一种双层产氢人工皮肤及其制备方法和应用

本发明属于生物医用材料组织工程皮肤，具体涉及一种双层产氢人工皮肤及其制备方法和应用。

背景技术：

1、糖尿病创面是一类典型的慢性难愈合创面，其发生发展与高糖刺激、持续性炎症、氧化应激、血管生成障碍、细胞代谢紊乱和细胞外基质重塑异常密切相关。在糖尿病病理微环境下，创面局部细胞普遍存在线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位下降、atp生成不足、活性氧水平升高、氧化磷酸化受损以及细胞修复功能减弱。线粒体功能障碍不仅限制角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞的正常功能，还会进一步放大氧化应激和炎症反应，从而导致创面长期停滞于炎症期并难以进入有效再生阶段。

2、近年来，外源线粒体移植作为一种细胞代谢干预策略，已被用于改善受损细胞的能量代谢状态。通过向病变组织或受损细胞递送功能性线粒体，可在一定程度上恢复细胞氧化磷酸化能力，提高atp生成水平，并促进组织修复。然而，在糖尿病创面等高度氧化应激和慢性炎症微环境中，外源线粒体在递送后容易受到活性氧、炎症因子、高糖刺激和蛋白酶环境的影响，导致其结构稳定性下降、膜电位丧失、细胞摄取效率降低和功能维持时间缩短。因此，如何在病理创面环境中保护外源线粒体，并提高其组织保留、细胞摄取和功能发挥效率，是限制线粒体治疗用于慢性创面修复的重要问题。

3、仿生人工皮肤具有局部滞留、空间分区及组织整合等特点，理论上可作为外源线粒体的局部递送载体。现有研究已采用甲基丙烯酰化丝素蛋白（silma）、甲基丙烯酰化胶原蛋白（colma）及改性透明质酸等生物材料，结合光交联、数字光处理（dlp）3d打印等技术构建具有表皮层和真皮层的双层仿生人工皮肤。其中，丝素蛋白具有适宜的力学性能和屏障支撑作用；胶原蛋白作为细胞外基质的主要组成成分，具有良好的生物相容性及组织整合潜力，能够为细胞和外源线粒体提供更接近天然真皮的局部微环境，二者适于构建具有分层结构的仿生支架。然而，现有人工皮肤主要着眼于创面覆盖、结构支撑、细胞负载及组织修复，通常未针对外源线粒体在糖尿病创面中的稳定负载和功能维持进行专门设计。糖尿病创面局部持续存在的氧化应激、炎症反应及代谢紊乱，容易造成外源线粒体结构损伤、膜电位下降及生物能量功能衰减，从而限制线粒体移植的治疗效果。

4、因此，亟需开发一种既能实现外源线粒体局部负载和稳定递送，又能改善创面氧化应激微环境、维持线粒体结构及生物学功能的人工皮肤支架。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题为：现有外源线粒体在糖尿病创面高糖、高氧化应激和慢性炎症微环境下存在稳定性差、膜电位易丧失、atp生成能力下降、细胞摄取效率低以及功能维持时间短等问题，影响外源线粒体的治疗效果。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种双层产氢人工皮肤，所述双层产氢人工皮肤包括设置于远离创面床一侧的表皮样产氢保护层，设置于靠近创面床一侧的真皮样线粒体递送层；所述真皮样线粒体递送层在表皮样产氢保护层上原位形成，并与表皮样产氢保护层形成层间结合结构。

3、其中，上述双层产氢人工皮肤中，所述的表皮样产氢保护层silma/mcc包括甲基丙烯酰化丝素蛋白silma网络以及固定或包埋于所述silma网络中的高温煅烧处理后的微晶纤维素衍生产氢纳米材料mcc。

4、其中，上述双层产氢人工皮肤中，所述真皮样线粒体递送层包括甲基丙烯酰化胶原colma网络，并负载有外源线粒体。

5、在上述双层产氢人工皮肤中，表皮样产氢保护层释放的氢气可以向真皮样线粒体递送层扩散，并在真皮样线粒体递送层内形成线粒体保护性微环境，从而降低病理创面微环境对外源线粒体造成的氧化损伤，提高外源线粒体的膜电位维持能力、atp生成能力、细胞摄取效率和组织修复效能。

