制备环形rna的构建体、方法及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于制备环形rna的构建体、方法及其应用，所述环形rna可用于在真核细胞中表达目标蛋白或以非编码rna的形式行使相应的功能。
背景技术：
：：2.环形rna(circrna)是一类通过头尾相连形成的环状rna分子。近年来有文献报导环形rna可以调控基因转录、中和mirna活性以及rna结合蛋白的结合，也可以作为模板翻译生成蛋白质[1-4]。与线性rna相比，环形rna因其头尾共价闭环结构不易被rna降解系统识别，因而具有更强的稳定性，有成为新一代rna药物平台的潜力和前景。[0003]目前体外制备环形rna的方法主要有三种。一种方法是通过核酸连接酶催化的rna连接反应，将线性rna的5’端和3’端首尾相连，得到环形rna。其中的rna连接酶是外源蛋白质，如t4rna连接酶。一种方法是化学连接法，通过氰化溴及吗啉基衍生物的催化将rna的5’端和3’端连接。另一种更为领先的方法是通过核酶(ribozyme)催化的rna剪接反应(rnasplicing)得到首尾相连的环形rna。这种方法通过设计带有自剪接功能的含有核酶序列的表达框架来表达环形rna。[0004]目前可进行rna自剪接的核酶通常被分为两大类，分别称为i型(groupi)和ii型(ii型)内含子。据文献报道这两类内含子均可以在适当的反应条件下进行自剪接，将两个rna片段连接到一起。虽然两类核酶剪接产物相似，但核酶本身的结构和剪接机制大相径庭。[0005]i型内含子为9螺旋结构，催化剪接时需要外在的磷酸鸟苷中的羟基(pg‑ꢀoh)触发反应，并且对位于i型内含子两端的外显子序列有较大的依赖性。[0006]ii型内含子依靠核酸序列内部自身的羟基触发剪接。这种剪接机制更接近通过剪接体介导的剪接反应，即可以更好地模拟高等生物剪接。[0007]上述结构差异决定了i型内含子自剪接需要较长的原始外显子序列，也被称为疤痕序列(scarsequence)。[0008]已有研究表明分别采用这两类内含子核酶均可以在体外制备环形rna，但效率较低[5,6]。[0009]wesselhoeft等人的文章报道了通过优化包含i型内含子的构建体提高rna环化效率的方法[7]，相关专利申请(wo2019/236673a1)公开了用于形成环形编码rna的含有i型内含子的构建体。wesselhoeft等人对i型内含子和其两端的外显子进行重排，并将带有核糖体进入位点(ires)的目标蛋白(poi)构建到此框架中，然后在gtp存在下，通过自剪接反应得到可以翻译目标蛋白的环形编码rna。通过选择不同的i型内含子，并进行设计改造，提高了rna环化效率。具体来说，该技术首先将t4噬菌体的td基因进行一些删除，保留了可以进行正确折叠从而保持核酶活性的序列，包括内含子和一部分外显子，然后将其一分为二，将3’端内含子和外显子片段2(e2)构建到ires-poi的5’端，将外显子片段1(e1)和5’端内含子构建到ires-poi的3’端，在gtp和镁离子的存在下，自剪接得到环形rna。然而，wesselhoeft等人发现5’端和3’端剪接位点因为目标基因的插入而无法有效地进行剪接。为了解决这个问题，wesselhoeft等人在剪接位点附近插入了互补配对的“同源臂”，从而提高了剪接效率。还根据已有文献[6]选择了另一种i型内含子anabaena，发现其剪接效率高于td内含子，并对其进行类似的设计改造，进一步提高了剪接效率。文章最后验证了该表达框架可以有效翻译目标蛋白。[0010]但是，wesselhoeft等人的设计存在以下缺点：[0011]1.使用i型内含子时必须含有较长的原始外显子序列，因此在表达产物中会包含一段原始外源序列(疤痕序列)，在将目标序列制备成环形rna的过程中通常希望将这段不属于目标序列的序列去除，以便于后续应用；[0012]2.i型内含子在进行自剪接时需要gtp参与供能。[0013]另一方面，以往文献中的ii型内含子的剪接效率较低(约10％)[6]。因此，本领域仍需要改进的构建体和方法来制备环形rna。技术实现要素：[0014]本技术的发明人通过筛选和设计优化，创造了一种通过ii型内含子的自剪接制备环形rna的方法学，克服了上述问题。[0015]因此，在第一方面，本发明提供[0016]一种在体外具有自剪接活性的多核苷酸构建体，其从5’到3’包含以下可操作地连接的元件：[0017](1)3’内含子片段；[0018](2)外显子片段2(e2)；[0019](3)目标序列；[0020](4)外显子片段1(e1)；[0021](5)5’内含子片段，[0022]其中所述5’内含子片段和3’内含子片段通过将ii型内含子分割成两个片段获得，所述5’内含子片段在所述ii型内含子中位于3’内含子片段的5’侧，[0023]所述e1为所述ii型内含子的5’紧邻外显子片段，其长度≥0个核苷酸，[0024]所述e2为所述ii型内含子的3’紧邻外显子片段，其长度≥0个核苷酸，[0025]所述目标序列为空，或为蛋白编码或非编码序列。[0026]在具体的实施方案中，所述e1和/或e2的长度为0-20个核苷酸，优选0-10个核苷酸，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸。[0027]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段将ii型内含子从非配对区进行分割成两个片段。在具体的实施方案中，所述非配对区选自ii型内含子两个相邻结构域之间的线性区或结构域4茎环结构的环区。[0028]在具体的实施方案中，所述ii型内含子相对于其野生型形式包含一个或多个核苷酸的修饰，所述修饰选自删除、取代、添加中的一种或多种。[0029]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段中分别包含一对或多对彼此互补的配对序列。在优选的实施方案中，所述互补配对序列的长度大于20个核苷酸。[0030]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和/或3’内含子片段中包含一个或者多个亲和标签序列，所述亲和标签序列选自下组中的一种或多种：探针结合序列、ms2结合位点、pp7结合位点、链霉亲和素结合位点。[0031]在具体的实施方案中，其中所述e1和e2为0，并且所述修饰包括对所述ii型内含子的一个或多个ebs序列进行修饰，使其分别与目标序列中相应长度的一个或多个区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对。所述ebs序列选自ebs1、ebs2、ebs3中的一个或多个，优选任意两个，更优选ebs1和ebs3。在优选的实施方案中，所述修饰为对所述ii型内含子的两个ebs序列，优选ebs1和ebs3，进行修饰，使其分别与目标序列中相应长度的两个区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对。在优选的实施方案中，所述目标序列中相应长度的两个区域分别位于所述目标序列的两端。[0032]在具体的实施方案中，其中所述修饰是删除结构域4的部分或全部，例如删除结构域4中的iep序列，优选删除全部结构域4。[0033]在具体的实施方案中，所述ii型内含子为源自微生物的ii内含子。优选地，所述ii型内含子具有体外自剪接活性。在具体的实施方案中，所述ii型内含子是来自梭菌属(clostridium)如破伤风梭菌(clostridiumtetani)或芽孢杆菌属(bacillus)如苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的ii型内含子。在具体的实施方案中，所述ii型内含子为seqidnos:1或2的核苷酸序列中包含的ii型内含子。[0034]在具体的实施方案中，所述蛋白非编码序列选自下组中的一种或多种：间隔序列如seqidno:4-6中的任一、富含a和/或t的序列、polya序列、polya-c序列、polyc序列、poly-u序列、ires、核糖体结合位点(ribosomebindingsite)、适配体序列(aptamer)、核糖开关(riboswitchs)、除自剪接核酶之外的核酶(ribozyme)、小rna(smallrna)、翻译调控序列、蛋白结合位点。[0035]在具体的实施方案中，所述多核苷酸构建体能够在体外形成目标序列的环形rna。[0036]在第二方面，本发明提供通过第一方面的构建体产生的环形rna。优选地，所述环形rna不含任何不属于所述目标序列的其他序列，如不含e2、e1序列。[0037]在具体的实施方案中，如目标序列为蛋白编码序列的技术方案中，所述环形rna的长度为至少500个核苷酸，优选至少1000个核苷酸，优选至少1500个核苷酸。在目标序列为非编码rna的技术方案中，目标序列可以更短。[0038]在第三方面，本发明提供一种在细胞中表达蛋白质的方法，包括将第二方面的环形rna转染到所述细胞中。[0039]在第四方面，本发明提供一种在细胞中表达蛋白质的方法，包括使第一方面的构建体发生自剪接环化反应形成环形rna，并将所述环形rna转染到所述细胞中。[0040]在第三方面和第四方面的具体实施方案中，所述细胞为真核细胞。[0041]本发明的构建体、方法和应用至少具有以下优点：[0042]1.在优选的技术方案中，可以产生不含疤痕序列的环形rna，这种环形rna更有利于有序应用；[0043]2.在形成环形rna的自剪接反应过程中不需要gtp参与，仅需要提供mg离子、na离子即可；[0044]3.大幅提高了ii型内含子的剪接效率，可从10％提高至50％左右，甚至实现最高高达98％的剪接效率。附图说明[0045]参考各个附图来说明本发明的实施方案。[0046]图1是介绍本发明的方法的流程图，展现了从天然的自剪接核酶开始，经过设计、改造，最终反应获得环形rna的过程。[0047]图2a-b展现了实施例1的ii型内含子的筛选过程。(a)制备包含gluc编码序列片段和e1-ii型内含子(自剪接核酶)-e2的dna构建体，以该dna构建体为模板，通过体外转录制备线性rna并纯化，如果线性rna通过体外自剪接反应产生大小不同的两个片段(被切下的内含子，以及构建体的剩余部分)，则证明了体外自剪接活性，ii型内含子及其侧翼e1、e2序列可作为设计crnazyme构建体的crnazyme前体。(b)用于筛选crnazyme前体的体外自剪接反应条件。[0048]图3是根据实施例1的方法确认具有自剪接活性的2种ii型内含子的凝胶电泳图。ii型内含子的名称在各自电泳图上以3字母代码标出。[0049]图4a-c是以cte为例设计crnazyme构建体的方案和不同方案之间的比较性实验结果。