一种靶向外泌体-水凝胶制剂及其制备方法和应用与流程

本技术涉及生物医用材料与药物递送，特别是涉及一种靶向外泌体-水凝胶制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、关节软骨是一种无血管、无神经、无淋巴组织的特殊结缔组织，其自身修复能力极为有限，在骨关节炎、创伤性关节软骨缺损、半月板损伤等病理状态下，软骨基质中的主要成分ii型胶原大量暴露，病灶部位同时伴随高水平的活性氧和持续性炎症因子浸润，形成氧化应激与炎症恶性循环，进一步抑制软骨细胞的增殖与表型维持，加速蛋白聚糖和胶原的降解，最终导致关节功能丧失，临床上现有治疗手段包括物理治疗、非甾体抗炎药、关节腔内注射玻璃酸钠或糖皮质激素等，但均以缓解症状为主，难以实现缺损组织的结构性再生修复。

2、间充质干细胞来源的外泌体是细胞分泌的直径约为30～150nm的纳米级胞外囊泡，天然携带蛋白质、mrna、微小rna等多种促修复活性分子，具有免疫原性低、穿透性强、可跨越生物屏障等优势，在软骨修复领域展现出巨大潜力，然而，游离外泌体经关节腔注射后，会迅速被关节滑液稀释并随滑液循环代谢流失，体内停留时间极短，病灶部位有效浓度低下，极大限制了其治疗效果。

3、为延长外泌体在关节腔内的滞留时间，研究人员尝试将外泌体包裹于温敏型可注射水凝胶中，利用水凝胶在体温下发生溶胶-凝胶转变的性质，形成局部药物储库，延缓外泌体的释放，壳聚糖/β-甘油磷酸钠体系是最为经典的温敏水凝胶之一，具有良好的生物相容性和可降解性，但该体系仅具备简单的物理包封和被动缓释功能，既无法赋予外泌体主动靶向识别能力，也无法改善病灶部位的高氧化应激和炎症微环境，外泌体从凝胶中释放后仍会无规则扩散，且极易因氧化攻击而失去生物活性，导致实际修复效能大打折扣。

4、为实现外泌体的主动靶向递送，目前通常采用基因工程手段对供体细胞进行改造，使其分泌的外泌体膜表面融合表达靶向多肽或蛋白，然而，该方法细胞培养周期长、转染效率受细胞代次和状态影响极大，批次间靶向分子表达量波动明显，质粒载体还存在基因组整合潜在生物安全风险，整体工艺复杂，不利于标准化和规模化生产，若采用简单物理吸附方式将靶向分子固定于外泌体表面，则结合力弱，在体内滑液持续冲刷和蛋白竞争下极易脱落，难以真正实现病灶富集。

5、更为关键的是，现有技术中尚未认识并解决以下突出的多组分配伍缺陷：为赋予水凝胶额外润滑、抗炎、抗氧化、促软骨再生性能，尝试复配透明质酸钠、氯化锶时，阳离子壳聚糖与阴离子高分子透明质酸钠直接混合会产生聚电解质絮凝，β-甘油磷酸根水解产生的磷酸根易与锶离子生成微晶沉淀，造成体系浑浊、针头堵塞，现有体系无法同时兼容四类功能组分。

6、此外，传统制剂均为现配现用液态，严苛冷链限制基层门诊使用，现有技术缺少兼顾靶向、缓释、微环境调控、长期稳定储存的一体化方案。

技术实现思路

1、基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种靶向外泌体-水凝胶制剂及其制备方法和应用。

2、本技术提供的一种靶向外泌体-水凝胶制剂采用如下的技术方案：包含靶向外泌体和功能化温敏水凝胶前体溶液，所述靶向外泌体为p3～p6代人脂肪间充质干细胞来源外泌体，膜表面通过dspe-peg2000-wyrgrlc偶联物磷脂锚定修饰，内部负载mir-140-5p模拟物；靶向外泌体粒径100～130nm，zeta电位-12～-8mv，单外泌体表面wyrgrlc修饰分子密度200～500个，mir-140-5p包封率≥35%；