6、本发明所述的双层产氢人工皮肤，产氢纳米材料仅分布于表皮样产氢保护层中，真皮样线粒体递送层中不含产氢纳米材料。通过空间隔离，可降低产氢纳米材料与外源线粒体直接接触所造成的不利影响，同时保证氢气分子能够通过扩散方式进入胶原真皮层并发挥线粒体保护作用。

7、其中，所述的产氢纳米材料包括镁基产氢纳米材料、硅基产氢纳米材料、钙基产氢纳米材料、金属氢化物纳米材料、具有压电产氢功能的纳米材料、富氢纳米材料或其复合纳米材料中的一种或多种。所述产氢纳米材料可通过物理包埋、表面吸附、化学交联、微囊化、涂覆、浸渍或原位固定方式负载于表皮样产氢保护层中。

8、本发明所述的双层产氢人工皮肤，所述表皮样产氢保护层为甲基丙烯酰化丝素蛋白/微晶纤维素（silma/mcc）复合层，其中silma构成表皮样保护层基质，高温煅烧处理后的mcc产氢纳米材料固定或包埋于silma网络中；所述真皮样线粒体递送层为colma层，外源线粒体通过吸附、包埋、浸润或胶原网络滞留方式负载于colma层中。

9、优选的，所述的外源线粒体来源于干细胞、脂肪来源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、角质形成细胞、诱导多能干细胞来源细胞或其他供体细胞。所述外源线粒体可以通过差速离心法、密度梯度离心法、商业线粒体提取试剂盒、微流控分离法或细胞挤出法获得。

10、优选的，所述外源线粒体在真皮样线粒体递送层成型后负载，或在不影响外源线粒体膜电位和结构完整性的温和条件下与真皮层前体混合后负载。优选地，所述外源线粒体的负载过程不经过高温、有机溶剂、强氧化交联剂或长时间强光照处理，以减少制备过程对外源线粒体功能的损伤。

11、进一步的，所述的真皮样线粒体递送层还可负载线粒体增强细胞。所述线粒体增强细胞为预先摄取、融合或负载外源线粒体后的治疗性细胞，包括线粒体增强巨噬细胞、线粒体增强成纤维细胞、线粒体增强间充质干细胞、线粒体增强内皮细胞或其组合。

12、本发明第二方面，还提供了一种上述双层产氢人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：

13、a、制备表皮样产氢保护层前体材料；

14、将甲基丙烯酰化丝素蛋白溶解到溶剂中，得到silma前体溶液，将微晶纤维素先经无机酸处理，再进行高温煅烧，将煅烧所得缺陷工程化mcc产氢纳米材料加入silma前体溶液中，其中silma干物质与缺陷工程化mcc的重量比为100:2～6，均匀分散，得到silma/mcc表皮层前体混合液；

15、b、制备 silma/mcc表皮样产氢保护层；

16、将步骤a所得silma/mcc表皮层前体混合液倒入模具，使液层厚度为1～3 mm，25～37 ℃条件下干燥，得到厚度为100～200 µm的silma/mcc表皮样产氢保护层；

17、c、在silma/mcc表皮样产氢保护层上原位构建colma真皮样线粒体递送层；

18、将甲基丙烯酰化胶原colma溶解于溶剂中，得到colma前体溶液，向其中加入光引发剂并搅拌均匀；随后将其倒入步骤b中含有已成型silma/mcc表皮样产氢保护层的模具中，使colma前体溶液覆盖于表皮层一侧并形成厚度为1～3 mm的液层，在界面区域预浸润10～30 min后进行温和光照交联，得到colma真皮样线粒体递送层；

19、d、将外源线粒体负载于colma真皮样线粒体递送层中；

20、向步骤c得到的colma真皮样线粒体递送层中滴加外源线粒体悬液，并于4～20℃、避光条件下孵育10～30 min，从而形成负载外源线粒体的双层产氢人工皮肤。

21、其中，步骤a所述溶剂为pbs、生理盐水、无菌去离子水或其他生理相容性溶液中的至少一种。

22、其中，步骤a所述无机酸为盐酸与浓硫酸混合酸，体积比为1:10。所述微晶纤维素经无机酸处理时，微晶纤维素与无机酸的固液比为50 g∶1000 ml，处理温度为60℃，处理时间为2 h。

23、其中，步骤a所述高温煅烧温度为200～300℃，时间为1～3 h；优选为温度250℃，煅烧时间1.5 h；升温速率为5～10℃/min，优选5℃/min。优选的，煅烧在空气、氮气、氩气或其他惰性气氛中进行。

