一种HA-CTS-EPA自愈合水凝胶及其制备方法和应用

本发明属于医药，特别涉及一种自愈合水凝胶的制备及其在骨关节炎中的应用。

背景技术：

1、骨关节炎（osteoarthritis, oa）是一类以关节软骨退变为核心、并累及滑膜、软骨下骨及周围组织的慢性退行性疾病，其临床负担与致残风险随人口老龄化持续上升。传统治疗以镇痛、抗炎与终末期关节置换为主，难以在疾病层面实现结构性逆转。其根本原因之一在于oa并非单纯机械磨损，而是由关节微环境稳态崩解所驱动的系统性组织病理过程：炎症介质持续释放、基质代谢失衡、细胞凋亡与软骨下骨异常重塑相互促进，使局部修复能力长期处于被抑制状态。因而，围绕“重塑微环境—恢复组织自稳态”的策略被认为是实现疾病改善型治疗的关键方向。

2、在oa的病理网络中，活性氧（reactive oxygen species, ros）过量积累与氧化应激反应被视为贯穿早中晚期的重要分子事件。ros不仅可直接引发膜脂过氧化、dna氧化损伤与线粒体功能障碍，还可作为信号枢纽促进多条促炎通路的持续激活。尤其是ros与nf-κb之间存在相互放大的正反馈：ros可促进iκbα磷酸化与降解并增强p65核转位，从而驱动tnf-α、il-1β等炎症因子与mmp-13等基质降解酶表达；而炎症因子的持续释放又进一步加重线粒体压力与ros生成，最终形成“氧化应激—炎症放大—基质降解”的恶性循环，推动软骨退变不可逆进展。打断该轴并恢复氧化还原平衡，具有明确的机制合理性与干预价值。

3、骨髓间充质干细胞（bmscs）因其免疫调节旁分泌效应、多向分化潜能及促修复能力，被广泛探索用于oa再生治疗。然而，关节腔内注射游离bmscs往往面临“进入即衰减”的困境：一方面，oa关节腔内高ros与炎症因子环境可快速损伤细胞线粒体与膜电位并诱导凋亡，导致有效细胞数骤降；另一方面，关节活动引起的流体剪切与稀释效应使细胞难以在损伤区域稳定滞留，进一步限制其旁分泌调控与组织修复的作用时间窗。由此可见，提升bmscs疗效不仅取决于细胞本身，更取决于其所处的局部“土壤”是否被同步改良。

4、水凝胶因具备高含水、三维网络与仿生细胞外基质特征，已成为关节腔局部递送生物活性分子的重要候选平台。尤其是基于动态共价键构建的可注射自愈合水凝胶，可在剪切或破坏后快速恢复网络结构，从而适配关节腔内复杂运动与反复受力。目前，基于醛基化透明质酸与壳聚糖衍生物通过席夫碱反应构建的自愈合水凝胶已有相关报道。例如，公开号为cn115192772a的发明专利公开了一种基于醛基化透明质酸（oha）与儿茶酚改性壳聚糖（dcs）通过席夫碱反应构建的可注射导电水凝胶，用于关节软骨定向修复。该水凝胶通过引入pda-pani-go纳米导电填料赋予材料导电性能，并结合脉冲直流电刺激实现对细胞的定向招募与成软骨分化诱导。此外，公开号为cn118141976a的发明专利公开了羧甲基壳聚糖与醛基化透明质酸通过席夫碱反应形成水凝胶复合物，可作为细胞三维培养支架用于创伤修复。上述现有技术表明，醛基化透明质酸与壳聚糖衍生物通过动态席夫碱交联可构建可注射自愈合水凝胶。

5、然而，上述水凝胶体系主要侧重于提供物理支撑、细胞包埋与导电刺激等被动或物理性功能，尚缺乏主动调控oa病理微环境中氧化应激与炎症级联反应的能力。具体而言，这些水凝胶难以持续逆转oa关节腔内高ros与促炎因子微环境，使得材料与细胞或药物之间更多表现为“共存”而非“协同”，限制了其对oa疾病进展的干预深度。

6、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, epa）作为ω-3多不饱和脂肪酸，已被证实具备抗炎与抗氧化相关生物学效应。公开号为cn114886915a的发明专利公开了一种复合二十碳五烯酸的玻璃酸钠注射液，通过将epa纳米乳液与玻璃酸钠溶液物理混合，用于关节腔注射治疗oa。该方案通过外源性玻璃酸钠恢复关节液正常粘弹性，同时将epa带入关节软骨微环境以调节炎症反应。动物实验结果表明，该复合注射液可增加小鼠膝关节软骨厚度、降低oarsi评分，显示出对oa的治疗作用。然而，该方案中epa以纳米乳液形式物理负载于玻璃酸钠溶液中，其释放行为受限于纳米乳液的自身分散与代谢，难以实现与递送载体降解动力学耦合的持续驻留释放；同时，玻璃酸钠溶液体系缺乏对细胞的物理保护与三维支撑功能，难以作为细胞联合治疗的递送平台。