(a)crnazyme构建体设计；(b)在不同位置分割iicte内含子并得到构建体之后，通过凝胶电泳确定的环化效率；(c)通过不同方法验证环形rna成功形成的实验的结果图。[0050]图5a-c显示了优化过程中，不同条件下获得的结果。(a)通过优化反应条件和改造序列，crnazyme构建体环化效率得到了升高；(b)以cte作为示例性自剪接核酶，在不同反应条件下环化产物的凝胶电泳结果图，下部的柱状图显示了量化的环化效率pc％(环化效率(pc％)＝环形/(环形 线性)×100％)；(c)以cte作为示例性核酶，以海肾萤光素酶(renillaluciferase)(rluc)作为插入片段，在加入不同间隔序列的情况下，通过三种构建体产生的环化产物的凝胶电泳图，下部的柱状图显示了量化的环化效率pc％。[0051]图6a-b涉及实施例4中制备的能够消除疤痕序列的改进构建体。(a)构建体结构示意图。(b)不同镁离子浓度下，三种目标序列的环化产物的凝胶电泳图以及测序结果。[0052]图7显示了插入不同长度目标序列时生成的环形rna的凝胶电泳结果。[0053]图8a-b是使用本发明的构建体和方法生成的不同目标序列的环形rna在胞内表达的结果。(a)使用“无痕”构建体并以gfp为目标序列形成环形rna，在转染细胞后通过western印迹检测gfp表达的结果；(b)使用“无痕”构建体并以gluc为目标序列形成环形rna，在转染细胞后通过酶标仪检测gluc表达的结果。[0054]图9是ii型内含子结构示意图。[0055]发明详述[0056]核酶和ii型内含子[0057]核酶本身是一段rna核酸分子，因为这些核酸序列具有酶的活性，因而被称之为核酶。如一些线粒体或者细菌中的某些内含子序列，可以不依赖于剪接体(spliceosome)直接催化剪接的发生，将它们称为“具有自剪接活性的核酶”、“自剪接核酶”或“自剪接内含子”。无需任何蛋白质即可完成剪接的自剪接内含子包括i型和ii型两种。如上文所述，两种内含子在结构上和自剪接反应机理上均有明显区别。本发明具体涉及ii型自剪接内含子，或简称为“ii型内含子”。[0058]使用自剪接核酶制备环形rna的方法具有以下优势。[0059]1)减少生物和化学试剂使用。核酶的使用可以有效减少制备过程中外源生物制品(如连接酶)的污染以及其他化学试剂的污染。在用核酶进行催化自剪接时，反应体系中只需要使用少数几种试剂，如tris-hcl缓冲液、mg离子、钠离子和gtp。在本发明的情况下，由于使用了ii型内含子，gtp也可以被省略。相比之下，使用连接酶进行连接反应制备环形rna时，除了连接酶自身外，一方面酶的保存需要用到相应的化学试剂，例如tris-hcl缓冲液、kcl、dtt、edta、甘油等，另一方面反应体系也需要化学试剂参与，如mg离子、dtt、atp等。试剂种类的减少可节约成本、简化操作。[0060]2)操作简便。如上所述，由于反应所需的试剂种类少，只需要在rna中加入含有gtp(仅就i型自剪接内含子而言)和离子的缓冲液，即可在pcr仪上一步完成环化反应。相比之下，使用rna连接酶进行连接反应时，至少要加入额外的连接酶。[0061]3)设计简便。对于分子量较大的环形rna，例如含有编码序列的环形rna，直接连接的效率很低，通常还需要引入外源的夹板dna(dnasplint)，这需要rna和dna的精确配对，增加了设计和操作的复杂性。[0062]图9中展示了ii型内含子的二级结构示意图。如图9所示，ii型内含子主要包括6个茎环结构，称为结构域1-6(d1-d6)，6个结构域顺序排列，其中含有多个外显子结合序列(exonbindingsequence；ebs)，如ebs1、ebs2、ebs3。这些ebs序列与外显子区域中的内含子结合序列(ibs)进行相互作用如互补配对，依靠核酸序列内部自身的羟基触发剪接。这种剪接机制更接近通过剪接体介导的剪接反应，更类似于高等生物的剪接。[0063]在优选的实施方案中，ii型内含子来源于微生物界(bacteriadomain)。在具体的实施方案中，ii型内含子来源于梭菌属(clostridium)如破伤风梭菌(clostridiumtetani)或芽孢杆菌属(bacillus)如苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。本领域技术人员能够理解，本发明的关键在于构建体和方法的设计，这种设计适用于各种ii型内含子。本发明的实施不局限于具体的ii型内含子类型，只要该ii型内含子在体外具有自剪接成环活性即可，这种活性是本领域技术人员通过常规手段能够确认的。[0064]在本发明的实施方案中，ii型内含子可以是野生型ii型内含子或经修饰的ii型内含子。所述经修饰的ii型内含子包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。优选所述修饰不影响ii型内含子的自剪接活性，特别是体外自剪接活性。[0065]本发明的构建体[0066]在本发明的上下文中，可以将天然自剪接核酶称为自剪接核酶或crnazyme前体，将重排并改造后的自剪接核酶称为crnazyme。进一步地，将与目标序列，如蛋白编码序列或蛋白非编码序列，连接起来的crnazyme称为crnazyme构建体，即本发明的多核苷酸构建体。[0067]具体来说，通过将由天然ii型内含子及其两个侧翼的外显子片段(e1、e2)组成的一段序列(e1-内含子-e2)一分为二，形成两个片段，即结构为e1‑ꢀ5’内含子片段的第一片段，和结构为3’内含子片段-e2的第二片段。其中5’内含子片段原先位于3’内含子片段的5’端，并且彼此紧邻。在构建crnazyme时，将所述第一片段和第二片段位置互换并重新连接。重排后的序列结构为“3’内含子片段-e2-e1-5’内含子片段”。将具有这种结构并且具有自剪接活性的序列成为crnazyme。所述自剪接活性优选是发生自剪接并使插入其中的目标蛋白序列形成环形rna的活性。所述自剪接活性优选是在体外发生自剪接的活性。[0068]在将crnazyme用于催化目标蛋白形成环状rna时，将目标蛋白序列，包括目标蛋白编码序列和/或非编码序列，构建到crnazyme的e2和e1之间的位置，由此形成crnazyme构建体。crnazyme构建体可以通过转录成为rna，然后通过其中含有的crnazyme结构元件发生自剪接，使其中含有的目标蛋白序列形成环形rna。[0069]总体而言，基于ii型内含子(crnazyme前体)设计crnazyme构建体的原则是在整体长度尽量短的情况下保留最大的环化效率。发生自剪接成环反应后，内含子部分会被切出，如图1所示。获得的环形rna产物中不再包含内含子部分。因此环形rna产物要比未发生剪接反应的线性crnazyme构建体结构的总核苷酸数少。基于这点，可以通过琼脂糖凝胶电泳来区分环形rna产物和crnazyme构建体。在本发明的上下文中，将环化效率(percentofcyclizing,pc)定义为环形rna占线性rna和环形rna总和的百分比。具体的定量方式采用本领域常用的半定量方式，根据凝胶电泳图中条带的强度来确定。[0070]基于上述原则，e1和/或e2的长度优选不超过20个核苷酸，例如不超过10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特殊的实施方案中，e1和e2可为0。[0071]同样基于上述原则，crnazyme构建体中的内含子序列，如5’内含子片段和/或3’内含子片段，和/或外显子序列，如e1和/或e2，相对于其天然存在的野生型序列，可以包含一个或多个核苷酸的修饰，例如一个或多个核苷酸的添加、删除、取代。[0072]在一个实施方案中，为了使序列缩短，可以在不影响活性的情况下，删除一部分序列或核苷酸。例如，可以删除ii型内含子结构域4中的内含子编码蛋白(iep)序列。结构域4中的iep序列或类似的结构存在于全部ii型内含子中，其编码具有逆转录酶活性的蛋白质，该蛋白质可催化内含子充当逆转录因子，并通过rna中间体在其基因组中移动。这一功能是天然ii型内含子在基因组中进行逆转录转座所需的，但是在体外转录中不需要此功能，因此在本发明的构建体中可以删除结构域4中的该段序列的部分或全部。[0073]e1和e2通常需要包括ibs序列，从而与内含子中所含的ebs序列进行相互作用以实现自剪接。在本发明的一个实施方案中，e1和e2序列可以为0，这样的好处是在最终成环的rna中除了目标序列不再包含任何其他序列。在这种情况下，为了保证内含子中的ebs仍然能够有与之配对的“ibs”序列，需要对内含子的ebs序列进行修饰，使其与目标序列中的一段序列互补配对，从而发生相互作用。换言之，将目标序列中的一段序列视作“ibs”，与内含子中经过修饰的ebs序列发生相互作用，以确保自剪接的完成。[0074]因此，在本发明的一个实施方案中，所述ii型内含子是经修饰的ii型内含子，具体来说是ebs区经修饰的ii型内含子。所述修饰可以是一个或多个核苷酸的取代，具体来说取代一个或多个ebs区的核苷酸，从而使得经修饰的ebs区与目标序列中的一段相应长度的区域互补配对。所述互补配对意指两段序列在转录成rna之后，能够互补配对，所述配对涵盖rna中的g和u的配对方式。所述经修饰的ebs的长度可为3-20个核苷酸，优选5-15个核苷酸，更优选6-10个核苷酸，例如6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。[0075]与修饰的ebs互补配对的目标序列区域可以存在于目标序列的任意位置，只要能够实现与ebs配对，并由此形成能够促成自剪接的二级结构即可。通常而言，可以使用目标序列两端的序列作为修饰的ebs设计的基础，这是因为两端的序列在构建体中位于原先e1和e2所处的位置，而e1和e2的位置也是原先与ebs进行相互作用的ibs序列的位置。因此，在具体的实施方案中，所述经修饰的ebs区是经修饰的ebs1和ebs3区。在具体的实施方案中，与经修饰的ebs区互补配对的目标序列中的区域位于目标序列的3’和/或5’末端。[0076]由于这种互补配对的目的是为了确保ebs和充当ibs的目标序列片段之间的相互作用，因此只要相互作用存在，可以允许一定程度的错配。在一些实施方案中年，所述经修饰的ebs区与目标序列中的一段相应长度的区域在至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或100％的核苷酸位置上互补配对，或与与目标序列中的一段相应长度的区域的互补配对序列具有至少60％的同一性，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或100％的同一性。[0077]在另一个实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段中可以包含一对或多对彼此互补的配对序列。