一种粒径均一的干细胞聚集体及其制备方法与应用

本发明涉及干细胞，特别是涉及一种粒径均一的干细胞聚集体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、间充质干/基质细胞（mesenchymal stem/stromal cells, msc）因具备免疫调节、抗炎、促进组织修复的能力，且可分泌多种营养因子与外泌体，是再生医学、细胞治疗和生物制造领域的核心种子细胞。大量研究证实，将msc制备为细胞聚集体，是提升其治疗潜力的有效方式。相较于msc单细胞，三维聚集状态的msc更贴合体内细胞群体微环境，其旁分泌活性、抗炎、促血管生成、免疫调节功能以及功能性外泌体释放能力均显著增强。

2、目前，msc三维聚集体主流制备技术主要分为动态悬浮培养法与模板介导法两类，两种方法均存在明显技术局限性，尚未实现高质量、可量产的制备需求。

3、动态悬浮培养法是将msc置于悬浮培养体系中，借助动态培养装置产生的持续剪切力，驱使细胞自发碰撞，依靠细胞自身分泌或额外添加细胞外基质介导细胞随机黏附、聚集成球。该方法操作简便，具备一定规模化放大潜力，但存在根本性缺陷：未对聚集前细胞-细胞间黏附能力进行调控，细胞间结合力薄弱，导致细胞在动态环境中随机聚集，形成的聚集体产物粒径均一性、结构完整性、稳定性均较差，且产物聚集体异质性强。因此，该方法目前多用于获取msc动态培养上清的分泌产物，难以稳定获得形态、结构一致的msc聚集体。

4、模板介导法主要通过微孔阵列、悬滴结构限定细胞生存空间，依托离心力或重力作用将固定数量的msc限制在特定区域，培养后形成尺寸、数量相对可控的聚集体，具体可分为离心驱动法与重力驱动法两种。其中以aggrewell法为代表的离心驱动法，可通过离心作用快速将细胞压入微孔底部完成聚集、短时间成型，但离心产生的加速度冲击与细胞堆积内压，会造成msc细胞骨架损伤，而细胞骨架完整性直接决定细胞黏附能力与聚集体功能，不当的离心力会大幅降低成球质量。以悬滴法为代表的重力驱动法，无需离心操作，规避了机械冲击损伤，但完全依赖细胞自主分泌细胞外基质逐步完成黏附聚集，培养周期长达72小时；同时微小液滴内易出现营养快速消耗、代谢废物堆积的问题，进而造成msc细胞损伤。

5、除此之外，两类模板介导方式均高度依赖商用成球微孔板、低吸附培养皿或专用成球培养平台，整体操作流程繁琐，人力、物料成本较高，产物产量有限，难以实现工业化大规模放大生产。

6、综合而言，现有msc聚集体制备技术存在共性核心问题：未从根本上仿生强化msc细胞间的黏附结合力。无论是动态培养中细胞被动随机碰撞聚集，还是模板体系内的受限聚集，均未解决msc自身细胞间结合力不足的根源问题。

7、当前领域亟需全新的技术路线，既要实现msc高效聚集，培育出尺寸微小、粒径分布均匀、生物功能优异的聚集体，同时也要满足工艺简洁、参数可控、易规模化放大、成本低廉的要求，适配后续临床转化与工业化应用，这也是目前msc三维聚集体应用领域亟待突破的关键技术瓶颈。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有msc聚集体制备技术中存在的细胞间黏附能力不足、聚集过程随机性强、所得聚集体粒径均一性差、结构完整性/稳定性不足、对专用成球耗材或成球平台依赖性强、操作流程复杂以及规模化制备困难等技术缺陷，提供一种粒径均一的干细胞聚集体的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的粒径均一的干细胞聚集体。

