1、fr2、fr3的氨基酸序列如seq id no:23-25所示或与seq id no:23-25所示氨基酸序列至少80%序列一致性。

7、进一步地，所述重链可变区具有与seq id no:11所示氨基酸序列至少70%序列一致性，所述轻链可变区具有与seq id no:12所示氨基酸序列至少70%序列一致性。

8、在本发明的具体实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:11所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:12所示。

9、在本发明中，术语“嵌合抗原受体”是指一种人工构建的融合受体分子，其能够赋予免疫细胞以非主要组织相容性复合体(mhc)依赖的方式识别并结合靶抗原的能力。所述嵌合抗原受体通常包括胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜结构域以及胞内结构域等功能模块。所述嵌合抗原受体可表达于t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)、nkt细胞、γδt细胞、巨噬细胞或其他免疫效应细胞中，以介导针对靶细胞的免疫应答。

10、术语“重链可变区”是指抗体重链中负责抗原特异性识别的可变氨基酸序列区域。所述重链可变区通常包括框架区(framework regions，frs)和互补决定区(complementarity determining regions，cdrs)，其中cdr区域主要参与抗原结合并决定抗体的特异性和亲和力。

11、术语“轻链可变区”是指抗体轻链中负责抗原识别的可变氨基酸序列区域。所述轻链可变区同样包括框架区和互补决定区，能够与重链可变区共同形成抗原结合位点，从而实现对目标抗原的特异性识别。

12、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区。

13、进一步地，所述铰链区选自cd8α、cd28。

14、在本发明的具体实施例中，所述铰链区选自cd28。

15、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域。

16、进一步地，所述跨膜结构域选自cd8α、cd28。

17、在本发明的具体实施例中，所述跨膜结构域选自cd28。

18、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括胞内结构域。

19、进一步地，所述胞内结构域包括信号转导结构域、共刺激分子结构域。

20、在本发明的具体实施例中，所述信号转导结构域选自cd3ζ。

21、进一步地，所述共刺激分子结构域选自4-1bb、cd28、ox40、icos中的一种或多种。

22、在本发明的具体实施例中，所述共刺激分子结构域选自4-1bb、cd28。

23、进一步地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签。

24、术语“检测标签”是指能够用于检测、鉴定、分离、纯化或定量分析目标分子表达情况的标记序列、标记蛋白或标记肽段。所述检测标签可为荧光蛋白、酶标记物、抗原标签或表面标志物等，例如但不限于rqr8、gfp、egfp、mcherry、flag标签、ha标签、myc标签、v5标签、his标签、strep标签、egfrt、lngfr、cd34或其组合。

25、进一步地，所述检测标签选自rqr8。

26、进一步地，所述嵌合抗原受体还包括自剪切肽。

27、术语“剪切肽”是指与嵌合抗原受体共同表达的、可被特异性识别并用于目标细胞检测、鉴定、分选、富集、示踪、定量分析或清除的功能性标记序列或标记蛋白。所述检测标签可表达于细胞表面、细胞内或分泌至细胞外环境中，优选为可在细胞表面表达并可通过特异性抗体进行识别的标记分子。

28、进一步地，所述自剪切肽选自t2a。

29、在本发明中，术语“铰链区”是指位于抗原识别结构域与跨膜结构域之间的连接区域，其主要作用为赋予嵌合抗原受体适当的柔性和空间延展性，以促进抗原识别结构域与靶抗原之间的有效结合。所述铰链区可来源于但不限于cd8α、cd28、igg1、igg4或其功能性变体。

30、术语“跨膜结构域”是指将嵌合抗原受体锚定于细胞膜上的疏水性氨基酸序列区域。所述跨膜结构域不仅能够维持受体在细胞膜上的稳定表达，还可影响受体的聚集状态及信号传导效率。所述跨膜结构域可来源于但不限于cd8α、cd28、cd4、cd3ζ、icos或其功能性变体。