3、所述功能化温敏水凝胶前体溶液中各组分的终浓度为：壳聚糖1.8%～2.2%w/v，β-甘油磷酸钠5%～8%w/v，透明质酸钠0.2%～0.5%w/v，氯化锶0.05～0.1mmol/l，体系ph值为7.0～7.2；所述壳聚糖脱乙酰度≥85%，分子量200～400kda，所述透明质酸钠分子量1000～1500kda；

4、所述功能化温敏水凝胶前体溶液通过分步加料、梯度ph调控的工艺配制而成，具体为：在4℃冰浴及搅拌下，将壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液混合后，先缓慢加碱调节体系ph至6.5，再加入透明质酸钠并充分溶解，最后加入氯化锶并调节终ph，从而获得无聚电解质絮凝、无磷酸盐沉淀的均一溶液；

5、所述制剂在4～25℃下呈可流动低粘液态，可通过26g注射针头，在35～39℃下5～8min形成储能模量g’≥500pa的原位凝胶；其存在形式为液态注射液，或通过终末添加5%w/v海藻糖经冷冻干燥得到的冻干粉针剂。

6、通过采用上述技术方案，采用分步加料配合梯度ph6.5预处理工艺，规避阳离子壳聚糖与阴离子透明质酸钠、锶离子与磷酸盐之间的絮凝、沉淀反应，实现四种功能辅料稳定共存，通过磷脂锚定修饰外泌体，无需基因改造，生物安全性更高，搭配低损伤电穿孔负载mir-140-5p，提升软骨修复活性，温敏凝胶可在关节腔原位成胶形成药物储库，延长外泌体病灶滞留时间，同时设置液态、冻干双剂型，冻干粉无需超低温冷链，适配基层临床使用。

7、优选的，所述冻干粉针剂在2～8℃避光储存稳定期限不低于12个月，无菌注射用水复溶后，成胶性能、外泌体靶向活性与新鲜液态制剂无显著差异。

8、通过采用上述技术方案，冻干剂型大幅放宽储运温度要求，降低运输、仓储成本，长期储存后制剂性能不衰减，适用范围更广。

9、优选的，所述制剂体外可持续释放外泌体15天，凝胶在体内抗酶解降解周期不低于28天。

10、通过采用上述技术方案，长效缓释外泌体活性组分，持续调控病灶炎症与氧化微环境，延长修复作用周期，减少重复注射频次。

11、本技术提供了一种靶向外泌体-水凝胶制剂的制备方法，包括如下步骤：

12、s1：收集p3～p6代人脂肪间充质干细胞无外泌体培养上清，多级差速离心结合超速离心纯化外泌体，质控，粒径主峰90～130nm，cd9、cd63、tsg101阳性，内毒素≤0.1eu/μg蛋白；

13、s2：电穿孔缓冲液为1.15mmkh2po4、25mmkcl、21%optiprep，外泌体总蛋白与mir-140-5p模拟物质量比20:1，420v、150μf单次脉冲电击，冰浴、37℃孵育修复膜，rnasea去除游离核酸，超速离心得载药外泌体；

