一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶及其制备方法和应用

本发明涉及生物医疗，尤其涉及一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、骨性关节炎是一种以软骨破坏和软骨退变为主的退行性关节疾病，全球患者人数持续增长，预计到2050年将接近10亿人，严重危害中老年群体生活质量。

2、目前临床主要采用氨基葡萄糖、非甾体抗炎药及糖皮质激素等药物缓解临床症状，但上述药物仅能对症处理，无法阻断疾病进展，且长期使用存在明显副作用；外科关节置换手术创伤大、费用高，患者接受度有限。oa发病机制与关节腔内氧化应激水平失衡密切相关，活性氧过量积累导致软骨细胞凋亡、细胞外基质降解及软骨退变。现有纳米酶递送系统虽在抗氧化治疗中初见成效，但仍面临生物利用度低、关节腔清除快、难以靶向软骨细胞及深层渗透等技术瓶颈。传统铁基纳米酶催化效率有限，且现有载体缺乏软骨靶向特异性，无法实现抗氧化与软骨修复的协同作用。此外，壳聚糖等天然载体在中性环境中溶解性差、抗氧化能力不足，限制了其临床应用。

3、因此针对上述问题现在提出一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、为了弥补以上不足，本发明提供了一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶及其制备方法和应用，旨在改善现有技术面临生物利用度低、关节腔清除快、难以靶向软骨细胞及深层渗透等技术瓶颈，传统铁基纳米酶催化效率有限，且现有载体缺乏软骨靶向特异性，无法实现抗氧化与软骨修复的协同作用，壳聚糖等天然载体在中性环境中溶解性差、抗氧化能力不足，限制了其临床应用的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，包括硒化壳聚糖载体、负载于所述硒化壳聚糖上的钌纳米酶以及通过共价键修饰于硒化壳聚糖负载钌纳米酶表面的硫酸软骨素；所述硫酸软骨素通过分子链上的羧基与硒化壳聚糖分子链上的氨基经edc/nhs活化形成酰胺键偶联，得到硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，记为sec@ru@cs。

4、作为本发明的一个优选，所述钌纳米酶为粒径小于20 nm的钌纳米颗粒，具有类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶和类过氧化物酶活性；所述硒化壳聚糖中硒元素以硒酸酯或硒杂环形式接枝于壳聚糖分子链的氨基或羟基上。

5、作为本发明的一个优选，硫酸软骨素成功接枝的表征为：产物zeta电位由硒化壳聚糖负载钌纳米酶的正电位转变为负电位；ft-ir谱图中在1640～1660 处出现酰胺ⅰ带吸收峰、1540～1560 处出现酰胺ⅱ带吸收峰；通过苯酚-硫酸法测定接枝cs含量，钌负载量通过icp-ms测定，硒含量通过紫外分光光度法或icp-ms测定。

6、本发明还提供一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

7、步骤1：制备钌纳米酶runps，将rucl3·nh2o和naac溶解于乙二醇中，加入pvp，转移至聚四氟乙烯衬里不锈钢高压釜中于90℃加热12 h，离心收集沉淀，用乙醇/水体积比70%的混合溶剂洗涤3次，得runps混悬液；

8、步骤2：制备硒化壳聚糖sec，将壳聚糖于超纯水中充分溶胀，加入冰乙酸形成透明溶液，缓慢加入亚硒酸钠水溶液，常温反应2 h，加入无水乙醇沉淀、洗涤，取沉淀于-80℃预冻后冻干，得硒化壳聚糖sec；

9、步骤3：制备硒化壳聚糖负载钌纳米酶sec@ru，将runps混悬液加入步骤2溶胀后的壳聚糖溶液中，充分搅拌1～2 h，加入冰乙酸形成透明溶液，再加入亚硒酸钠水溶液常温反应2 h，乙醇沉淀、洗涤、-80℃预冻、冻干，得sec@ru；

10、步骤4：硫酸软骨素羧基活化，将硫酸软骨素cs溶于mes缓冲液中，加入edc·hcl和nhs，室温搅拌活化20～40 min，得活化cs溶液；

11、步骤5：共价偶联，将sec@ru分散于pbs缓冲液中，超声5～10 min使sec@ru均匀分散，将步骤4所得活化cs溶液缓慢滴加至sec@ru分散液中，室温避光反应8～16 h，反应过程控制ph 5.5～6.0；反应结束后离心收集产物，去离子水洗涤，透析除去未反应物后冻干，得硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶sec@ru@cs。