这样的配对序列使5’内含子片段和3’内含子片段在空间上的距离缩短，从而促进环化反应发生。在优选的实施方案中，所述互补配对序列的长度至少为约20个核苷酸。[0078]构建体中的目标序列可以包含任意希望制备成环形rna的序列。目标序列可以是蛋白编码序列，或蛋白非编码序列，或二者的组合。换言之，目标序列中可以包含多种元件。蛋白编码序列可以编码任意蛋白，例如选自功能性蛋白、抗原蛋白、信号肽、标签蛋白等。[0079]例如，目标序列中包括的蛋白非编码序列可以是间隔序列，例如富含at的序列，其可以调节序列的柔性。这种间隔序列可以位于目标序列中的任意位置，例如位于目标序列的一端，紧邻e1和/或e2的位置。[0080]例如，目标序列中包括的蛋白非编码序列可以是翻译调控序列，如内部核糖体进入位点(ires)。可用于本发明的ires可以来自任何来源。[0081]本发明的crnazyme和crnazyme构建体以dna的形式完整制备，然后通过转录和自剪接形成期望的环形rna。[0082]自剪接反应体系[0083]ii型内含子的自剪接需要在高盐条件下完成。相较于i型内含子，其不需要引入gtp。[0084]在本发明的具体实施方案中，自剪接反应使用的自剪接缓冲液含有10mm-100mm，如10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm的二价镁离子，如mgcl2。所述自剪接缓冲液可以含有10mm-100mm，如10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm的nacl。[0085]在优选的实施方案中，本发明的自剪接反应在体外进行约5min至约1h，如约5min、约10min、约15min、约20min、约25min、约30min、约35min、约40min、约45min、约50min、约55min、约1h。[0086]在优选的实施方案中，本发明的构建体能够实现至少30％的成环率，如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，至少95％的成环率。[0087]纯化[0088]可以对通过本发明的构建体或方法生成的环形rna进行纯化。例如，所述纯化方式选自下组中的一种或多种：酶处理；层析，包括但不限于亲和柱层析、反向硅胶柱液相色谱、凝胶排阻液相色谱；电泳，包括但不限于凝胶电泳如琼脂糖凝胶电泳，和毛细管电泳。[0089]在将环形rna产物转染进入细胞之前，优选通过纯化处理尽可能地去除未成环的线性rna、dsrna以及其他不想要的组分。线性rna和一些dsrna两端的磷酸基团会激活rig-1信号通路，在细胞中引起强烈的免疫反应，导致外源rna的降解，影响环形rna在细胞中发挥功能。用于去除线性rna的方法包括酶处理，如用rnaser处理；层析，如高效液相色谱(hplc)。用于去除末端磷酸基团的方法包括用碱性磷酸酶处理，如来源于牛小肠的碱性磷酸酶(calfintestinalalkalinephosephate；cip)。[0090]施用和递送[0091]通过本发明的构建体或方法生成的环形rna可以使用多种递送系统中的任一种递送到细胞内或动物体内。例如，所述递送系统选自下组中的一种或多种：脂质体(liposome)、聚乙烯亚胺(pei)、有机金属框架材料(mofs)、脂质体纳米材料(lnp)、聚阳离子(polycation)、血液糖蛋白(bloodglycoprotein)、红细胞运输载体(redbloodcells)、金纳米颗粒载体(aunps)、磁性纳米材料载体(magneticnanoparticles)、碳纳米管(carbonnanotubes)、石墨烯分子载体(graphene)、量子点材料载体(quantumdots)、上转换纳米晶(upconversionnanoparticles)、层状氢氧化物材料载体(layereddoublehydroxides)、硅晶纳米材料(silicananoparticles)、磷酸钙(calciumphosphate)。[0092]用途[0093]取决于目标序列的种类，通过本发明的构建体或方法生成的环形rna可用于实现多种用途。例如，在目标序列包含蛋白编码序列或由蛋白编码序列组成时，形成的环形rna可以用于蛋白质的表达。本发明的环形rna还可以用于调节mirna活性、中和rna结合蛋白结合、表达适配体等多种功能。实施例[0094]为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。[0095]实施例1.ii型内含子的筛选[0096]本实施例涉及确认天然ii型内含子的体外自剪接能力的方法。[0097]首先，根据ii型内含子的天然序列直接合成dna序列(金维智公司(genewiz)，苏州)，合成的dna序列除了ii型内含子序列本身之外，还包括天然存在于侧翼的外显子e1、e2序列，特别是与ii型内含子紧邻的外显子中的内含子结合区的全部或部分。将所述dna序列通过分子生物学手段克隆到含有rluc(海肾荧光素酶，renillaluciferase)编码序列的表达载体psicheck-2(promega,c8021)中。具体来说，将psicheck-2用内切酶xhoi(新英格兰biolabs公司(neb))进行单酶切，然后将所述合成的dna序列使用dna无缝克隆方法(abclonaltechnology，武汉)克隆进入经酶消化的载体中，位于rluc的3’下游，以获得相应的构建体。该表达载体的骨架是包含t7启动子和终止子的pcdna3.1。[0098]使用针对t7启动子和t7终止子的通用引物，从上述载体进行pcr扩增，以获得转录用模板dna。该pcr反应的条件为：95℃30s，60℃20s，72℃60s，23-25个循环。将pcr扩增得到的模板dna用酚氯仿1:1体积抽提，再用2.5倍体积无水乙醇沉淀，由此进行纯化。[0099]将纯化后的模板dna通过t7rna聚合酶(neb或promega)进行体外转录，转录反应按照制造商说明书推荐的条件进行。将转录产物用dnasei在37℃消化30分钟以降解pcr模板。再通过柱纯化对转录产物进行纯化，得到高纯度rna。[0100]将经过柱纯化的转录产物rna加入自剪接缓冲液(10，20，50或100mmmgcl2，50mmnacl，40mmtris-hcl，ph＝7.5)进行自剪接反应。反应条件为95℃1min,75℃至45℃(-0.5℃,15sec/循环,共60个循环)，45℃保持并加入缓冲液，45℃5min，53℃15-30min(见图2b)。在体外发生自剪接反应后，取200ng产物使用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，以检测ii型内含子的自剪接效率。[0101]如果成功发生自剪接，则会产生大小不同的两条rna，未剪接的(unspliced)rna尺寸较大，在凝胶电泳图中位于上方；剪接后的rna(spliced)较小，在凝胶电泳图中位于下方。例如，图3中显示了两种经上述方法鉴定可以发生自剪接的ii型内含子的电泳结果，即来自苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的ii型内含子bth和来自破伤风梭菌(clostridiumtetani)的ii型内含子cte(图3)。图3中的箭头分别示出了通过电泳分开的未剪接和剪接后的rna。将通过本实施例的方法确认的ii型内含子及其侧翼外显子序列(如seqidno:1或seqidno:2，其分别包含bth和cte的ii型内含子及其侧翼6个核苷酸的e1和6个核苷酸的e2)作为制备自剪接核酶构建体crnazyme的前体，或称为crnazyme前体。[0102]实施例2.制备包含ii型内含子的表达构建体[0103]在通过筛选得到的具有自剪接性质的ii型内含子crnazyme前体基础上，进一步制备自剪接核酶crnazyme构建体。如上所述，设计crnazyme构建体的总原则是内含子序列和e1、e2序列的总长度尽可能小，成环率尽可能高。[0104]本实施例详细阐述使用实施例1中筛选出的ctecrnazyme前体来设计和制备crnazyme构建体的过程。[0105]在ctecrnazyme前体序列(seqidno:2，共1028个核苷酸长，包含cte内含子本身以及两端各6个核苷酸的外显子序列，即e1和e2均为6个核苷酸长)的基础上，删除了结构域4(domain4)中的310个核苷酸的内含子编码蛋白(iep)序列(seqidno:2的核苷酸位置625-934)，保留了可以进行正确折叠而保持自剪接活性的序列，包括两端少量外显子(各6nt，即ibs1和部分ibs3)，获得e1-cte△iep-e2序列。然后将e1-cte△iep-e2序列从内含子内部的位置处一分为二。将分割后的两个片段互换位置，将由e1和5’内含子片段组成的第一片段构建到插入片段rluc的3’端，将由3’内含子片段和e2组成的第二片段构建到插入片段rluc的5’端。在此基础上，在新形成的片段的5’端插入aataccttacttaatagtaacaatagaaaatc(seqidno:14)，3’端插入aagctagatcatattactattaagtaaggtatt(seqidno:15)，由此获得crnazyme_cte构建体。seqidno:14和seqidno:15这两段插入序列作为“同源臂”可使5’和3’剪接位点彼此接近，提高剪接效率。在分割内含子时，尝试了三种不同的分割位置，分别位于结构域1(第369与370位之间)、结构域3(第560与561位之间)和结构域4(第825与826位之间)中的环状(loop)区域中，因此形成了三种crnazyme，分别称为crnazyme_ctev1、crnazyme_ctev2、crnazyme_ctev3。在阳离子的存在下，在体外进行自剪接成环反应，以测试获得的crnazyme的环化活性。从图4b可见，不同位置分割后剪接效果不同，其中第三种分割方式(v3)剪接效果最好，以其进行后续实验，该构建体的序列如seqidno:16所示。[0106]根据片段大小，认为图4b的凝胶电泳图中以圆形示出的条带代表了环形rna。通过rt-pcr和sanger测序对其即序列进行验证，确定了该条带是包含跨e1e2接头(junction)的序列，证明e1、e2已经连接到了一起。但据此尚无法确认其为环形rna，因为该条带也可能是来自于反向剪接的转录本，或其他序列。为了确认环形rna的成功形成，基于环形rna头尾共价闭合的特征，使用了以下三种方法来验证它的结构(图4c)。[0107]方法一[0108]对cte中的剪接位点进行了突变，使其丧失成环能力，作为长度相同但不能成环的线性rna对照。