3、本发明的另一目的在于提供上述粒径均一的干细胞聚集体的应用。

4、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

5、一种粒径均一的干细胞聚集体的制备方法，包括以下步骤：

6、将钙黏素融合蛋白cad-fc作为功能化基底对间充质干细胞msc进行预培养，以增强msc的内源性钙黏素表达，进而提高其钙黏素介导的细胞间黏附能力；然后将预培养的msc置于流体剪切力为0.8–2.2 dyn/cm2的低剪切动态培养条件下继续培养，在温和、可控的动态流体环境中促进细胞间充分碰撞、接触，经预培养上调细胞内源性膜蛋白钙黏素正反馈自主介导形成粒径均一、结构稳定的干细胞聚集体。

7、在上述技术方案中，所述钙黏素融合蛋白为由钙黏素家族成员或其具有细胞黏附活性的结构域、片段与免疫球蛋白fc片段融合形成的融合蛋白；所述cad-fc能够作为功能化基底用于msc的预培养，以诱导或增强msc内源性钙黏素表达，进而提高细胞间黏附能力，其中，所述钙黏素家族成员包括经典钙黏素或非经典钙黏素中能够参与细胞间黏附调控的成员；所述钙黏素融合蛋白cad-fc包括e-cad-fc、n-cad-fc、p-cad-fc、ve-cad-fc、r-cad-fc、t-cad-fc、ob-cad-fc、k-cad-fc和cadherin-11-fc中的一种或多种的混合。

8、在上述技术方案中，所述钙黏素融合蛋白cad-fc包括he-cad-fc、hn-cad-fc和hve-cad-fc中的一种或多种组合，其中，h表示为人源的钙黏素序列。在上述技术方案中，所述低剪切力动态培养为采用能够向细胞培养体系提供可控低剪切流体力学环境的动态培养装置进行培养。所述动态培养装置可通过往复流动、旋转流动、波浪式流动、振荡流动或搅拌流动等方式产生温和的动态流体剪切力，促进msc发生充分碰撞和细胞间黏附，形成粒径均一、结构稳定的干细胞聚集体。所述动态培养装置包括但不限于翘板摇床、轨道摇床、转瓶、滚瓶、旋转壁式生物反应器、波浪式生物反应器、wave生物反应器、低速搅拌式生物反应器，或其他能够产生温和动态流体剪切力的培养装置。

9、在上述技术方案中，具体包括以下步骤：

10、步骤1，将间充质干细胞（msc）接种于预先孵育有钙黏素融合蛋白cad-fc的细胞培养表面进行预培养，收集高表达内源性钙黏素的间充质干细胞msccad；

11、步骤2，将msccad按5-30万每毫升进行接种，置于动态培养装置中进行动态培养，收集培养液离心，收集沉淀，获得粒径均一干细胞聚集体。

12、在上述技术方案中，所述步骤1中，当细胞汇合度达到80%时，采用胰酶消化并收集msccad。

13、在上述技术方案中，所述步骤2中，将msccad接种于经抗黏附处理的常规细胞培养容器中，所述常规细胞培养容器包括六孔板、t75细胞培养瓶或t225细胞培养瓶等。

14、在上述技术方案中，所述步骤2中，动态培养过程中细胞所受流体剪切力为0.8-2.2 dyn/cm2，动态培养时间为12-48小时；所述动态培养装置为翘板摇床。

15、本发明的另一方面，还包括所述的制备方法获得的粒径均一干细胞聚集体。

16、本发明的另一方面，还包括所制得的聚集体在制备预防、缓解或治疗炎症相关疾病、神经系统相关疾病、衰老相关疾病或组织损伤修复相关疾病的药物、细胞制剂或生物制品中的应用。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1、本发明的制备方法将钙黏素融合蛋白功能化基底的“生物学预赋能”与翘板摇床的“低剪切动态培养”相结合，形成“先赋能、后聚集”的串联工序，两者在机理上形成深度协同。钙黏素融合蛋白功能化基底仿生模拟细胞间钙黏素介导的黏附连接，重塑细胞黏附结构基础；低剪切动态培养则通过周期性波动运动提供温和可控的剪切力环境，为预赋能的msc供给持续的力学刺激与碰撞机会，同时，避免新生黏附键受损。两者协同构成“增强聚集驱动力”与“优化聚集环境”的耦合效应，即前者赋予细胞更强的“聚集主动性”，后者保障“黏附键快速形成与稳定”。单独施用时，未预赋能的msc因黏附力不足导致聚集效率低、聚集体松散易碎，而预赋能msc静态培养则因缺乏持续的力学驱动，细胞碰撞频率低、物质交换受限，聚集缓慢且大小不均。唯有两者有机结合，才能从根源上确保聚集体在尺寸均一性、结构稳定性及批次可重复性上的显著优势；

