一种用于糖尿病足创面修复的多酶级联水凝胶及其制备方法和应用

本发明属于纳米生物医药材料，具体涉及一种具有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶三重模拟酶活性的多酶级联水凝胶，及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡药物或医用敷料中的应用。

背景技术：

1、糖尿病（diabetes mellitus）是一种以血糖水平持续升高为特征的慢性代谢性疾病。全球成人糖尿病患者人数已超过8亿，自1990年以来增加了4倍多，预计到2050年将达到13亿。在与糖尿病相关的各种并发症中，糖尿病创面（dws），尤其是糖尿病足溃疡（dfus），因其复杂性和愈合不良而成为临床面临的重大挑战。 dfu愈合困难的核心病理机制包括：（1）创面局部持续高血糖环境导致晚期糖基化终末产物积累，诱发强烈的氧化应激反应，造成活性氧（ros）过度生成，引发级联炎症；（2）反复的细菌感染形成生物膜，进一步加剧炎症并阻碍组织再生；（3）局部血管病变导致缺血缺氧，新生血管形成受阻。针对上述复杂病理机制，多酶级联纳米酶体系展现出独特的治疗优势。金纳米粒子（aunps）已被证明具有葡萄糖氧化酶（gox）样功能，能够催化氧化创面局部葡萄糖生成葡萄糖酸和h2o2；ceo2纳米粒子具有过氧化氢酶（cat）和过氧化物酶（pod）双重酶活，可催化h2o2生成羟基自由基（·oh）杀菌或分解生成o2改善缺氧；沸石咪唑盐框架-8（zif-8）在酸性感染微环境下分解并缓慢释放zn²⁺，有利于加快伤口愈合且具有抑菌作用。羧甲基壳聚糖是一种常见的壳聚糖衍生物，具有良好的水溶性、生物相容性和抗菌活性，因此被广泛应用于伤口敷料。然而，现有技术仍存在以下缺陷：（1）多酶活性位点空间分布无序，底物传质效率低，级联反应效率不高，现有纳米酶体系大多通过物理混合方式组合各功能组分，协同效应较弱，且缺乏对创面不同愈合阶段的微环境响应性；（2）功能集成度不足, 现有水凝胶大多仅负载单一或少数几种活性成分，难以对糖尿病创面复杂的病理微环境（氧化应激、细菌感染、组织缺氧、血糖升高等）进行系统性的协同调控；（3）现有纳米酶缺乏可注射、自愈合等多功能水凝胶递送载体，难以在创面部位实现长效滞留和按需释放。（4）碳量子点来源单一。 植物源功能性碳量子点在糖尿病创面敷料中的应用仍较有限，黄芪多糖源碳量子点与多酶样级联系统协同构建的研究和应用仍有进一步拓展空间。因此，开发一种能够将多酶级联纳米酶、黄芪源性碳量子点和多功能水凝胶载体有机整合的新型递送系统，对于糖尿病足溃疡的高效治疗具有重要的临床意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种糖尿病足创面修复用多酶级联水凝胶，旨在解决现有技术中多酶活性位点空间分布无序、底物传质效率低、级联反应效率不高、功能集成度不足以及缺乏可注射自愈合递送载体等问题。

2、 为实现上述目的，本发明提供一种糖尿病足创面修复用多酶级联水凝胶，将ceo2@zif-8/au 级联纳米酶、黄芪多糖来源碳量子点以及可注射粘附型双交联水凝胶载体进行一体化构建。其中，ceo2@zif-8/au 级联纳米酶与黄芪多糖来源碳量子点共同分散于由甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖（cmcsma）、多巴胺修饰透明质酸（ha-da）和氧化葡聚糖（odex）形成的双交联水凝胶网络中。

3、所述核壳表面负载型金铈级联纳米酶以ceo2纳米粒子为核、zif-8为壳层，金纳米粒子（aunps）锚定负载于zif-8壳层外表面。所述ceo2纳米粒子具有过氧化氢酶（cat）和过氧化物酶（pod）双重模拟酶活性，所述aunps具有葡萄糖氧化酶（gox）模拟酶活性。所述纳米酶同时具有gox、cat和pod三重模拟酶活性，能够催化级联反应：aunps催化葡萄糖氧化生成h2o2，ceo2纳米粒子进一步催化h2o2分解生成·oh（杀菌）和/或o2（改善缺氧）。

4、所述水凝胶通过席夫碱反应（cmcsma的氨基与0dex的醛基）和光交联（cmcsma上的甲基丙烯酰胺基团在光引发剂存在下经蓝光照射聚合）双重交联成型。

5、作为上述技术方案的进一步描述：

6、所述ceo2纳米粒子动态光散射水合粒径为247.87±0.74 nm，多分散系数为0.047±0.020。所述cez的水合粒径为412.77±2.19 nm，多分散系数为0.116±0.043。所述cez@au的水合粒径为445.03±12.73 nm，多分散系数为0.173±0.023。

7、作为上述技术方案的进一步描述：

8、所述黄芪多糖碳量子点的透射电镜粒径为3.0~5.0 nm，场发射透射电镜晶面间距为0.21 nm，对应于石墨烯的（100）面内晶格。

9、本发明的第二目的在于提供一种促进糖尿病足创面愈合的敷料的制备方法，包括以下步骤：

10、（一）核壳表面负载型金铈级联纳米酶（cez@au）的合成：

11、（1）二氧化铈纳米颗粒的合成：将2 g硝酸铈六水合物、800 mg聚乙烯吡咯烷酮（pvp，m.w. = 40000，高纯级k30）和4 ml超纯水分散于60 ml乙二醇中，在室温下搅拌30min。然后将上述混合物在160°c加热8 h，冷却至室温后，离心分离，用超纯水和无水乙醇纯化。将所得固体干燥，并在300°c下在马弗炉中进一步煅烧1 h，得到淡黄色的二氧化铈（ceo2）纳米颗粒。