具体来说，将seqidno:2中的剪接位点(第1-26位核苷酸)进行突变，将第3位的c变为a，第5位的t变为g，第17位的g突变为t，第18位的c突变为t，第21位的a突变为c，第26位的t突变为g。本领域技术人员能够理解此突变旨在破坏成环的能力，也可以进行数量不同、位置不同、类型不同的其他突变来实现类似的目的。将突变后的cte称为cte-mut(seqidno:3)。然后使用多聚腺苷酸酶为此突变的线性rna添加polya尾巴。由于环形rna首尾闭合且没有3’末端，因此不能加尾，而线性rna可以通过该反应加上数百个腺苷酸，通过琼脂糖凝胶电泳分辨加尾前后rna大小变化。[0109]具体步骤包括：[0110](1)将纯化的环形rna或对照线性rna通过poly(a)加尾酶(neb)进行加尾，反应条件是37℃，30min；[0111](2)加入rnaser(lucigen)消化线性rna，反应条件是37℃，30min；[0112](3)柱纯化rna。[0113]如图4c上部小图所示，泳道3、4是添加了polya尾巴的产物，对比泳道1、2是未添加polya尾巴的产物。在未成环的情况下，基于cte和cte‑ꢀmut的crnazyme条带在进行加polya反应后均出现上移，表明分子变大，polya添加成功。与之不同的是，推定未环状rna的条带在进行和不进行加polya反应的条件下基本上处于相同的位置，具有相同的大小。[0114]方法二[0115]使用rnaser进行消化。rnaser是一种3’‑5’核糖核酸外切酶，可以从头降解掉线性的rna分子，闭环结构的环形rna则不能被降解。通过琼脂糖凝胶电泳可以分辨rna是否被消化。[0116]具体步骤包括：[0117](1)通过退火反应，将dna探针结合到rna上，反应条件是95℃反应2min，然后缓慢逐级降温至25℃。探针序列见seqidnos:7和8。[0118](2)用rnaseh(neb)消化dna/rna双链，反应条件是37℃，30min；[0119](3)柱纯化rna。[0120]如图4c上部小图所示，泳道5、6为rnaser处理后的结果，泳道1-4为未进行rnaser处理的结果。可以看到较大的线性rna条带在经过rnaser处理之后消失(泳道5和6)，而泳道5中推定为环形rna的条带仍然存在。[0121]方法三[0122]使用rnaseh进行消化。rnaseh是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解dna-rna杂合链中的rna。因为线性rna和环形rna结构不同，与相同dna探针结合后，可以被rnaseh切割成长度不一的片段。通过琼脂糖凝胶电泳可以分辨被切割产生的rna片段的长度，从而反推rna本来的结构。具体来说，对于环形rna而言，用两个dna探针与rna进行结合，然后进行切割，会得到两条条带。与之不同，如果没有成环，仍然保持线性，采用同样的方法应该会得到三条条带。如图4c下部小图所示，本技术的产物获得了两条条带。[0123]通过以上三种方法获得的结果，均证实了环形rna的成功形成，验证了构建的crnazyme_cte的环化活性。[0124]实施例3.通过优化反应体系和改造构建体提高自剪接效率[0125]为了提高最终环形rna产率，首先需要提高环化效率(图5a)。发明人从两方面对表达构建体的环化效率进行了优化。[0126]反应条件优化[0127]发明人尝试了反应体系中多种不同的离子浓度(50mm和100mm的nacl；2mm、5mm、10mm、20mm的mg2 )和多种不同的反应时间(5分钟、15分钟、30分钟)的组合，来确定最优反应体系。[0128]发现在20mmmg2 、50mmnacl的反应体系中，进行15和30分钟的条件下，可将环化效率从现有的30％提高至60％以上(图5b)。[0129]序列优化[0130]根据rna二级结构进一步改造了序列。具体来说，在插入不同目标序列之后，有些序列会因为结构原因而不能有效地进行剪接。在这种情况下，通过在目标序列中纳入一些间隔序列增加结构的柔性来提高剪接效率，例如该间隔序列可以是富含at的序列。[0131]在实施例2的基础上，通过分子克隆手段在crnazyme_cte中rluc前端插入了三种不同的间隔序列，即seqidno:4的间隔序列1，seqidno:5的间隔序列2，和seqidno:6的间隔序列3，得到三种进一步优化的构建体。在实施例2中确定的最优自剪接反应体系(10mmmg，50mmnacl，30分钟反应时长)中使这三种带有间隔序列的构建体发生了体外环化。从图5c的结果可知，加入3种间隔序列后的成环效率分别约为60％、80％、98％(图5c)。[0132]实施例4.制备不含疤痕序列的“无痕”环形rna[0133]使用前述方法获得的环形rna仍然会含有少量的非目标序列，即来自外显子e1、e2的序列。为了去除这些序列，可以对构建体进行进一步的改造。[0134]在制备crnazyme构建体时，目标序列的两端分别为长度较短的e2和e1，它们分别来源于ii型内含子侧翼外显子区的内含子结合(ibs)序列，一般而言长度在0-20个核苷酸之间。在形成环形rna时，不希望包括非目标序列之外的序列，如外显子序列e1和e2。若直接去掉e1和e2，则会因为缺乏与内含子中的ebs序列相互作用的ibs序列而影响自剪接成环过程。本发明的发明人创新性地想到，可以将目标序列的一部分直接视为“ibs”序列，通过修改内含子中的ebs，使其能够与目标序列中被视为“ibs”的区域发生相互作用。这样的方法在保证crnazyme构建体具有自剪接功能的同时，摆脱了对外显子序列e1和e2的依赖，将其从构建体和最终成环产物中去除。[0135]仍然以cte核酶为例，配合不同的目标序列(gfp，gluc和2a肽)来说明本实施例的crnazyme构建体设计思路。[0136]根据各个目标序列两端各6个核苷酸的序列，将ii型内含子中的ebs1和ebs3序列分别替换为这两段6核苷酸的序列至少部分互补配对的序列。具体来说，使ebs3与目标序列处于线性状态时(如在crnazyme构建体自剪接成环之前的状态)5’端的6个核苷酸互补配对，ebs1与目标序列处于线性状态时3’端的6个核苷酸互补配对。具体修饰序列如图6b右侧图所示，显示了针对三种不同的目标序列设计的用于修饰的ebs1和ebs3序列。值得注意的是，改造过的ebs1和ebs3不必与充当“ibs1”和“ibs3”的目标序列片段完美互补配对。可以允许其中有一定比例的错配，或是a和g、g和u这种牢固程度稍低的配对方式。一般来说，用于对ii型内含子中的相应序列进行取代的ebs1和ebs3序列与目标序列相应区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对，或与目标序列相应区域的互补配对序列至少60％相同。[0137]从电泳结果可以看到，在使用不同目标序列(gfp，gluc和2a肽)的情况下，该改造方法均有效生成了环形rna(图6b，左)。通过sanger测序结果可以确认这种改造可将外源疤痕序列完全消除(图6b，右)。如图6b所示，具有如上修饰的ebs的crnazyme构建体在成环之后，目标序列的两端(带有阴影的两段6核苷酸序列，分别充当“ibs1”和“ibs3”)直接收尾相接，中间不再以e1和e2分隔。这更有益于生成的环形rna的后续应用。将以这种方式改造的构建体称为“无痕”构建体，成环后的环形rna称为“无痕”rna。[0138]实施例5.不同长度目标序列的成环结果[0139]基于实施例2和3中的方法，发明人还尝试了不同长度的目标片段。这些目标片段分别为555个核苷酸的gluc，其核苷酸序列如seqidno:9所示；936个核苷酸的rluc1，其核苷酸序列如seqidno:10所示；以及1160个核苷酸的rluc2，其核苷酸序列如seqidno:11所示。gluc和rluc1的构建体中未加入间隔序列，rluc2构建体由cat1ires序列和rluc组成。[0140]发现测试的片段均可以高效地进行自剪接，得到环形rna产物(图7)。[0141]实施例6.使用本发明的构建体表达目的基因[0142]在此基础上，进一步测试了不同目标序列的环形rna产物在转染细胞之后的表达情况。[0143]为了尽量减少线性rna引起的免疫降解，在转染前，对rna产物进行以下三步处理。[0144](1)rnaser处理，以消化线性rna。反应条件是37℃，30min。[0145](2)cip处理，以去除线性rna两端磷酸基团。反应条件为加入quickcip(neb)，37℃下反应30min；[0146](3)hplc纯化，以去除小的线性rna。hplc条件为：凝胶排阻色谱柱:watersbeh450a，柱温:40℃，流速：1min/ml，洗脱条件：0‑ꢀ30min,100％缓冲液a(10mmtris,0.5mmedta,depc水配制)。[0147]将目标rna用lipornamax(invitrogen)进行转染，转染条件参考供应商的说明书，转染时间为24小时。[0148]采用实施例2和3中的构建方法(采用间隔序列2)，并进行了实施例4中描述的可实现无痕成环的修饰，测试了不同目标序列。为了便于检测蛋白的表达，构建了含有荧光蛋白编码序列的构建体包括ires-gfp(seqidno:12)和ires-gluc(seqidno:13)。ires的加入可启动不依赖帽子结构的非经典翻译，使环状rna中的编码序列能够翻译成蛋白。[0149]针对不同的目标序列，使用了不同的方法来检测蛋白的表达。[0150]对于翻译产物是gfp的情况，通过在显微镜下观察荧光，用ripa裂解液(碧云天)裂解细胞，然后通过westernblot检测蛋白表达。确定通过本发明的方法获得了gfp的表达(图8a)。[0151]对于翻译产物是萤光素酶的情况，先用passive裂解液(promega)裂解细胞，然后用荧光素酶检测试剂盒(promega)通过酶标仪检测蛋白表达。确定通过本发明的方法获得了gluc蛋白的表达(图8b)。[0152]参考文献[0153]1.yangy,fanx,maom,songx,wup,zhangy,jiny,yangy,chenll,wangy,etal:extensivetranslationofcircularrnasdrivenbyn(6)‑ꢀmethyladenosine.cellres2017,27:626-641.[0154]2.aben,matsumotok,nishiharam,nakanoy,shibataa,maruyamah,shutos,matsudaa,yoshidam,itoy,abeh:rollingcircletranslationofcircularrnainlivinghumancells.scirep2015,5:16435.