7、因此，开发兼具物理防护与主动微环境调控能力的递送系统，以打破ros/nf-κb恶性循环并提升bmscs在病理关节内的治疗窗口，是实现oa疾病改善型治疗的重要科学问题。

技术实现思路

1、本发明针对上述技术问题，提出了一种ha-cts-epa自愈合水凝胶及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供了一种ha-cts-epa自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）将透明质酸溶于去离子水后避光加入高碘酸钠水溶液，避光搅拌进行反应，加入乙二醇终止后继续搅拌，然后经透析、冷冻干燥后得到固态oha；

5、（2）将cts溶解于乙酸水溶液中，得到cts混合液，另外将epa、edc·hcl和nhs溶于无水乙醇中，得到epa混合液；

6、（3）将活化后的epa混合液滴加至cts混合液中，避光搅拌进行反应，产物经透析、冷冻干燥后得到得到cts-epa；

7、（4）将oha水溶液和cts-epa的乙酸溶液（ph=5.0-6.0）混合，进行席夫碱反应，得到ha-cts-epa自愈合水凝胶。

8、所述步骤（1）中每g透明质酸中添加0.5mmol的高碘酸钠，所述高碘酸钠水溶液的初始浓度为0.3-0.6m；透明质酸的分子量为0.8-2×106 da。

9、所述搅拌时间为12-36 h，所述乙二醇的添加量以高碘酸钠的摩尔量为基准，每5mmol高碘酸钠加入1.5-3 ml乙二醇终止反应。

10、所述透析为在去离子水中透析2-4天，所述冷冻干燥的温度为﹣50℃-﹣20℃，时间为48-96 h。

11、所述步骤（2）中cts、epa、edc·hcl和nhs的质量比为1:0.25-0.68:0.2-0.52:0.06-0.15；所述乙酸水溶液的体积百分比为0.5%-2%。

12、所述步骤（3）中，cts混合液和epa混合液的体积比为3-8:1，避光搅拌的时间为12-36 h。

13、所述透析为先经透析袋在含不同比例乙醇的水溶液中逐步透析3天以去除未反应的epa及副产物，最后在去离子水中透析1天。

14、所述步骤（4）中oha水溶液的质量浓度为2%-5%，cts-epa的乙酸溶液的质量浓度为1%-3%；oha水溶液和cts-epa的乙酸溶液的体积比为1:1。

15、本发明提供了利用所述的制备方法制备得到的ha-cts-epa自愈合水凝胶。

16、所述ha-cts-epa自愈合水凝胶是由醛基化透明质酸与epa接枝壳聚糖动态交联形成席夫碱键得到的。

17、本发明还提供了所述的ha-cts-epa自愈合水凝胶在制备治疗骨关节炎药物中的应用。

18、本发明产生的有益效果是：

19、1. 本发明制备的ha-cts-epa水凝胶表现出快速成胶、可注射、剪切变稀与多次自愈合的动态网络特征，形成均一多孔结构并实现epa的持续释放，同时在离体冲刷与运动模拟中保持良好黏附与驻留。于氧化与炎症刺激下，该材料降低细胞内及线粒体ros负荷并缓解线粒体功能受损，伴随nf-κb级联活化与核转位减弱，从而使促炎介质与基质降解表型受抑并促进软骨稳态相关分子回归。bmscs在凝胶三维微环境中表现出更好的存活与抗凋亡能力，且在炎症背景下更能维持成软骨相关表达与基质合成；ros回补可削弱上述保护效应并部分恢复nf-κb活化与分化受损表型。动物实验中，凝胶递送显著延长外源bmscs在关节腔内的滞留并降低局部凋亡信号，联合治疗在软骨形态与软骨下骨微结构层面均显示更一致的改善，同时组织原位氧化应激与炎症标志物下降并伴随nf-κb通路抑制和抗氧化系统增强。

20、2. 本发明提出并验证了一个可转化的oa联合治疗范式：以可注射自愈合ha-cts-epa水凝胶作为“结构性递送平台+主动微环境调节器”，通过降低ros并抑制nf-κb过度激活，增强bmscs在关节腔的滞留、生存与成软骨功能，最终改善软骨及软骨下骨结构。其科学意义在于把oa中广泛讨论但常被分散处理的氧化应激与炎症放大，整合为可干预的ros/nf-κb轴，并用因果回补实验强化了“ros为上游关键事件”的证据链，从而建立“材料-微环境-细胞功能-组织修复”的递进机制闭环。本发明制备的ha-cts-epa水凝胶体系具备关节腔注射友好、驻留能力强、无需外源复杂器械的潜力，有望用于提升细胞治疗的可重复性并减少给药频次；同时epa作为生物活性脂肪酸在安全性认知上相对友好，水凝胶成分与降解路径也更易进入监管讨论框架。该策略具备可注射、局部驻留与细胞联合治疗的临床转化潜力，有望为oa提供更可控、更持久的疾病改善型干预路径。