12、（2）zif-8壳层包覆：将50 mg步骤（1）所得ceo2纳米颗粒添加到10 ml浓度为2.44m的2-甲基咪唑甲醇溶液中（含2 g 2-甲基咪唑），超声混合30 min将混合物分散。然后在室温下将10 ml含71.4 mg硝酸锌六水合物的甲醇溶液（24 mm）快速倒入上述混合物中，反应5min，通过离心收集固体，用乙醇纯化3次，进一步在真空中干燥过夜，得到ceo2@zif-8核壳纳米颗粒（cez）。

13、（3）金纳米颗粒锚定：将20 mg步骤（2）所得ceo2@zif-8纳米颗粒分散于20 ml甲醇中，加入50 μl四氯金酸三水合物甲醇溶液（50 mm），并补加50 μl甲醇。以600 rpm将反应混合物搅拌30 min。以12000 rpm离心10 min，将沉淀重悬于10 ml甲醇中。然后添加2.5 mg硼氢化钠，反应至溶液变为酒红色。产物经甲醇洗涤、离心（12000 rpm，10 min）、真空干燥过夜，得到核壳表面负载型金铈级联纳米酶（cez@au）。

14、（二）黄芪多糖碳量子点（cds）的合成：采用一步水热法合成cds。将2 g黄芪多糖和20 ml水置于100 ml水热反应釜中。将反应釜在180°c加热8 h。反应液冷却至室温后，依次通过10000 rpm离心10 min和0.22 μm微孔膜收集澄清液。将滤过的分散液置于500~1000da的透析袋中，透析2d，得到黄芪多糖碳量子点。

15、（三）甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖（cmcsma）的合成：在200 ml去离子水中添加2 g羧甲基壳聚糖（cmcs）粉末。待cmcs完全溶解后，缓慢加入2 ml甲基丙烯酸酐。在ph=8下用冰水将反应运行8 h，通过添加5 m naoh维持反应。使用透析膜（mw=8~14 kda）在4°c下对超纯水透析反应混合物4d，冻干，得到甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖。

16、（四）氧化葡聚糖（0dex）的合成：将5 g葡聚糖溶解于250 ml去离子水中，加入5 g高碘酸钠（naio4，0.023 mol），避光搅拌3.5 h。然后加入3 ml乙二醇，继续搅拌1 h。经透析（mw=8~14 kda）、冻干，得到氧化葡聚糖。

17、（五）多巴胺修饰的透明质酸（ha-da）的合成：取1 g透明质酸，加入90 ml去离子水，搅拌1~2 h溶解，静置消泡。调ph至5.5，加入1.16 g edc和0.86 g nhs，搅拌溶解，用于活化ha。在氮气气氛下缓慢滴加20 ml多巴胺（da）水溶液（含2.86 g da），室温搅拌反应24h，颜色由粉变褐色。用3500~7000 da透析袋透析5d，冻干，得到多巴胺修饰的透明质酸（ha-da）。

18、（六）（cez@au/cds）@h水凝胶的合成：将40 mg ha-da与200 μg cds溶解在650 μl去离子水中，用1 m naoh调ph至8，搅拌30 min。取1250 μl浓度为40 mg/ml的cmcsma，加入3mg苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐（lap），加入250 μl浓度为2 mg/ml的cez@au，搅拌溶解均匀后，与之前的ha-da溶液混合。加入375 μl浓度为40 mg/ml的0dex溶液，用1 mnaoh调ph至8。约60 s后，发生席夫碱反应，溶液逐渐变稠。经蓝光照射90s，制得h@cez@au/cds水凝胶。

19、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

20、 （1）本发明提供了一种核壳表面负载型金铈级联纳米酶（cez@au），其中ceo2纳米核在生理条件下具有过氧化氢酶（cat）和过氧化物酶（pod）双重酶样活性，可生成羟基自由基杀菌或生成o2改善缺氧；zif-8壳层在生理条件下稳定、在酸性环境下分解并缓慢释放zn²⁺，有利于加快伤口愈合且具有一定抑菌作用；表面锚定的aunps具有类葡萄糖氧化酶（gox）活性，能够催化氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和h2o2。三种功能组分协同形成具有cat、gox、pod三种酶样活性的级联纳米酶体系，此前未见报道。

21、（2）本发明以黄芪多糖为碳源，经水热碳化制备碳量子点，并将其作为功能组分引入复合水凝胶，与cez@au共同构成多功能复合体系。

22、（3）本发明水凝胶通过席夫碱反应和光交联反应双交联网络成型，具有稳定的三维网络结构和良好的可注射性（剪切稀化行为），可从5ml细针注射器中平稳挤出，注射后仍能保持凝胶结构，适用于不规则形状创面的填充。

23、（4）本发明水凝胶具有典型的蜂窝状微观多孔结构，有利于递送生物活性成分和提供充足的氧气；具有良好的溶胀性能，能够吸收创面渗出液；降解速率适中，约36 h内可完全降解，适合作为伤口敷料使用。

24、（5）本发明水凝胶在无任何外部刺激条件下即可实现自愈合，具有良好的组织粘附性能（与猪皮组织的粘附强度约为8.93 kpa），能够牢固附着于创面组织。