[0155]3.gaox,xiax,lif,zhangm,zhouh,wux,zhongj,zhaoz,zhaok,liud,etal:circularrna-encodedoncogenice-cadherinvariantpromotesglioblastomatumorigenicitythroughactivationofegfr-stat3signalling.natcellbiol2021,23:278-291.[0156]4.pamudurtinr,bartoko,jensm,ashwal-flussr,stottmeisterc,ruhel,hananm,wylere,perez-hernandezd,rambergere,etal:translationofcircrnas.molcell2017,66:9-21e27.[0157]5.puttarajum,beenmd:groupipermutedintron-exon(pie)sequencesself‑ꢀsplicetoproducecircularexons.nucleicacidsres1992,20:5357-5364.[0158]6.mikheevas,hakim-zargarm,carlsond,jarrellk:useofanengineeredribozymetoproduceacircularhumanexon.nucleicacidsresearch1997,25:5085-5094.[0159]7.wesselhoeftra,kowalskips,andersond:engineeringcircularrnaforpotentandstabletranslationineukaryoticcells.naturecommunications2018,9.[0160]8.saldanhar,mohrg,belfortm,lambowitzam:groupiandii型introns.fasebj1993,7:15-24。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于制备环形rna的构建体、方法及其应用，所述环形rna可用于在真核细胞中表达目标蛋白或以非编码rna的形式行使相应的功能。
背景技术：
：：2.环形rna(circrna)是一类通过头尾相连形成的环状rna分子。近年来有文献报导环形rna可以调控基因转录、中和mirna活性以及rna结合蛋白的结合，也可以作为模板翻译生成蛋白质[1-4]。与线性rna相比，环形rna因其头尾共价闭环结构不易被rna降解系统识别，因而具有更强的稳定性，有成为新一代rna药物平台的潜力和前景。[0003]目前体外制备环形rna的方法主要有三种。一种方法是通过核酸连接酶催化的rna连接反应，将线性rna的5’端和3’端首尾相连，得到环形rna。其中的rna连接酶是外源蛋白质，如t4rna连接酶。一种方法是化学连接法，通过氰化溴及吗啉基衍生物的催化将rna的5’端和3’端连接。另一种更为领先的方法是通过核酶(ribozyme)催化的rna剪接反应(rnasplicing)得到首尾相连的环形rna。这种方法通过设计带有自剪接功能的含有核酶序列的表达框架来表达环形rna。[0004]目前可进行rna自剪接的核酶通常被分为两大类，分别称为i型(groupi)和ii型(ii型)内含子。据文献报道这两类内含子均可以在适当的反应条件下进行自剪接，将两个rna片段连接到一起。虽然两类核酶剪接产物相似，但核酶本身的结构和剪接机制大相径庭。[0005]i型内含子为9螺旋结构，催化剪接时需要外在的磷酸鸟苷中的羟基(pg‑ꢀoh)触发反应，并且对位于i型内含子两端的外显子序列有较大的依赖性。[0006]ii型内含子依靠核酸序列内部自身的羟基触发剪接。这种剪接机制更接近通过剪接体介导的剪接反应，即可以更好地模拟高等生物剪接。[0007]上述结构差异决定了i型内含子自剪接需要较长的原始外显子序列，也被称为疤痕序列(scarsequence)。[0008]已有研究表明分别采用这两类内含子核酶均可以在体外制备环形rna，但效率较低[5,6]。[0009]wesselhoeft等人的文章报道了通过优化包含i型内含子的构建体提高rna环化效率的方法[7]，相关专利申请(wo2019/236673a1)公开了用于形成环形编码rna的含有i型内含子的构建体。wesselhoeft等人对i型内含子和其两端的外显子进行重排，并将带有核糖体进入位点(ires)的目标蛋白(poi)构建到此框架中，然后在gtp存在下，通过自剪接反应得到可以翻译目标蛋白的环形编码rna。通过选择不同的i型内含子，并进行设计改造，提高了rna环化效率。具体来说，该技术首先将t4噬菌体的td基因进行一些删除，保留了可以进行正确折叠从而保持核酶活性的序列，包括内含子和一部分外显子，然后将其一分为二，将3’端内含子和外显子片段2(e2)构建到ires-poi的5’端，将外显子片段1(e1)和5’端内含子构建到ires-poi的3’端，在gtp和镁离子的存在下，自剪接得到环形rna。然而，wesselhoeft等人发现5’端和3’端剪接位点因为目标基因的插入而无法有效地进行剪接。为了解决这个问题，wesselhoeft等人在剪接位点附近插入了互补配对的“同源臂”，从而提高了剪接效率。还根据已有文献[6]选择了另一种i型内含子anabaena，发现其剪接效率高于td内含子，并对其进行类似的设计改造，进一步提高了剪接效率。文章最后验证了该表达框架可以有效翻译目标蛋白。[0010]但是，wesselhoeft等人的设计存在以下缺点：[0011]1.使用i型内含子时必须含有较长的原始外显子序列，因此在表达产物中会包含一段原始外源序列(疤痕序列)，在将目标序列制备成环形rna的过程中通常希望将这段不属于目标序列的序列去除，以便于后续应用；[0012]2.i型内含子在进行自剪接时需要gtp参与供能。[0013]另一方面，以往文献中的ii型内含子的剪接效率较低(约10％)[6]。因此，本领域仍需要改进的构建体和方法来制备环形rna。技术实现要素：[0014]本技术的发明人通过筛选和设计优化，创造了一种通过ii型内含子的自剪接制备环形rna的方法学，克服了上述问题。[0015]因此，在第一方面，本发明提供[0016]一种在体外具有自剪接活性的多核苷酸构建体，其从5’到3’包含以下可操作地连接的元件：[0017](1)3’内含子片段；[0018](2)外显子片段2(e2)；[0019](3)目标序列；[0020](4)外显子片段1(e1)；[0021](5)5’内含子片段，[0022]其中所述5’内含子片段和3’内含子片段通过将ii型内含子分割成两个片段获得，所述5’内含子片段在所述ii型内含子中位于3’内含子片段的5’侧，[0023]所述e1为所述ii型内含子的5’紧邻外显子片段，其长度≥0个核苷酸，[0024]所述e2为所述ii型内含子的3’紧邻外显子片段，其长度≥0个核苷酸，[0025]所述目标序列为空，或为蛋白编码或非编码序列。[0026]在具体的实施方案中，所述e1和/或e2的长度为0-20个核苷酸，优选0-10个核苷酸，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸。[0027]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段将ii型内含子从非配对区进行分割成两个片段。在具体的实施方案中，所述非配对区选自ii型内含子两个相邻结构域之间的线性区或结构域4茎环结构的环区。[0028]在具体的实施方案中，所述ii型内含子相对于其野生型形式包含一个或多个核苷酸的修饰，所述修饰选自删除、取代、添加中的一种或多种。[0029]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段中分别包含一对或多对彼此互补的配对序列。在优选的实施方案中，所述互补配对序列的长度大于20个核苷酸。[0030]在具体的实施方案中，所述5’内含子片段和/或3’内含子片段中包含一个或者多个亲和标签序列，所述亲和标签序列选自下组中的一种或多种：探针结合序列、ms2结合位点、pp7结合位点、链霉亲和素结合位点。[0031]在具体的实施方案中，其中所述e1和e2为0，并且所述修饰包括对所述ii型内含子的一个或多个ebs序列进行修饰，使其分别与目标序列中相应长度的一个或多个区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对。所述ebs序列选自ebs1、ebs2、ebs3中的一个或多个，优选任意两个，更优选ebs1和ebs3。在优选的实施方案中，所述修饰为对所述ii型内含子的两个ebs序列，优选ebs1和ebs3，进行修饰，使其分别与目标序列中相应长度的两个区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对。在优选的实施方案中，所述目标序列中相应长度的两个区域分别位于所述目标序列的两端。[0032]在具体的实施方案中，其中所述修饰是删除结构域4的部分或全部，例如删除结构域4中的iep序列，优选删除全部结构域4。[0033]在具体的实施方案中，所述ii型内含子为源自微生物的ii内含子。优选地，所述ii型内含子具有体外自剪接活性。在具体的实施方案中，所述ii型内含子是来自梭菌属(clostridium)如破伤风梭菌(clostridiumtetani)或芽孢杆菌属(bacillus)如苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的ii型内含子。在具体的实施方案中，所述ii型内含子为seqidnos:1或2的核苷酸序列中包含的ii型内含子。[0034]在具体的实施方案中，所述蛋白非编码序列选自下组中的一种或多种：间隔序列如seqidno:4-6中的任一、富含a和/或t的序列、polya序列、polya-c序列、polyc序列、poly-u序列、ires、核糖体结合位点(ribosomebindingsite)、适配体序列(aptamer)、核糖开关(riboswitchs)、除自剪接核酶之外的核酶(ribozyme)、小rna(smallrna)、翻译调控序列、蛋白结合位点。[0035]在具体的实施方案中，所述多核苷酸构建体能够在体外形成目标序列的环形rna。[0036]在第二方面，本发明提供通过第一方面的构建体产生的环形rna。优选地，所述环形rna不含任何不属于所述目标序列的其他序列，如不含e2、e1序列。[0037]在具体的实施方案中，如目标序列为蛋白编码序列的技术方案中，所述环形rna的长度为至少500个核苷酸，优选至少1000个核苷酸，优选至少1500个核苷酸。在目标序列为非编码rna的技术方案中，目标序列可以更短。