14、s3：wyrgrlc多肽与dspe-peg2000-马来酰亚胺摩尔比1.2:1，ph6.8脱氧pbs避光反应，透析冻干，偶联效率≥90%；

15、s4：载药外泌体总蛋白与偶联物质量比20:1，37℃孵育2h，100kda超滤管3000×g离心15min，无菌pbs洗涤3次，修饰阳性率≥85%；

16、s5：4℃冰浴分步加料，混合壳聚糖与β-甘油磷酸钠，梯度调ph至6.5后再加透明质酸钠，最后添加氯化锶，终调ph7.0～7.2；

17、s6：4～10℃低温混匀得到液态注射液，或终末加入海藻糖冻干制备冻干粉针。

18、优选的，所述步骤s3中，偶联物密封-20℃避光保存。

19、通过采用上述技术方案，保障靶向偶联物储存稳定性，避免因活性基团水解导致外泌体靶向修饰效率下降。

20、优选的，所述步骤s4中，超滤洗涤3次，完全去除未结合游离靶向偶联物。

21、通过采用上述技术方案，消除游离多肽对体内软骨识别的竞争性干扰，保证靶向外泌体病灶富集效率。

22、优选的，所述步骤s6中，冻干参数：-45℃预冻4h，-20℃一次干燥12h，25℃二次干燥6h。

23、通过采用上述技术方案，该冻干曲线可最大程度保护外泌体生物活性，冻干复溶后粒径、电位、靶向能力无明显变化。

24、本技术同时保护上述靶向外泌体-水凝胶制剂在制备骨关节疾病治疗药物中的应用。

25、优选的，所述药物为关节腔注射剂，适应症选自骨关节炎、创伤性关节软骨缺损、半月板损伤与膝关节滑膜炎。

26、优选的，所述关节腔注射的给药部位为人体膝关节或踝关节的病变关节腔。

27、通过采用上述技术方案，限定制剂临床给药场景与适用病灶部位，明确药物保护用途边界，适配骨关节软骨损伤类疾病局部微创给药需求。

28、综上所述，本技术包括以下有益技术效果：

29、1.本技术通过采用分步加料联合梯度ph调控工艺配制功能化温敏水凝胶前体，先调节体系ph至6.5再加入透明质酸钠、最后微量添加氯化锶，从根源规避壳聚糖与透明质酸钠的聚电解质絮凝、锶离子与磷酸根形成微晶沉淀两大配伍缺陷，实现壳聚糖、透明质酸钠、氯化锶、β-甘油磷酸钠四种功能组分稳定共存，得到澄清可注射的凝胶基质，解决传统多功能凝胶体系易浑浊、堵针与力学不均的行业难题。

30、2.本技术通过体外dspe-peg磷脂锚定修饰外泌体替代基因工程改造供体细胞，无需质粒转染、无基因组整合安全风险，整套修饰工艺温和耗时短，搭配限定20:1最优物料比可实现85%以上靶向修饰阳性率，高修饰密度能够缓解滑液中蛋白竞争性置换导致的靶向肽脱落问题，保障外泌体在关节腔内持续具备软骨ii型胶原识别能力。

31、3.本技术通过优化20:1低核酸配比电穿孔载药体系，搭配匹配的缓冲液与电击参数，大幅降低电击造成的外泌体囊泡破损、游离核酸泄漏风险，减少关节腔内一过性炎症刺激，在保证mir-140-5p包封率≥35%的前提下，完整保留外泌体自身蛋白、生长因子等原生活性组分，实现内源活性物质与外源微小rna协同促进软骨基质合成。

32、4.本技术采用终末添加海藻糖的冻干制备方案，不在凝胶配制阶段混入保护剂，避免海藻干扰溶胶-凝胶相变速度与凝胶力学强度；所得冻干粉针2～8℃可稳定储存12个月，复溶后成胶、靶向、载药性能与新鲜液态制剂无差异，打破外泌体制剂超低温冷链储运限制，适配基层门诊、急诊灵活使用场景。

33、5.本技术构建靶向识别、物理缓释、病灶微环境调控三重协同修复体系，注射至关节腔后温敏凝胶原位成胶形成药物储库，15天持续释放活性外泌体，体内凝胶抗降解周期可达28天；基质中锶离子清除病灶过量活性氧、透明质酸钠补充关节滑液并缓冲壳聚糖降解产生的乳酸，共同缓解氧化炎症微环境，大幅提升外泌体体内活性留存时长，相较于单一外泌或普通水凝胶，软骨修复、退变抑制效果显著提升。

34、6.本技术对原料代次、外泌体理化指标、靶向修饰密度、核酸包封率、凝胶流变参数设置全套量化质控标准，全流程工艺参数清晰可控，批次重复性强，同时提供液态注射液、冻干粉针两种成型剂型，给药限定膝关节、踝关节病变关节腔局部穿刺注射，工艺标准化程度高，满足生物药械组合产品注册申报与规模化工业化生产要求。