一种蒺藜叶总黄酮的制备方法及其应用

本发明属于天然药物化学和食品科学，具体涉及一种蒺藜叶总黄酮的制备方法及其在制备抗氧化产品中的应用。

背景技术：

1、蒺藜（

tribulus terrestris l.）为蒺藜科蒺藜属一年生或多年生草本植物，其根、茎、叶、花和果实均可入药，是传统的药食同源植物。现代药理学研究表明，蒺藜具有抗炎、抗氧化、保护心脑血管、抗肿瘤、降血糖等多种生物活性。蒺藜中的主要活性成分包括黄酮类、甾体皂苷类、生物碱类等，其中黄酮类化合物因其广泛的药理作用尤其是显著的抗氧化活性而受到关注。研究显示，蒺藜叶片中的黄酮类成分含量显著高于茎和果实，因此蒺藜叶是获取黄酮类活性成分的重要部位。

2、在天然产物领域，从不同植物中分离具有抗氧化活性的黄酮类化合物已有报道。例如，中国专利cn113087752a公开了一种从沙田柚中分离得到的具有抗氧化活性的黄酮糖苷——芹菜素-4′-o-β-d-葡萄糖基-7-o-α-l-鼠李糖基-(1→2)-[6″-o-(3-羟基-3-甲基戊二酰基)]-β-d-吡喃葡萄糖苷，并验证了其氧自由基清除能力。中国专利cn102659876a公开了从紫花碎米荠中提取的黄酮苷——山奈酚-3-o-[2″-o-β-d-吡喃葡萄糖基-6″-o-(2″-o-阿魏酰基-β-d-葡萄糖基)]-β-d-吡喃葡萄糖苷，并发现其具有促进脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞增殖的免疫调节作用。中国专利cn110251552a公开了一种龙脚叶总黄酮的制备方法，采用95%乙醇提取、石油醚萃取、ods减压柱层析等步骤获得总黄酮，并从中分离得到山奈酚-3-o-β-d-龙胆二糖苷、槲皮素-3-o-β-d-龙胆二糖苷等黄酮类化合物，验证了其α-葡萄糖苷酶抑制活性及细胞安全性。

3、然而，上述现有技术中黄酮类化合物的来源分别为沙田柚、紫花碎米荠和龙脚叶，其化学成分与蒺藜叶分属于不同的植物来源，化学成分谱系存在差异。针对蒺藜叶黄酮类成分的提取纯化方法，现有文献报道多采用常规的醇提后大孔吸附树脂一次纯化，例如使用d101型大孔树脂、以不同浓度乙醇梯度洗脱的方式获得总黄酮。此类方法存在以下不足：一是选择性不高，黄酮类成分与皂苷类等其他极性相近的化合物难以有效分离；二是所获得的总黄酮中目标黄酮苷的含量较低，富集效果不理想；三是缺乏针对蒺藜叶中特定黄酮苷（如山柰酚-3-o-β-d-龙胆二糖苷等）的系统性制备工艺优化。此外，现有技术中对于蒺藜叶总黄酮中多种黄酮苷的同时含量测定方法以及单体黄酮化合物的抗氧化活性系统评价也较少见报道。

4、因此，开发一种能够从蒺藜叶中高效、选择性地富集黄酮类成分，特别是能够显著提高目标黄酮苷含量的制备方法，并建立相应的质量控制方法和抗氧化活性评价体系，对于蒺藜叶资源的深度开发利用具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中蒺藜叶总黄酮制备方法选择性不高、黄酮类成分与皂苷类等极性相近化合物难以有效分离、目标黄酮苷含量较低等不足，本发明提供了一种选择性好、富集效率高、操作简便的蒺藜叶总黄酮的制备方法及其在抗氧化领域的应用。

2、第一方面，本发明提供一种蒺藜叶总黄酮的制备方法，包括以下依次进行的步骤：

3、(a) 粉碎与提取：将蒺藜叶粉碎，加入体积分数为10%～30%的乙醇水溶液，按料液比1:20～1:30（g/ml）加热回流提取2～4次，合并提取液；

4、(b) 浓缩与稀释：将步骤(a)所得提取液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，得到稀释液；

5、(c) 一次大孔吸附树脂吸附：将步骤(b)所得稀释液以2～6 bv/h的上样速度通过ab-8型大孔吸附树脂柱，使黄酮类成分吸附于树脂上，然后用蒸馏水洗脱至流出液无色；

6、(d) 碱液洗脱：用浓度为0.05%～0.2%的naoh溶液、以6～10倍柱体积的用量洗脱步骤(c)所得树脂柱，收集碱洗脱液；

7、(e) 中和：用浓度为5%～15%的hcl溶液将步骤(d)所得碱洗脱液中和至ph值为6.5～7.5；

8、(f) 二次大孔吸附树脂吸附：将步骤(e)所得中和液以2～6 bv/h的上样速度再次通过ab-8型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱至流出液为中性；