12、作为本发明的一个优选，步骤2和步骤3中所述壳聚糖为中粘度壳聚糖，黏度200～400 mpa·s；冰乙酸加入量为每50 ml壳聚糖水溶液加入1 ml冰乙酸；亚硒酸钠用量为每1g壳聚糖对应1.33 g na2seo3溶于1 ml超纯水；步骤4中cs、edc·hcl和nhs的质量比为100∶76.6∶46.0；步骤5中sec@ru与cs的质量比为1∶1。

13、作为本发明的一个优选，步骤5中离心条件为8000～12000 rpm离心10 min，透析袋截留分子量为8000～14000 da，透析时间24 h，每4 h换水一次。

14、本发明还提供一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶在制备治疗骨性关节炎药物或关节腔注射制剂中的应用，将所述sec@ru@cs复溶于生理盐水或pbs中，经关节腔注射给药，用于清除关节腔内活性氧、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨基质合成及减轻骨关节炎软骨破坏。

15、本发明具有如下有益效果：

16、1、本发明提供的硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶具有优异的软骨靶向性，利用硫酸软骨素作为cd44受体的特异性配体，通过酰胺化共价修饰牢固结合于载体表面，既保留了cs与软骨细胞表面cd44受体高效结合的生物活性，又避免了物理吸附易解离的问题，显著延长药物在关节腔内的滞留时间，实现抗氧化组分向软骨细胞的精准递送。

17、2、本发明纳米酶体系具备多重协同抗氧化与修复功能，粒径小于20 nm的钌纳米酶可高效清除oa微环境中的过氧化氢及羟基自由基，硒化壳聚糖中的硒元素与钌形成电子转移效应以维持钌的活性价态，协同发挥类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶及类过氧化物酶活性，同时硫酸软骨素降解后可提供软骨基质合成的原料，壳聚糖赋予体系良好的润滑性能，实现清除ros、保护软骨细胞、促进基质再生的一体化治疗。

18、3、本发明通过edc/nhs共价偶联工艺实现了cs在sec@ru表面的定向接枝，zeta电位由正转负及ft-ir酰胺键特征峰证实了结构的成功构建，在大鼠oa模型中治疗8周后，关节软骨表面光滑完整、糖胺聚糖沉积显著增加，软骨退变mankin评分显著降低，具备良好的临床转化应用前景。

1.一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，其特征在于，包括硒化壳聚糖载体、负载于所述硒化壳聚糖上的钌纳米酶以及通过共价键修饰于硒化壳聚糖负载钌纳米酶表面的硫酸软骨素；所述硫酸软骨素通过分子链上的羧基与硒化壳聚糖分子链上的氨基经edc/nhs活化形成酰胺键偶联，得到硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，记为sec@ru@cs。

2.根据权利要求1所述的一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，其特征在于，所述钌纳米酶为粒径小于20 nm的钌纳米颗粒，具有类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶和类过氧化物酶活性；所述硒化壳聚糖中硒元素以硒酸酯或硒杂环形式接枝于壳聚糖分子链的氨基或羟基上。

3.根据权利要求1所述的硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶，其特征在于，硫酸软骨素成功接枝的表征为：产物zeta电位由硒化壳聚糖负载钌纳米酶的正电位转变为负电位；ft-ir谱图中在1640～1660 处出现酰胺ⅰ带吸收峰、1540～1560 处出现酰胺ⅱ带吸收峰；通过苯酚-硫酸法测定接枝cs含量，钌负载量通过icp-ms测定，硒含量通过紫外分光光度法或icp-ms测定。

4.一种如权利要求1所述的硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2和步骤3中所述壳聚糖为中粘度壳聚糖，黏度200～400 mpa·s；冰乙酸加入量为每50 ml壳聚糖水溶液加入1 ml冰乙酸；亚硒酸钠用量为每1 g壳聚糖对应1.33 gna2seo3溶于1 ml超纯水；步骤4中cs、edc·hcl和nhs的质量比为100∶76.6∶46.0；步骤5中sec@ru与cs的质量比为1∶1。

6.根据权利要求4所述的一种硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶及其制备方法，其特征在于，步骤5中离心条件为8000～12000 rpm离心10 min，透析袋截留分子量为8000～14000 da，透析时间24 h，每4 h换水一次。

7.一种如权利要求1所述的硫酸软骨素修饰硒化壳聚糖负载钌纳米酶在制备治疗骨性关节炎药物或关节腔注射制剂中的应用，其特征在于，将所述sec@ru@cs复溶于生理盐水或pbs中，经关节腔注射给药，用于清除关节腔内活性氧、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨基质合成及减轻骨关节炎软骨破坏。