[0038]在第三方面，本发明提供一种在细胞中表达蛋白质的方法，包括将第二方面的环形rna转染到所述细胞中。[0039]在第四方面，本发明提供一种在细胞中表达蛋白质的方法，包括使第一方面的构建体发生自剪接环化反应形成环形rna，并将所述环形rna转染到所述细胞中。[0040]在第三方面和第四方面的具体实施方案中，所述细胞为真核细胞。[0041]本发明的构建体、方法和应用至少具有以下优点：[0042]1.在优选的技术方案中，可以产生不含疤痕序列的环形rna，这种环形rna更有利于有序应用；[0043]2.在形成环形rna的自剪接反应过程中不需要gtp参与，仅需要提供mg离子、na离子即可；[0044]3.大幅提高了ii型内含子的剪接效率，可从10％提高至50％左右，甚至实现最高高达98％的剪接效率。附图说明[0045]参考各个附图来说明本发明的实施方案。[0046]图1是介绍本发明的方法的流程图，展现了从天然的自剪接核酶开始，经过设计、改造，最终反应获得环形rna的过程。[0047]图2a-b展现了实施例1的ii型内含子的筛选过程。(a)制备包含gluc编码序列片段和e1-ii型内含子(自剪接核酶)-e2的dna构建体，以该dna构建体为模板，通过体外转录制备线性rna并纯化，如果线性rna通过体外自剪接反应产生大小不同的两个片段(被切下的内含子，以及构建体的剩余部分)，则证明了体外自剪接活性，ii型内含子及其侧翼e1、e2序列可作为设计crnazyme构建体的crnazyme前体。(b)用于筛选crnazyme前体的体外自剪接反应条件。[0048]图3是根据实施例1的方法确认具有自剪接活性的2种ii型内含子的凝胶电泳图。ii型内含子的名称在各自电泳图上以3字母代码标出。[0049]图4a-c是以cte为例设计crnazyme构建体的方案和不同方案之间的比较性实验结果。(a)crnazyme构建体设计；(b)在不同位置分割iicte内含子并得到构建体之后，通过凝胶电泳确定的环化效率；(c)通过不同方法验证环形rna成功形成的实验的结果图。[0050]图5a-c显示了优化过程中，不同条件下获得的结果。(a)通过优化反应条件和改造序列，crnazyme构建体环化效率得到了升高；(b)以cte作为示例性自剪接核酶，在不同反应条件下环化产物的凝胶电泳结果图，下部的柱状图显示了量化的环化效率pc％(环化效率(pc％)＝环形/(环形 线性)×100％)；(c)以cte作为示例性核酶，以海肾萤光素酶(renillaluciferase)(rluc)作为插入片段，在加入不同间隔序列的情况下，通过三种构建体产生的环化产物的凝胶电泳图，下部的柱状图显示了量化的环化效率pc％。[0051]图6a-b涉及实施例4中制备的能够消除疤痕序列的改进构建体。(a)构建体结构示意图。(b)不同镁离子浓度下，三种目标序列的环化产物的凝胶电泳图以及测序结果。[0052]图7显示了插入不同长度目标序列时生成的环形rna的凝胶电泳结果。[0053]图8a-b是使用本发明的构建体和方法生成的不同目标序列的环形rna在胞内表达的结果。(a)使用“无痕”构建体并以gfp为目标序列形成环形rna，在转染细胞后通过western印迹检测gfp表达的结果；(b)使用“无痕”构建体并以gluc为目标序列形成环形rna，在转染细胞后通过酶标仪检测gluc表达的结果。[0054]图9是ii型内含子结构示意图。[0055]发明详述[0056]核酶和ii型内含子[0057]核酶本身是一段rna核酸分子，因为这些核酸序列具有酶的活性，因而被称之为核酶。如一些线粒体或者细菌中的某些内含子序列，可以不依赖于剪接体(spliceosome)直接催化剪接的发生，将它们称为“具有自剪接活性的核酶”、“自剪接核酶”或“自剪接内含子”。无需任何蛋白质即可完成剪接的自剪接内含子包括i型和ii型两种。如上文所述，两种内含子在结构上和自剪接反应机理上均有明显区别。本发明具体涉及ii型自剪接内含子，或简称为“ii型内含子”。[0058]使用自剪接核酶制备环形rna的方法具有以下优势。[0059]1)减少生物和化学试剂使用。核酶的使用可以有效减少制备过程中外源生物制品(如连接酶)的污染以及其他化学试剂的污染。在用核酶进行催化自剪接时，反应体系中只需要使用少数几种试剂，如tris-hcl缓冲液、mg离子、钠离子和gtp。在本发明的情况下，由于使用了ii型内含子，gtp也可以被省略。相比之下，使用连接酶进行连接反应制备环形rna时，除了连接酶自身外，一方面酶的保存需要用到相应的化学试剂，例如tris-hcl缓冲液、kcl、dtt、edta、甘油等，另一方面反应体系也需要化学试剂参与，如mg离子、dtt、atp等。试剂种类的减少可节约成本、简化操作。[0060]2)操作简便。如上所述，由于反应所需的试剂种类少，只需要在rna中加入含有gtp(仅就i型自剪接内含子而言)和离子的缓冲液，即可在pcr仪上一步完成环化反应。相比之下，使用rna连接酶进行连接反应时，至少要加入额外的连接酶。[0061]3)设计简便。对于分子量较大的环形rna，例如含有编码序列的环形rna，直接连接的效率很低，通常还需要引入外源的夹板dna(dnasplint)，这需要rna和dna的精确配对，增加了设计和操作的复杂性。[0062]图9中展示了ii型内含子的二级结构示意图。如图9所示，ii型内含子主要包括6个茎环结构，称为结构域1-6(d1-d6)，6个结构域顺序排列，其中含有多个外显子结合序列(exonbindingsequence；ebs)，如ebs1、ebs2、ebs3。这些ebs序列与外显子区域中的内含子结合序列(ibs)进行相互作用如互补配对，依靠核酸序列内部自身的羟基触发剪接。这种剪接机制更接近通过剪接体介导的剪接反应，更类似于高等生物的剪接。[0063]在优选的实施方案中，ii型内含子来源于微生物界(bacteriadomain)。在具体的实施方案中，ii型内含子来源于梭菌属(clostridium)如破伤风梭菌(clostridiumtetani)或芽孢杆菌属(bacillus)如苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。本领域技术人员能够理解，本发明的关键在于构建体和方法的设计，这种设计适用于各种ii型内含子。本发明的实施不局限于具体的ii型内含子类型，只要该ii型内含子在体外具有自剪接成环活性即可，这种活性是本领域技术人员通过常规手段能够确认的。[0064]在本发明的实施方案中，ii型内含子可以是野生型ii型内含子或经修饰的ii型内含子。所述经修饰的ii型内含子包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。优选所述修饰不影响ii型内含子的自剪接活性，特别是体外自剪接活性。[0065]本发明的构建体[0066]在本发明的上下文中，可以将天然自剪接核酶称为自剪接核酶或crnazyme前体，将重排并改造后的自剪接核酶称为crnazyme。进一步地，将与目标序列，如蛋白编码序列或蛋白非编码序列，连接起来的crnazyme称为crnazyme构建体，即本发明的多核苷酸构建体。[0067]具体来说，通过将由天然ii型内含子及其两个侧翼的外显子片段(e1、e2)组成的一段序列(e1-内含子-e2)一分为二，形成两个片段，即结构为e1‑ꢀ5’内含子片段的第一片段，和结构为3’内含子片段-e2的第二片段。其中5’内含子片段原先位于3’内含子片段的5’端，并且彼此紧邻。在构建crnazyme时，将所述第一片段和第二片段位置互换并重新连接。重排后的序列结构为“3’内含子片段-e2-e1-5’内含子片段”。将具有这种结构并且具有自剪接活性的序列成为crnazyme。所述自剪接活性优选是发生自剪接并使插入其中的目标蛋白序列形成环形rna的活性。所述自剪接活性优选是在体外发生自剪接的活性。[0068]在将crnazyme用于催化目标蛋白形成环状rna时，将目标蛋白序列，包括目标蛋白编码序列和/或非编码序列，构建到crnazyme的e2和e1之间的位置，由此形成crnazyme构建体。crnazyme构建体可以通过转录成为rna，然后通过其中含有的crnazyme结构元件发生自剪接，使其中含有的目标蛋白序列形成环形rna。[0069]总体而言，基于ii型内含子(crnazyme前体)设计crnazyme构建体的原则是在整体长度尽量短的情况下保留最大的环化效率。发生自剪接成环反应后，内含子部分会被切出，如图1所示。获得的环形rna产物中不再包含内含子部分。因此环形rna产物要比未发生剪接反应的线性crnazyme构建体结构的总核苷酸数少。基于这点，可以通过琼脂糖凝胶电泳来区分环形rna产物和crnazyme构建体。在本发明的上下文中，将环化效率(percentofcyclizing,pc)定义为环形rna占线性rna和环形rna总和的百分比。具体的定量方式采用本领域常用的半定量方式，根据凝胶电泳图中条带的强度来确定。[0070]基于上述原则，e1和/或e2的长度优选不超过20个核苷酸，例如不超过10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特殊的实施方案中，e1和e2可为0。[0071]同样基于上述原则，crnazyme构建体中的内含子序列，如5’内含子片段和/或3’内含子片段，和/或外显子序列，如e1和/或e2，相对于其天然存在的野生型序列，可以包含一个或多个核苷酸的修饰，例如一个或多个核苷酸的添加、删除、取代。[0072]在一个实施方案中，为了使序列缩短，可以在不影响活性的情况下，删除一部分序列或核苷酸。例如，可以删除ii型内含子结构域4中的内含子编码蛋白(iep)序列。结构域4中的iep序列或类似的结构存在于全部ii型内含子中，其编码具有逆转录酶活性的蛋白质，该蛋白质可催化内含子充当逆转录因子，并通过rna中间体在其基因组中移动。这一功能是天然ii型内含子在基因组中进行逆转录转座所需的，但是在体外转录中不需要此功能，因此在本发明的构建体中可以删除结构域4中的该段序列的部分或全部。[0073]e1和e2通常需要包括ibs序列，从而与内含子中所含的ebs序列进行相互作用以实现自剪接。在本发明的一个实施方案中，e1和e2序列可以为0，这样的好处是在最终成环的rna中除了目标序列不再包含任何其他序列。在这种情况下，为了保证内含子中的ebs仍然能够有与之配对的“ibs”序列，需要对内含子的ebs序列进行修饰，使其与目标序列中的一段序列互补配对，从而发生相互作用。换言之，将目标序列中的一段序列视作“ibs”，与内含子中经过修饰的ebs序列发生相互作用，以确保自剪接的完成。[0074]因此，在本发明的一个实施方案中，所述ii型内含子是经修饰的ii型内含子，具体来说是ebs区经修饰的ii型内含子。