9、(g) 醇洗脱：用体积分数为70%～95%的乙醇溶液、以7～11倍柱体积的用量洗脱步骤(f)所得树脂柱，收集醇洗脱液；

10、(h) 干燥：将步骤(g)所得醇洗脱液减压回收溶剂，干燥，即得蒺藜叶总黄酮。

11、进一步地， 步骤(a)中所述乙醇水溶液的体积分数优选为20%，所述料液比优选为1:25（g/ml），提取次数优选为3次，每次提取时间优选分别为1.5小时、1小时和0.5小时。

12、进一步地， 步骤(c)和步骤(f)中所述的上样速度优选为4 bv/h，所述ab-8型大孔吸附树脂在使用前优选经无水乙醇浸泡24小时进行预处理。

13、进一步地， 步骤(d)中所述naoh溶液的浓度优选为0.1%，洗脱用量优选为8倍柱体积。

14、进一步地， 步骤(e)中所述hcl溶液的浓度优选为10%，中和后的ph值优选为7.0。

15、进一步地， 步骤(g)中所述乙醇溶液的体积分数优选为90%，洗脱用量优选为9倍柱体积。

16、第二方面，本发明提供一种测定上述方法制备的蒺藜叶总黄酮中黄酮类成分含量的方法， 采用高效液相色谱-紫外检测法，同时测定蒺藜叶总黄酮中的槲皮素-3-o-β-d-龙胆双糖苷（j1）、山柰酚-3-o-β-d-龙胆双糖苷（j2）、异鼠李素-3-o-β-d-龙胆双糖苷（j3）、山柰酚-3-o-β-d-(6″-p-香豆酰基)葡萄糖苷（j4）和山柰酚-3-o-β-d-龙胆二糖苷-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷（j5）的含量。

17、进一步地， 所述高效液相色谱-紫外检测法的色谱条件为：色谱柱为c-18柱（4.6×250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水体系，梯度洗脱，检测波长为330 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为25℃。

18、进一步地， 所述梯度洗脱的程序为：0 min时甲醇-水体积比12:88，45 min时30:70，50 min时37:63，57 min时43:57，75 min时50:50，78 min时50:50，100 min时100:0。

19、第三方面，本发明提供上述方法制备的蒺藜叶总黄酮在制备自由基清除剂或抗氧化产品中的应用。

20、进一步地， 所述自由基为dpph自由基或abts阳离子自由基。

21、第四方面，本发明提供一种抗氧化组合物或功能食品， 包含上述方法制备的蒺藜叶总黄酮以及药学上或食品学上可接受的辅料。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、1、制备方法选择性高：本发明首次采用“低浓度碱液选择性洗脱+中和+二次大孔树脂吸附”的组合工艺，利用黄酮类成分与皂苷类等其他极性相近化合物在碱液中的溶解度差异，实现目标黄酮苷的高选择性富集。通过静态吸附实验比较了五种大孔吸附树脂（d-101、ab-8、hp-20、dm-301、d4020），结果表明ab-8型树脂对目标化合物j2的静态吸附量最高（409.47 µg/g），解吸率也较高（86.75%），具有最佳的综合性能。

24、2、总黄酮得率高、纯度高：采用优化后的提取条件（20%乙醇、料液比1:25、提取3次、时间分别为1.5h、1h、0.5h）和纯化条件（0.1% naoh洗脱8 bv、中和后二次吸附、90%乙醇洗脱9 bv），所制得的蒺藜叶总黄酮中五种代表性黄酮单体（j1~j5）的总含量达34.94%，其中j2含量高达13.90%，富集效果显著优于现有方法。

25、3、质量控制方法完善：建立了同时测定蒺藜叶总黄酮中5种黄酮单体的hplc-uv方法，方法学验证结果表明，各化合物在给定浓度范围内线性关系良好（r2均大于0.99），精密度、重复性、稳定性的rsd均小于3%，加样回收率在94%～101%之间，该方法灵敏度高、重现性好，可作为蒺藜叶总黄酮的质量控制标准。

26、4、抗氧化活性显著：dpph自由基清除实验结果表明，蒺藜叶总黄酮及单体化合物j1的ic50值分别为1.266 µg/ml和1.128 µg/ml，均优于阳性对照维生素c（ic50=1.823 µg/ml）；abts自由基清除实验结果表明，j1的ic50值为0.028 mg/ml，蒺藜叶总黄酮的ic50值为0.111 mg/ml，清除效果均高于维生素c。实验数据充分证实了蒺藜叶总黄酮及其中的黄酮单体具有良好的抗氧化活性，具备开发为天然抗氧化剂或功能食品的潜力。