19、2、本发明区别于现有依赖流体随机碰撞的被动悬浮成球法，也区别于aggrewell、悬滴法等依赖空间限域或离心沉降的模板法。现有技术均属于“被动聚集”（或依靠外力碰撞，或借助物理约束迫使细胞聚集），其过程高度依赖外部条件。本发明则实现了“被动”到“主动”的范式转变：先以钙黏素融合蛋白基底预培养提升细胞自身黏附能力；再以低剪切动态培养的温和扰动促使高表达钙黏素的msc在周期性接触中快速、大量地形成细胞间黏附键并迅速成熟，在非限域环境中介导细胞自主接触、黏附并动态聚集成球。因此，无需微孔模板、悬滴结构或离心沉降，既规避了繁琐操作与专用耗材依赖，又避免了离心对细胞骨架的扰动与功能损伤。预赋能使msc从“被动参与者”转变为“主动聚集者”，低剪切动态培养为这种主动聚集提供最优力学环境——两者协同使得本发明的聚集体在尺寸均一性、结构稳定性及批次可重复性方面具有显著优势；

20、3、本发明提出了一种将细胞预处理增强细胞间黏附蛋白表达与后续动态培养促进细胞聚集处理相结合的一贯式msc聚集体制备技术。该技术路线在时间顺序上形成“先赋能、后聚集”的有机串联：赋能阶段赋予细胞以主动聚集的分子基础，聚集阶段则利用温和力学环境将这一分子基础转化为高效、可控的宏观聚集行为。所制备的msc聚集体因细胞间以天然钙黏素介导的黏附连接为主，其结构更仿生、更稳定，使聚集体内细胞功能活性与分泌能力显著增强；

21、4、与传统动态培养法相比，本发明克服了现有方法所得msc聚集体粒径分布较宽、结构均一性不足及异质性较强等固有缺陷。传统动态培养中，未经预赋能的msc表面钙黏素表达水平低、聚集速度慢，在被动碰撞动态聚集过程中引发细胞间黏附力出现个体差异，进而导致“竞争性聚集”现象，即黏附力强的细胞优先聚集形成较大的聚集体，而黏附力弱的细胞则聚集滞后或难以有效整合，最终产物呈现宽粒径分布与显著的结构异质性。本发明通过预赋能步骤将msc表面钙黏素表达提升、动态培养细胞碰撞时快速、主动聚集，有效消除了缓慢、被动聚集引发的细胞间黏附能力的个体差异，所得聚集体粒径分布更窄、结构一致性更好。这一特性有利于提升细胞治疗产品的质量稳定性，并为后续的质量控制与标准化生产奠定坚实基础；

22、5、与传统模板法相比，本发明无需依赖特殊空间限域模板（如aggrewell、elplasia等专用成球平台），也无需悬滴或离心沉降等辅助操作，有效克服了细胞自然沉降自组装耗时长、离心加速聚集引发细胞骨架重塑以及模板限域导致结构异质性等缺陷。同时，现有模板法操作流程繁琐、耗材依赖性强、单批次产量有限且难以规模化放大；本发明采用标准细胞培养容器配合翘板摇床即可完成制备，工艺简洁高效，成本显著降低，且该平台可通过大容量培养袋在波浪式生物反应器中直接放大，具备突出的临床转化潜力与产业化前景。