所述修饰可以是一个或多个核苷酸的取代，具体来说取代一个或多个ebs区的核苷酸，从而使得经修饰的ebs区与目标序列中的一段相应长度的区域互补配对。所述互补配对意指两段序列在转录成rna之后，能够互补配对，所述配对涵盖rna中的g和u的配对方式。所述经修饰的ebs的长度可为3-20个核苷酸，优选5-15个核苷酸，更优选6-10个核苷酸，例如6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。[0075]与修饰的ebs互补配对的目标序列区域可以存在于目标序列的任意位置，只要能够实现与ebs配对，并由此形成能够促成自剪接的二级结构即可。通常而言，可以使用目标序列两端的序列作为修饰的ebs设计的基础，这是因为两端的序列在构建体中位于原先e1和e2所处的位置，而e1和e2的位置也是原先与ebs进行相互作用的ibs序列的位置。因此，在具体的实施方案中，所述经修饰的ebs区是经修饰的ebs1和ebs3区。在具体的实施方案中，与经修饰的ebs区互补配对的目标序列中的区域位于目标序列的3’和/或5’末端。[0076]由于这种互补配对的目的是为了确保ebs和充当ibs的目标序列片段之间的相互作用，因此只要相互作用存在，可以允许一定程度的错配。在一些实施方案中年，所述经修饰的ebs区与目标序列中的一段相应长度的区域在至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或100％的核苷酸位置上互补配对，或与与目标序列中的一段相应长度的区域的互补配对序列具有至少60％的同一性，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或100％的同一性。[0077]在另一个实施方案中，所述5’内含子片段和3’内含子片段中可以包含一对或多对彼此互补的配对序列。这样的配对序列使5’内含子片段和3’内含子片段在空间上的距离缩短，从而促进环化反应发生。在优选的实施方案中，所述互补配对序列的长度至少为约20个核苷酸。[0078]构建体中的目标序列可以包含任意希望制备成环形rna的序列。目标序列可以是蛋白编码序列，或蛋白非编码序列，或二者的组合。换言之，目标序列中可以包含多种元件。蛋白编码序列可以编码任意蛋白，例如选自功能性蛋白、抗原蛋白、信号肽、标签蛋白等。[0079]例如，目标序列中包括的蛋白非编码序列可以是间隔序列，例如富含at的序列，其可以调节序列的柔性。这种间隔序列可以位于目标序列中的任意位置，例如位于目标序列的一端，紧邻e1和/或e2的位置。[0080]例如，目标序列中包括的蛋白非编码序列可以是翻译调控序列，如内部核糖体进入位点(ires)。可用于本发明的ires可以来自任何来源。[0081]本发明的crnazyme和crnazyme构建体以dna的形式完整制备，然后通过转录和自剪接形成期望的环形rna。[0082]自剪接反应体系[0083]ii型内含子的自剪接需要在高盐条件下完成。相较于i型内含子，其不需要引入gtp。[0084]在本发明的具体实施方案中，自剪接反应使用的自剪接缓冲液含有10mm-100mm，如10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm的二价镁离子，如mgcl2。所述自剪接缓冲液可以含有10mm-100mm，如10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm的nacl。[0085]在优选的实施方案中，本发明的自剪接反应在体外进行约5min至约1h，如约5min、约10min、约15min、约20min、约25min、约30min、约35min、约40min、约45min、约50min、约55min、约1h。[0086]在优选的实施方案中，本发明的构建体能够实现至少30％的成环率，如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，至少95％的成环率。[0087]纯化[0088]可以对通过本发明的构建体或方法生成的环形rna进行纯化。例如，所述纯化方式选自下组中的一种或多种：酶处理；层析，包括但不限于亲和柱层析、反向硅胶柱液相色谱、凝胶排阻液相色谱；电泳，包括但不限于凝胶电泳如琼脂糖凝胶电泳，和毛细管电泳。[0089]在将环形rna产物转染进入细胞之前，优选通过纯化处理尽可能地去除未成环的线性rna、dsrna以及其他不想要的组分。线性rna和一些dsrna两端的磷酸基团会激活rig-1信号通路，在细胞中引起强烈的免疫反应，导致外源rna的降解，影响环形rna在细胞中发挥功能。用于去除线性rna的方法包括酶处理，如用rnaser处理；层析，如高效液相色谱(hplc)。用于去除末端磷酸基团的方法包括用碱性磷酸酶处理，如来源于牛小肠的碱性磷酸酶(calfintestinalalkalinephosephate；cip)。[0090]施用和递送[0091]通过本发明的构建体或方法生成的环形rna可以使用多种递送系统中的任一种递送到细胞内或动物体内。例如，所述递送系统选自下组中的一种或多种：脂质体(liposome)、聚乙烯亚胺(pei)、有机金属框架材料(mofs)、脂质体纳米材料(lnp)、聚阳离子(polycation)、血液糖蛋白(bloodglycoprotein)、红细胞运输载体(redbloodcells)、金纳米颗粒载体(aunps)、磁性纳米材料载体(magneticnanoparticles)、碳纳米管(carbonnanotubes)、石墨烯分子载体(graphene)、量子点材料载体(quantumdots)、上转换纳米晶(upconversionnanoparticles)、层状氢氧化物材料载体(layereddoublehydroxides)、硅晶纳米材料(silicananoparticles)、磷酸钙(calciumphosphate)。[0092]用途[0093]取决于目标序列的种类，通过本发明的构建体或方法生成的环形rna可用于实现多种用途。例如，在目标序列包含蛋白编码序列或由蛋白编码序列组成时，形成的环形rna可以用于蛋白质的表达。本发明的环形rna还可以用于调节mirna活性、中和rna结合蛋白结合、表达适配体等多种功能。实施例[0094]为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。[0095]实施例1.ii型内含子的筛选[0096]本实施例涉及确认天然ii型内含子的体外自剪接能力的方法。[0097]首先，根据ii型内含子的天然序列直接合成dna序列(金维智公司(genewiz)，苏州)，合成的dna序列除了ii型内含子序列本身之外，还包括天然存在于侧翼的外显子e1、e2序列，特别是与ii型内含子紧邻的外显子中的内含子结合区的全部或部分。将所述dna序列通过分子生物学手段克隆到含有rluc(海肾荧光素酶，renillaluciferase)编码序列的表达载体psicheck-2(promega,c8021)中。具体来说，将psicheck-2用内切酶xhoi(新英格兰biolabs公司(neb))进行单酶切，然后将所述合成的dna序列使用dna无缝克隆方法(abclonaltechnology，武汉)克隆进入经酶消化的载体中，位于rluc的3’下游，以获得相应的构建体。该表达载体的骨架是包含t7启动子和终止子的pcdna3.1。[0098]使用针对t7启动子和t7终止子的通用引物，从上述载体进行pcr扩增，以获得转录用模板dna。该pcr反应的条件为：95℃30s，60℃20s，72℃60s，23-25个循环。将pcr扩增得到的模板dna用酚氯仿1:1体积抽提，再用2.5倍体积无水乙醇沉淀，由此进行纯化。[0099]将纯化后的模板dna通过t7rna聚合酶(neb或promega)进行体外转录，转录反应按照制造商说明书推荐的条件进行。将转录产物用dnasei在37℃消化30分钟以降解pcr模板。再通过柱纯化对转录产物进行纯化，得到高纯度rna。[0100]将经过柱纯化的转录产物rna加入自剪接缓冲液(10，20，50或100mmmgcl2，50mmnacl，40mmtris-hcl，ph＝7.5)进行自剪接反应。反应条件为95℃1min,75℃至45℃(-0.5℃,15sec/循环,共60个循环)，45℃保持并加入缓冲液，45℃5min，53℃15-30min(见图2b)。在体外发生自剪接反应后，取200ng产物使用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，以检测ii型内含子的自剪接效率。[0101]如果成功发生自剪接，则会产生大小不同的两条rna，未剪接的(unspliced)rna尺寸较大，在凝胶电泳图中位于上方；剪接后的rna(spliced)较小，在凝胶电泳图中位于下方。例如，图3中显示了两种经上述方法鉴定可以发生自剪接的ii型内含子的电泳结果，即来自苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的ii型内含子bth和来自破伤风梭菌(clostridiumtetani)的ii型内含子cte(图3)。图3中的箭头分别示出了通过电泳分开的未剪接和剪接后的rna。将通过本实施例的方法确认的ii型内含子及其侧翼外显子序列(如seqidno:1或seqidno:2，其分别包含bth和cte的ii型内含子及其侧翼6个核苷酸的e1和6个核苷酸的e2)作为制备自剪接核酶构建体crnazyme的前体，或称为crnazyme前体。[0102]实施例2.制备包含ii型内含子的表达构建体[0103]在通过筛选得到的具有自剪接性质的ii型内含子crnazyme前体基础上，进一步制备自剪接核酶crnazyme构建体。如上所述，设计crnazyme构建体的总原则是内含子序列和e1、e2序列的总长度尽可能小，成环率尽可能高。[0104]本实施例详细阐述使用实施例1中筛选出的ctecrnazyme前体来设计和制备crnazyme构建体的过程。[0105]在ctecrnazyme前体序列(seqidno:2，共1028个核苷酸长，包含cte内含子本身以及两端各6个核苷酸的外显子序列，即e1和e2均为6个核苷酸长)的基础上，删除了结构域4(domain4)中的310个核苷酸的内含子编码蛋白(iep)序列(seqidno:2的核苷酸位置625-934)，保留了可以进行正确折叠而保持自剪接活性的序列，包括两端少量外显子(各6nt，即ibs1和部分ibs3)，获得e1-cte△iep-e2序列。然后将e1-cte△iep-e2序列从内含子内部的位置处一分为二。将分割后的两个片段互换位置，将由e1和5’内含子片段组成的第一片段构建到插入片段rluc的3’端，将由3’内含子片段和e2组成的第二片段构建到插入片段rluc的5’端。