基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒传感系统及检测方法

1.本发明涉及病原生物检测技术领域，具体涉及一种基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒传感系统及检测方法。


背景技术：

2.纳米孔技术具有操作简单、单分子分辨率高、无标记传感等优点，近年来已成为一种很有前景的传感平台，广泛应用于dna测序、生物分子相互作用研究和生物分子检测。而在各类纳米孔中，玻璃管纳米孔因其超低的制造成本、良好的机械稳定性和可调节的孔径而受到越来越多的研究兴趣。
3.玻璃纳米孔的工作原理是通过连续监测纳米孔的离子电流，来测量和记录与目标分子易位相关的时间阻断电流，从而获得目标分子的浓度。然而，玻璃管纳米孔由于其自身较低的分辨率和选择性，要开发信号良好的传感器，面临两个重要的挑战：(1)目标分子难以直接产生信号；大多数生化分析物不够标准，无法产生足够好的易位信号，尤其是小尺寸的分析物，如寡核苷酸片段、肽和其他小分子，由于它们的尺度不匹配和与玻璃管的弱相互作用，仍然很难或无法通过玻璃纳米孔直接测量它们。(2)bsa等蛋白对检测的影响；蛋白质稳定剂如牛血清白蛋白(bsa)和重组白蛋白广泛存在于酶相关生化反应的商业反应缓冲液中，如果这些反应用于建立传感或信号放大策略，这将极大地恶化玻璃纳米孔的噪声水平，淹没分析物应产生的易位信号，导致实验失败。
4.为了克服这两个挑战，学界做了不少尝试：在信号产生问题上，研究人员尝试使用信号载体或放大/扩增手段来增加分析物的大小，如dna四面体、m13分子载体、杂交链式反应(hcr)反应、环介导等温扩增(lamp)反应等手段，增强目标分子与玻璃管纳米孔之间的相互作用力，来产生更好的易位信号。这些方法在一定程度上能克服难以直接产生信号的问题，但是目前为止，所选择的信号载体或者扩增手段的选择还不够优秀，信号载体的信号信噪比不够高，用扩增手段生成的产物也可能大小不均，使得信号虽然产生了，但是不够理想，增加了后续分析的难度；在bsa等蛋白的影响检测问题上，学界也有多种尝试，包括优化缓冲成分取代bsa，或反应后引入纯化步骤以去除bsa，或采用不含bsa的扩增手段来设计传感策略，如hcr或lamp，但这些方法要么需要花费额外的精力来优化商业反应缓冲液，要么需要增加额外的实验步骤和成本，要么只能与种类极其有限的生化反应兼容，因此也不能很好地解决bsa等蛋白影响检测的问题。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供一种基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒传感系统及检测方法，以dna立方体作为信号载体，并设计基于crispr/cas12a技术的dna立方体合成链的水解方案，用于目标物(乙肝病毒(hbv))的纳米孔技术检测。
6.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
7.一种基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒传感系统，其包括cas12a及其序列特
异性crrna，以及可自组装成dna立方体的六条单链dna。
8.作为本发明的优选实施方式，所述crrna的序列如seq id no.1所示。
9.作为本发明的优选实施方式，所述可自组装成dna立方体的六条单链dna的序列分别如seq id no.2-7所示。
10.一种基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒检测方法，包括以下步骤：
11.(1)将cas12a及其序列特异性crrna与组成dna立方体的一条或多条单链dna、待检测溶液混合并在反应缓冲液中孵育，得到反应液，加入组成dna立方体的其它剩余单链dna，退火处理后得到自组装溶液；
12.(2)将所述自组装溶液配制到纳米孔测试液中并进行测试，若观察到易位信号，说明所述待检测溶液中不存在hbv；若观察不到易位信号，说明所述待检测溶液中存在hbv。
13.作为本发明的优选实施方式，所述crrna的序列如seq id no.1所示。
14.作为本发明的优选实施方式，所述可自组装成dna立方体的六条单链dna的序列分别如seq id no.2-7所示。
15.作为本发明的优选实施方式，所述反应液中加入2条单链dna。
16.作为本发明的优选实施方式，所述2条单链dna的序列分别如seq id no.6-7所示。
17.本发明的技术原理为：
18.本发明提供固态纳米孔乙肝病毒传感系统中的dna立方体是一种具有严格三维折叠空间形态的核酸纳米结构，由六条单链dna组成(参见附图1)，其与玻璃纳米孔有很强的相互作用，可以产生超高(》50:1)信噪比(snr)的易位信号；即使在含有高浓度bsa的缓冲液中，由于其强大的抗干扰能力，易位信号仍能保持。此外，由于dna立方体的严格折叠空间结构，当组成dna立方体的六条单链被水解掉一部分时，dna立方体的空间折叠结构就会被破坏，从而大大削弱其与纳米孔的相互作用，不产生任何过孔信号。在所述反应液中，如果目标hbv存在于待检测溶液中，它将特异性结合到crrna，激活溶液中cas12a的反式切割活性以及切割dna立方体单链元素；如果目标hbv在待检测溶液中不存在，cas12a将无活性，不会发生dna立方体元素的降解；在加入dna立方体的其它元素并对溶液进行退火处理后，只有当先加入的dna立方体元素未被切割时，dna立方体才能正确合成，从而在用玻璃管纳米孔传感器对其进行分析时产生易位信号，因此当待检测溶液中存在目标hbv时，先加入的dna立方体元素被完全切割，从而观察不到任何易位信号；反之，如果分析物中不存在hbv，则会出现大量信号。