24、其中，步骤a中所述分散方法包括搅拌、超声或其他分散方式，只要能使得缺陷工程化mcc均匀分散于silma前体溶液中的方式均可。

25、在本步骤中，通过超声与高温煅烧，有利于形成具有超声响应产氢能力的缺陷结构和表面活性位点，并改善mcc在silma网络中的均匀分散和固定。

26、其中，上述双层产氢人工皮肤的制备方法中，步骤b所述干燥成型采用自然干燥、光交联、物理成型、冻干成型或干燥成膜中的一种或多种组合方式。

27、优选的，步骤b所述自然干燥后采用乙醇处理2h。自然干燥可以形成膜状或支架状结构，乙醇处理后可以诱导silma中丝素蛋白形成稳定的β-sheet结构，该方式可以在不依赖长时间光照的条件下提高表皮样产氢保护层的湿态稳定性和力学完整性，并将mcc产氢纳米材料稳定限制于silma网络中。乙醇处理诱导形成的β-sheet结构能够提高silma/mcc表皮层的湿态稳定性，并降低mcc在水性或创面环境中的迁移和脱落，使mcc主要分布于表皮样产氢保护层中，从而避免其与后续负载的外源线粒体直接接触。

28、制备silma/mcc表皮样产氢保护层时，表皮层厚度会影响mcc负载量、氢气扩散距离及双层人工皮肤的整体柔韧性，本发明经过大量试验，最终确定了液层厚度为1～3 mm，以保证干燥后厚度为100～200 µm，此时的silma/mcc表皮样产氢保护层柔韧性更好。

29、本发明制备的silma/mcc表皮样产氢保护层可以在超声的刺激下触发产氢，刺激产氢使用的超声频率为0.8～1.2 mhz，声强为0.3～1.0 w/cm²，占空比为20%～50%，单次作用时间为1～5 min；优选频率为1.0 mhz、声强为0.7 w/cm²、占空比为50%、单次作用时间为2 min，并采用超声1 s、间歇1 s的脉冲制度。超声处理过程中，人工皮肤支架及其周围培养液或创面组织的温度优选不高于39 ℃，更优选不高于37 ℃。

30、其中，步骤c所述溶剂为pbs、细胞培养基、生理盐水或其他生理相容性溶液中的至少一种。

31、其中，步骤c所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，其浓度为colma与silma总质量的0.5 %。

32、其中，步骤c所述温和光照交联的光照波长为365～405 nm，光照强度为10～100mw/cm²，光照时间为10～180 s；优选地，光照波长为375～395 nm，光照强度为30～80 mw/cm²，光照时间为30～120 s；更优选地，光照波长为385 nm，光照强度为60 mw/cm²，光照时间为60 s。

33、本发明通过界面预浸润和原位光交联，colma与silma中的甲基丙烯酰基在界面区域共同参与自由基聚合，形成界面交联结构或化学键连接，使两层形成稳定结合而非简单物理贴合，并降低使用过程中发生层间剥离的风险。

34、其中，步骤d所述外源线粒体分离自供体细胞，包括脂肪来源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、角质形成细胞或其他具有功能性线粒体的细胞中的至少一种。

35、其中，步骤d所述外源线粒体的分离方法包括差速离心法、密度梯度离心法、商业线粒体提取试剂盒、微流控分离法或细胞挤出法的至少一种。分离后的外源线粒体重悬于pbs、无血清培养基、线粒体保存液或其他线粒体相容性溶液中，得到外源线粒体悬液。

36、其中，步骤d所述外源线粒体加入量为：每片直径6 mm、厚度1 mm的人工皮肤加入以线粒体蛋白计10～40 μg的外源线粒体。

37、外源线粒体滴加后，通过浸润、吸附、扩散和胶原网络滞留等方式进入colma真皮样线粒体递送层中。

38、本发明在成胶后对外源线粒体悬液进行低温避光负载，能够避免线粒体直接经历光交联、自由基反应或交联剂处理，减少其膜电位、嵴结构完整性和atp生成能力的损失，同时提高其在colma网络中的滞留。整个负载过程避免高温、有机溶剂、强氧化交联剂、长时间强光照或剧烈机械剪切。

