一种诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法及其在治疗骨关节炎中的应用与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种线粒体的制备方法及其应用，尤其涉及一种诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法及其在治疗骨关节炎中的应用。

背景技术：

1、骨关节炎（osteoarthritis, oa）是一种常见的关节退行性疾病，主要病理特征为软骨细胞软骨基质降解、滑膜炎症以及软骨下骨重塑。近年研究表明，软骨细胞中的线粒体功能障碍（如氧化应激增加、atp合成减少、膜电位下降）是导致软骨细胞凋亡和退变的核心机制之一。目前外源性线粒体移植（mitochondrial transplantation）作为一种新型治疗策略，已被用于改善受损细胞的能量代谢。现有的外源线粒体来源主要包括：成纤维细胞、脐带血间充质干细胞（uc-mscs）或组织提取（如肌肉组织）。

2、然而，目前通过线粒体治疗骨关节炎，存在以下问题：

3、1.来源与质量受限：从成人原代细胞或组织中提取线粒体，细胞来源有限、批次间差异大，且原代细胞衰老会导致提取的线粒体活性不稳或携带累积的线粒体dna（mtdna）突变。

4、2. 治疗效率与稳定性不足：传统关节腔给药多为全身性药物或细胞治疗，直接注射干细胞可能存在细胞存活率低、异位分化或免疫原性风险；而普通外源线粒体在关节腔微环境中的内吞效率和稳定性较差。

5、因此，尝试开发一种新来源的线粒体，从而能够解决目前存在的来源和质量受限，以及治疗效率和稳定性不足的问题，为当前该技术领域的迫切需要。

技术实现思路

1、针对上述目的，本发明的目的是提供一种诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法及其在治疗骨关节炎中的应用，克服现有技术中存在的来源和质量受限，以及治疗效率和稳定性不足的问题，从而得到的线粒体的基因突变率极低、膜电位高以及呼吸储备能力强，并且安全性高、免疫原性低，能够局部精准给药，能够有效阻断骨关节炎发生过程中的软骨细胞退变，抑制关节软骨基质的降解，促进软骨组织的自我修复。

2、本发明的一方面提供一种诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，包括以下步骤：

3、1）构建诱导多能干细胞；

4、2）再取1×106个~4×106个构建的诱导多能干细胞，然后加入无血清培养基培养至对数生长期，再将培养的诱导多能干细胞通过离心，收集细胞沉淀；

5、3）将向收集的细胞沉淀中加入预冷的线粒体分离缓冲液，进行冰上匀浆破壁；再于4℃离心，去除未破裂细胞及细胞核，收集上清液；

6、4）将所述上清液于4℃离心，收集含有线粒体的沉淀物，再将所述含有线粒体的沉淀物重悬于线粒体注射缓冲液中备用，即得。

7、在本发明的优选实施例中，在步骤1）中，所述诱导多能干细胞为无异源无病毒的诱导多能干细胞。

8、在本发明的优选实施例中，在步骤2）中，取1×106个构建的诱导多能干细胞。

9、在本发明的优选实施例中，在步骤3）中，以700×g~3000×g离心10分钟；优选以700×g离心10分钟。

10、在本发明的优选实施例中，在步骤4）中，以12000×g~14000×g离心15分钟；优选以12000×g离心15分钟。

11、另一方面，本发明还提供一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，包括上述制备方法制得的线粒体，所述线粒体为来自1×106个~4×106个诱导多能干细胞的线粒体。

12、在本发明的优选实施例中，所述线粒体为来自1×106个诱导多能干细胞的线粒体。

13、在本发明的优选实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体为线粒体注射缓冲液和/或关节内注射介质。

14、在本发明的优选实施例中，所述线粒体注射缓冲液由海藻蛋白、清蛋白和生理盐水制成；所述关节内注射介质为含有透明质酸和/或壳聚糖的溶液，或所述关节内注射介质为由透明质酸和/或壳聚糖形成的具有生物相容性的水凝胶。

15、在本发明的优选实施例中，所述海藻蛋白的浓度为2%w/v-5%w/v，所述清蛋白的浓度为 0.5%w/v-1% w/v。

16、在本发明的优选实施例中，所述药物组合物为注射剂，所述注射剂优选为注射液。

17、又一方面，本发明还提供一种上述制备方法制得的线粒体或上述的药物组合物在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

18、再一方面，本方面还提供一种治疗骨关节炎的方法，包括将上述适量的线粒体或药物组合物施于需要的受体中。

19、在本发明的优选实施例中，将上述适量的线粒体或药物组合物通过注射施于需要的受体的骨关节炎的病变部位。

20、本发明的有益效果是：

21、1. 高干性与高质量：由于ipsc具有无限增殖能力，且其来源的线粒体具有突出的“年轻态”生理特征，表现为基因突变率极低、膜电位高以及呼吸储备能力强，这为批量化、标准化制备高质量活性线粒体药物提供了稳定的来源保证。

22、2. 恢复关节微环境代谢与抑制降解：关节腔注射后，外源性ipsc线粒体能够靶向并高效融入受损的关节软骨细胞，迅速提高局部组织的atp产生并清除过量积累的活性氧，从而有效阻断骨关节炎发生过程中的软骨细胞退变，抑制关节软骨基质的降解，通过实验证明，注射本发明的线粒体之后，能够促进软骨组织的自我修复能有效保护关节软骨，并且具有剂量依赖性。

23、3. 安全性高、免疫原性低与局部精准给药：相较于直接使用干细胞进行移植，纯化后的无细胞线粒体组分不具有成瘤性风险，免疫原性极低。通过关节腔局部给药的方式，不仅能使药物在病灶部位达到极高浓度，还能有效规避全身系统性给药可能带来的毒副作用及靶向性不足的问题。

1.一种诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述诱导多能干细胞为无异源无病毒的诱导多能干细胞。

3.根据权利要求2所述的诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，取1×106个构建的诱导多能干细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，以700×g~3000×g离心10分钟；优选以700×g离心10分钟。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的诱导多能干细胞来源的线粒体的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，以12000×g~14000×g离心15分钟；优选以12000×g离心15分钟。

6.一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，包括权利要求1至5中任一项所述的制备方法制得的线粒体，所述线粒体为来自1×106个~4×106个诱导多能干细胞的线粒体，优选来自1×106个诱导多能干细胞的线粒体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体为线粒体注射缓冲液和/或关节内注射介质。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述线粒体注射缓冲液由海藻蛋白、清蛋白和生理盐水制成；所述关节内注射介质为含有透明质酸和/或壳聚糖的溶液，或所述关节内注射介质为由透明质酸和/或壳聚糖形成的具有生物相容性的水凝胶；

9.根据权利要求6至8中任一项所述的药物组合物，其特征在于，其特征在于，所述药物组合物为注射剂，所述注射剂优选为注射液。

10.根据权利要求1至5中任一项制得的线粒体或权利要求6至9中任一项的药物组合物在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。