19.本发明的有益效果为：
20.(1)本发明以dna立方体为信号载体分子，同时克服了现有技术中目标分子难以直接产生信号以及bsa等蛋白对检测的影响的问题，具体的，dna立方体具有结构的固定性，能产生具有超高的信噪比、且十分规整的信号，非常利于后续分析，即使在富含bsa或其它稳定性蛋白的缓冲液中仍然能产生良好的信号，使得不需要去额外优化反应缓冲或增加纯化步骤，这也使得玻璃管纳米孔传感策略的设计选择范围大大拓宽。
21.(2)基于crispr/cas12a的dna立方体组成dna链水解技术，能够对分析物hbv敏感，使得信号产生明显的变化，并且还可以与当前通用的扩增技术相兼容，在结合pcr扩增后，可达到5am的检测下限，且具有良好的选择性。
附图说明
22.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
23.图1是本发明实施例固态纳米孔乙肝病毒传感系统的dna立方体的组成合成图；
24.图2是本发明实施例检测方法的检测原理图；
25.图3是本发明实施例所述纳米孔的sem图像；
26.图4是本发明实施例玻璃管纳米孔的i-v曲线；
27.图5是本发明实施例存在不同组分时玻璃状纳米孔的电流痕迹(偏压为1000mv)；
28.图6是本发明实施例事件峰值高度分布直方图；
29.图7是本发明实施例在不含有bsa的缓冲液中几种不同信号载体的易位信号；
30.图8是本发明实施例在含有bsa的缓冲液中几种不同信号载体的易位信号；
31.图9是本发明实施例不同浓度bsa缓冲液中dna立方体的事件率(dna立方体的浓度均为30nm)；
32.图10是本发明实施例水解不同链数的事件率变化图(a为水解一条链，b为水解两条链，c为水解六条链，d为同时显示)；
33.图11是本发明实施例检测方法的校准曲线；
34.图12是本发明实施例检测方法加入pcr步骤后的校准曲线；
35.图13是发明实施例检测方法对不同病毒的事件率和易位记录(hbv为10am、hpv和hiv为100fm)。
具体实施方式
36.结合以下附图及实施例对本发明作进一步描述。
37.实施例：
38.本发明实施例提供的基于核酸立方体的固态纳米孔乙肝病毒传感系统，其包括cas12a及其序列特异性crrna，以及可自组装成dna立方体的六条单链dna；所述crrna的序列如seq id no.1所示；所述可自组装成dna立方体的六条单链dna的序列分别如seq id no.2-7所示。
39.本发明实施例提供的基于crispr/cas12a的dna立方体系统检测乙肝病毒的方法，包括如下步骤：
40.混合0.7μl cas12a(35nm)、3.6μl crrna(36nm)、2μl的待检测溶液、2μl 10x nebuffer 2.1和10.7μl超纯水，形成19μl溶液，溶液在37℃下培养10分钟完成对cas12a活化，然后，加入1μl的dna立方体e和f混合元素，在37℃下孵育切割1小时，切割后，加入5μl的其它dna立方体混合元素(a、b、c、d)、2μl 10x taemg缓冲液和13μl超纯水，形成总浓度为100nm的dna立方体自组装溶液，最后，将该溶液配制到纳米孔测试液(1m kcl，10mm tris，0.1mm edta，ph 8.0@25℃)中进行测试；
41.所述dna立方体元素a-f以及所述crrna的序列如下表所示：
[0042][0043][0044]
实验验证例
[0045]
dna立方体由六种不同的单链dna组成，其元素序列a-f如表所示。为了组装dna立方体，将6条100nm浓度的dna链加热至95℃5分钟，然后快速冷却至45℃并在taemg缓冲液(2.5mm mg(oac)2·
4h2o，4.5mm tris，0.2mm edta，ph 8.0@25℃)中保持20分钟，所述dna立方体在使用前在4℃下储存6小时以上。
[0046]
1、为了验证信号是由正确合成的完整dna立方体而不是反应溶液中其它成分或不完整dna立方体的易位引起的，发明人对样本中仅含有hbv、cas12a复合物或不完整的dna立方体的情形进行了电流脉冲验证实验；如图3-6所示：实验中使用的玻璃纳米孔直径通常约为12nm；当样本中仅含有hbv、cas12a复合物或不完整的dna立方体时，未发现易位事件，表明纳米孔对这些小尺寸生物分子是惰性的；相反，当溶液中存在完整的dna立方体时，可以观察到明显的易位事件，表明该信号只能由完整的dna立方体易位引起。
[0047]
2、发明人对比了不同信号载体(环状m13mp18单链dna、lambda dna、dna四面体和dna立方体)在含有/不含bsa的缓冲液中的信号，参见附图7-8，可以看出，只有dna立方体在含有bsa的缓冲中能保持良好的信号率，证明本方法所选择的信号载体的优势。此外，发明人探索了bsa浓度对dna立方体信号的影响，参见附图9，可以看出，bsa浓度提升，信号率会有一定提升，然后趋于稳定。
[0048]
3、优化了水解dna立方体的元素个数优化。参见图10，可以看出，切割2个元素的时候，斜率最大，事件率下降得最快，最为灵敏。
[0049]
4、实施例所述检测方法的灵敏度和选择性，参见附图11-12，可以看出，所述检测方法的校准曲线范围为0nm至1nm，加入pcr步骤后所述检测方法的校准曲线范围为0至100am。参见附图13，可以看出，只有当hbv存在时，易位事件数量才会显著减少。
[0050]
本发明上述实施例以dna立方体为信号载体分子，同时克服了现有技术中目标分子难以直接产生信号以及bsa等蛋白对检测的影响的问题。
[0051]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。