31、术语“胞内结构域”是指位于嵌合抗原受体胞内侧并参与细胞激活及信号传导的功能区域。所述胞内结构域通常包括信号转导结构域和共刺激分子结构域中的一种或多种；其中，所述信号转导结构域是指能够介导免疫细胞激活、增殖、细胞因子分泌及细胞毒性效应的胞内信号元件。所述信号转导结构域通常包含一个或多个免疫受体酪氨酸活化基序(itam)，可来源于但不限于cd3ζ、fcrγ、dap10、dap12或其功能性变体，其中cd3ζ是目前应用最广泛的信号转导结构域之一；所述共刺激分子结构域是指能够向免疫细胞提供辅助激活信号，从而增强细胞增殖能力、存活能力、细胞因子分泌能力及持续抗肿瘤活性的细胞内功能结构域。所述共刺激分子结构域可来源于但不限于cd28、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、icos、cd27、dap10、dap12或其功能性变体。

32、本发明的第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

33、进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:9所示。

34、本发明的第三方面提供了一种重组载体，所述载体包含本发明的第二方面所述的多核苷酸。

35、进一步地，所述重组载体还包括与所述多核苷酸可操作连接的一个或多个调控元件。

36、进一步地，所述调控序列包括启动子序列、转录终止子序列、前导序列。

37、进一步，所述重组载体包括dna载体、rna载体、质粒、病毒载体。

38、进一步地，所述重组载体为病毒载体。

39、进一步地，所述病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。

40、进一步地，所述载体为逆转录病毒载体;

41、本发明的第四方面提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明第二方面所述的多核苷酸，或本发明的第三方面所述的重组载体。

42、进一步地，所述重组宿主细胞选自真核细胞。

43、进一步地，所述真核细胞选自动物细胞。

44、进一步地，所述动物细胞选自哺乳动物细胞。

45、进一步地，所述为哺乳动物细胞选自免疫细胞。

46、进一步地，所述免疫细胞包括t细胞、nk细胞或nkt细胞。

47、进一步地，所述免疫细胞为t细胞。

48、本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体，第二方面所述的多核苷酸，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的宿主细胞的任一项。

49、进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。所述辅料包括但不限于缓冲剂、稳定剂、冻存保护剂、渗透压调节剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

50、进一步地，所述缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲液、生理盐水、plasma-lyte a、乳酸林格液及其组合；所述稳定剂包括但不限于人血清白蛋白、重组人白蛋白、人血清及其组合；所述冻存保护剂包括但不限于二甲基亚砜(dmso)、海藻糖、蔗糖、葡聚糖、羟乙基淀粉及其组合；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠、葡萄糖、甘露醇及其组合。

51、本发明的第六方面提供了如任一种方法：

52、(1)一种重组宿主细胞制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的重组载体导入宿主细胞的步骤；

53、(2)一种体外检测样本细胞中基因epcam表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括将本发明第一方面所述的嵌合抗原受体或第四方面所述的重组宿主细胞与待测细胞样本接触，在适合形成抗原-受体复合物的条件下孵育，检测所述嵌合抗原受体与待测细胞样本的结合率，以确定基因epcam的表达水平。本发明的第七方面提供了如下任一项应用：

54、(1)抗体3-17i在制备嵌合抗原受体中的用途，所述抗体3-17i的氨基酸序列如seqid no:10所示；

55、(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体，第二方面所述的多核苷酸，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的宿主细胞、第五方面所述的药物组合物、第六方面所述的方法中的任一项在制备人类实体瘤治疗药物中的应用；

56、(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体，第二方面所述的多核苷酸，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的宿主细胞、第五方面所述的药物组合物、第六方面所述的方法中的任一项在制备非治疗目的体外检测基因epcam表达水平的产品中的应用。

57、进一步地，所述实体瘤包括乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞、膀胱癌、胆管细胞癌、透明细胞肾癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、cup、胸腺癌、胶质瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、子宫颈癌或前列腺癌。

58、本发明具有的优点和有益效果：

59、本发明不是单纯提供已知抗epcam抗体，而是将现有专利公开的抗epcam抗体vh和vl序列引入car框架中，构建出能够在t细胞中表达并发挥效应功能的epcam靶向car分子。本发明构建的epcam car-t经体外实验验证能够有效杀伤epcam阳性靶细胞，并经体内实验验证能够抑制mc38-epcam肿瘤生长，说明该car设计可实际转化为有效的细胞治疗产品。为验证不同胞内共刺激结构域对car功能的影响，本发明还构建了对照car，其与上述car具有相同的抗原识别结构域及相同的铰链区/跨膜区，但胞内共刺激结构域替换为4-1bb结构域，并与cd3ζ连接形成对照构型。通过将两种构型在相同实验体系下进行比较，进一步证明本发明优选构型的技术效果。