39、本发明制备得到的上述双层产氢人工皮肤，在使用时，silma/mcc表皮样产氢保护层中的mcc产氢纳米材料持续释放氢气，所释放的氢气向colma真皮样线粒体递送层及创面床扩散，在外源线粒体所处区域形成线粒体保护性微环境，从而降低糖尿病创面高糖、高ros和慢性炎症环境对外源线粒体造成的氧化损伤，提高外源线粒体的膜电位维持能力、atp生成能力、细胞摄取效率和组织修复效能。

40、本发明第三方面，提供了一种上述双层产氢人工皮肤在制备提高外源线粒体移植效率的产品中的应用。

41、具体的，提高外源线粒体移植效率包括提高外源线粒体在病理微环境中的膜电位维持能力、atp生成能力、结构及功能稳定性、局部滞留率、受体细胞摄取率和功能维持时间中的至少一种。

42、本发明第四方面，提供了一种上述双层产氢人工皮肤在制备创面修复产品中的应用。

43、具体的，所述的创面修复包括糖尿病创面修复、慢性难愈合创面修复、缺血性创面修复、放射性损伤创面修复、感染后创面修复或其他线粒体功能障碍相关创面修复。

44、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

45、第一，本发明构建了一种面向外源线粒体移植的双层产氢人工皮肤。该体系并非单纯依赖产氢材料清除创面活性氧，也并非单纯递送外源线粒体，而是通过 silma/mcc表皮样产氢保护层持续释放氢气，在colma真皮样线粒体递送层内形成线粒体保护性微环境，从而提高外源线粒体在糖尿病创面病理微环境中的稳定性和移植效率。

46、第二，本发明通过双层空间分区设计实现了产氢功能与线粒体递送功能的协同配合。产氢纳米材料被限制于表皮样产氢保护层中，外源线粒体被负载于靠近创面床的colma真皮样线粒体递送层中。该结构既保证氢气能够跨层扩散至 colma真皮层和创面局部，又避免产氢纳米材料及其局部反应环境与外源线粒体直接接触；由此，表皮层的持续产氢保护与真皮层的线粒体滞留递送不是简单叠加，而是在空间隔离条件下共同维持外源线粒体的膜电位和atp生成能力、降低线粒体ros，并促进受体细胞摄取。实施例中，通过设置游离外源线粒体、非产氢双层人工皮肤负载线粒体、含mcc但无超声处理的双层人工皮肤以及含mcc且经超声处理的双层人工皮肤等对照，可区分载体效应、超声效应、mcc材料效应和超声响应产氢效应；在所述实施条件下，产氢双层人工皮肤组的线粒体摄取阳性细胞比例为55%，相较于游离外源线粒体组或非产氢双层人工皮肤组提高约2.5倍，从而体现所述空间分区与产氢保护的协同技术效果。

47、第三，本发明能够提高外源线粒体的结构和功能稳定性。在糖尿病创面高糖、高ros和慢性炎症微环境下，外源线粒体容易发生膜电位下降、atp生成能力降低和氧化损伤。本发明通过表皮层持续产氢，在胶原真皮层内形成低氧化应激微环境，可减少外源线粒体膜电位丧失、线粒体ros升高、嵴结构破坏和功能衰减，从而提高外源线粒体的atp生成能力和代谢调控作用。

48、第四，本发明能够提高外源线粒体的局部滞留和有效递送效率。colma真皮样线粒体递送层能够通过胶原样网络吸附、浸润和滞留外源线粒体，使其在靠近创面床的一侧保留；同时，silma/mcc表皮样产氢保护层释放的氢气可在外源线粒体释放、滞留和被创面细胞摄取过程中维持其功能状态，从而提高外源线粒体在创面组织中的保留率、受体细胞摄取率和功能发挥时间。

49、第五，本发明能够改善糖尿病创面中的氧化应激、炎症反应和线粒体功能障碍。产氢纳米材料释放的氢气可降低过量活性氧水平、抑制脂质过氧化、减轻炎症损伤，并改善创面局部细胞的线粒体功能；外源线粒体则能够为受损细胞提供代谢支持，改善atp生成不足和能量代谢紊乱。二者通过双层人工皮肤实现功能协同，从而促进创面细胞代谢恢复和组织再生。

50、第六，本发明可促进糖尿病创面修复过程中的血管生成、胶原沉积、再上皮化和创面闭合。通过“氢气保护-线粒体功能维持-细胞代谢恢复-组织修复增强”的连续作用，本发明能够为糖尿病创面、慢性难愈合创面及其他线粒体功能障碍相关创面提供新的人工皮肤材料体系和治疗策略。