在此基础上，在新形成的片段的5’端插入aataccttacttaatagtaacaatagaaaatc(seqidno:14)，3’端插入aagctagatcatattactattaagtaaggtatt(seqidno:15)，由此获得crnazyme_cte构建体。seqidno:14和seqidno:15这两段插入序列作为“同源臂”可使5’和3’剪接位点彼此接近，提高剪接效率。在分割内含子时，尝试了三种不同的分割位置，分别位于结构域1(第369与370位之间)、结构域3(第560与561位之间)和结构域4(第825与826位之间)中的环状(loop)区域中，因此形成了三种crnazyme，分别称为crnazyme_ctev1、crnazyme_ctev2、crnazyme_ctev3。在阳离子的存在下，在体外进行自剪接成环反应，以测试获得的crnazyme的环化活性。从图4b可见，不同位置分割后剪接效果不同，其中第三种分割方式(v3)剪接效果最好，以其进行后续实验，该构建体的序列如seqidno:16所示。[0106]根据片段大小，认为图4b的凝胶电泳图中以圆形示出的条带代表了环形rna。通过rt-pcr和sanger测序对其即序列进行验证，确定了该条带是包含跨e1e2接头(junction)的序列，证明e1、e2已经连接到了一起。但据此尚无法确认其为环形rna，因为该条带也可能是来自于反向剪接的转录本，或其他序列。为了确认环形rna的成功形成，基于环形rna头尾共价闭合的特征，使用了以下三种方法来验证它的结构(图4c)。[0107]方法一[0108]对cte中的剪接位点进行了突变，使其丧失成环能力，作为长度相同但不能成环的线性rna对照。具体来说，将seqidno:2中的剪接位点(第1-26位核苷酸)进行突变，将第3位的c变为a，第5位的t变为g，第17位的g突变为t，第18位的c突变为t，第21位的a突变为c，第26位的t突变为g。本领域技术人员能够理解此突变旨在破坏成环的能力，也可以进行数量不同、位置不同、类型不同的其他突变来实现类似的目的。将突变后的cte称为cte-mut(seqidno:3)。然后使用多聚腺苷酸酶为此突变的线性rna添加polya尾巴。由于环形rna首尾闭合且没有3’末端，因此不能加尾，而线性rna可以通过该反应加上数百个腺苷酸，通过琼脂糖凝胶电泳分辨加尾前后rna大小变化。[0109]具体步骤包括：[0110](1)将纯化的环形rna或对照线性rna通过poly(a)加尾酶(neb)进行加尾，反应条件是37℃，30min；[0111](2)加入rnaser(lucigen)消化线性rna，反应条件是37℃，30min；[0112](3)柱纯化rna。[0113]如图4c上部小图所示，泳道3、4是添加了polya尾巴的产物，对比泳道1、2是未添加polya尾巴的产物。在未成环的情况下，基于cte和cte‑ꢀmut的crnazyme条带在进行加polya反应后均出现上移，表明分子变大，polya添加成功。与之不同的是，推定未环状rna的条带在进行和不进行加polya反应的条件下基本上处于相同的位置，具有相同的大小。[0114]方法二[0115]使用rnaser进行消化。rnaser是一种3’‑5’核糖核酸外切酶，可以从头降解掉线性的rna分子，闭环结构的环形rna则不能被降解。通过琼脂糖凝胶电泳可以分辨rna是否被消化。[0116]具体步骤包括：[0117](1)通过退火反应，将dna探针结合到rna上，反应条件是95℃反应2min，然后缓慢逐级降温至25℃。探针序列见seqidnos:7和8。[0118](2)用rnaseh(neb)消化dna/rna双链，反应条件是37℃，30min；[0119](3)柱纯化rna。[0120]如图4c上部小图所示，泳道5、6为rnaser处理后的结果，泳道1-4为未进行rnaser处理的结果。可以看到较大的线性rna条带在经过rnaser处理之后消失(泳道5和6)，而泳道5中推定为环形rna的条带仍然存在。[0121]方法三[0122]使用rnaseh进行消化。rnaseh是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解dna-rna杂合链中的rna。因为线性rna和环形rna结构不同，与相同dna探针结合后，可以被rnaseh切割成长度不一的片段。通过琼脂糖凝胶电泳可以分辨被切割产生的rna片段的长度，从而反推rna本来的结构。具体来说，对于环形rna而言，用两个dna探针与rna进行结合，然后进行切割，会得到两条条带。与之不同，如果没有成环，仍然保持线性，采用同样的方法应该会得到三条条带。如图4c下部小图所示，本技术的产物获得了两条条带。[0123]通过以上三种方法获得的结果，均证实了环形rna的成功形成，验证了构建的crnazyme_cte的环化活性。[0124]实施例3.通过优化反应体系和改造构建体提高自剪接效率[0125]为了提高最终环形rna产率，首先需要提高环化效率(图5a)。发明人从两方面对表达构建体的环化效率进行了优化。[0126]反应条件优化[0127]发明人尝试了反应体系中多种不同的离子浓度(50mm和100mm的nacl；2mm、5mm、10mm、20mm的mg2 )和多种不同的反应时间(5分钟、15分钟、30分钟)的组合，来确定最优反应体系。[0128]发现在20mmmg2 、50mmnacl的反应体系中，进行15和30分钟的条件下，可将环化效率从现有的30％提高至60％以上(图5b)。[0129]序列优化[0130]根据rna二级结构进一步改造了序列。具体来说，在插入不同目标序列之后，有些序列会因为结构原因而不能有效地进行剪接。在这种情况下，通过在目标序列中纳入一些间隔序列增加结构的柔性来提高剪接效率，例如该间隔序列可以是富含at的序列。[0131]在实施例2的基础上，通过分子克隆手段在crnazyme_cte中rluc前端插入了三种不同的间隔序列，即seqidno:4的间隔序列1，seqidno:5的间隔序列2，和seqidno:6的间隔序列3，得到三种进一步优化的构建体。在实施例2中确定的最优自剪接反应体系(10mmmg，50mmnacl，30分钟反应时长)中使这三种带有间隔序列的构建体发生了体外环化。从图5c的结果可知，加入3种间隔序列后的成环效率分别约为60％、80％、98％(图5c)。[0132]实施例4.制备不含疤痕序列的“无痕”环形rna[0133]使用前述方法获得的环形rna仍然会含有少量的非目标序列，即来自外显子e1、e2的序列。为了去除这些序列，可以对构建体进行进一步的改造。[0134]在制备crnazyme构建体时，目标序列的两端分别为长度较短的e2和e1，它们分别来源于ii型内含子侧翼外显子区的内含子结合(ibs)序列，一般而言长度在0-20个核苷酸之间。在形成环形rna时，不希望包括非目标序列之外的序列，如外显子序列e1和e2。若直接去掉e1和e2，则会因为缺乏与内含子中的ebs序列相互作用的ibs序列而影响自剪接成环过程。本发明的发明人创新性地想到，可以将目标序列的一部分直接视为“ibs”序列，通过修改内含子中的ebs，使其能够与目标序列中被视为“ibs”的区域发生相互作用。这样的方法在保证crnazyme构建体具有自剪接功能的同时，摆脱了对外显子序列e1和e2的依赖，将其从构建体和最终成环产物中去除。[0135]仍然以cte核酶为例，配合不同的目标序列(gfp，gluc和2a肽)来说明本实施例的crnazyme构建体设计思路。[0136]根据各个目标序列两端各6个核苷酸的序列，将ii型内含子中的ebs1和ebs3序列分别替换为这两段6核苷酸的序列至少部分互补配对的序列。具体来说，使ebs3与目标序列处于线性状态时(如在crnazyme构建体自剪接成环之前的状态)5’端的6个核苷酸互补配对，ebs1与目标序列处于线性状态时3’端的6个核苷酸互补配对。具体修饰序列如图6b右侧图所示，显示了针对三种不同的目标序列设计的用于修饰的ebs1和ebs3序列。值得注意的是，改造过的ebs1和ebs3不必与充当“ibs1”和“ibs3”的目标序列片段完美互补配对。可以允许其中有一定比例的错配，或是a和g、g和u这种牢固程度稍低的配对方式。一般来说，用于对ii型内含子中的相应序列进行取代的ebs1和ebs3序列与目标序列相应区域在至少60％的核苷酸位置上互补配对，或与目标序列相应区域的互补配对序列至少60％相同。[0137]从电泳结果可以看到，在使用不同目标序列(gfp，gluc和2a肽)的情况下，该改造方法均有效生成了环形rna(图6b，左)。通过sanger测序结果可以确认这种改造可将外源疤痕序列完全消除(图6b，右)。如图6b所示，具有如上修饰的ebs的crnazyme构建体在成环之后，目标序列的两端(带有阴影的两段6核苷酸序列，分别充当“ibs1”和“ibs3”)直接收尾相接，中间不再以e1和e2分隔。这更有益于生成的环形rna的后续应用。将以这种方式改造的构建体称为“无痕”构建体，成环后的环形rna称为“无痕”rna。[0138]实施例5.不同长度目标序列的成环结果[0139]基于实施例2和3中的方法，发明人还尝试了不同长度的目标片段。这些目标片段分别为555个核苷酸的gluc，其核苷酸序列如seqidno:9所示；936个核苷酸的rluc1，其核苷酸序列如seqidno:10所示；以及1160个核苷酸的rluc2，其核苷酸序列如seqidno:11所示。gluc和rluc1的构建体中未加入间隔序列，rluc2构建体由cat1ires序列和rluc组成。[0140]发现测试的片段均可以高效地进行自剪接，得到环形rna产物(图7)。[0141]实施例6.使用本发明的构建体表达目的基因[0142]在此基础上，进一步测试了不同目标序列的环形rna产物在转染细胞之后的表达情况。[0143]为了尽量减少线性rna引起的免疫降解，在转染前，对rna产物进行以下三步处理。[0144](1)rnaser处理，以消化线性rna。反应条件是37℃，30min。[0145](2)cip处理，以去除线性rna两端磷酸基团。反应条件为加入quickcip(neb)，37℃下反应30min；[0146](3)hplc纯化，以去除小的线性rna。hplc条件为：凝胶排阻色谱柱:watersbeh450a，柱温:40℃，流速：1min/ml，洗脱条件：0‑ꢀ30min,100％缓冲液a(10mmtris,0.5mmedta,depc水配制)。[0147]将目标rna用lipornamax(invitrogen)进行转染，转染条件参考供应商的说明书，转染时间为24小时。[0148]采用实施例2和3中的构建方法(采用间隔序列2)，并进行了实施例4中描述的可实现无痕成环的修饰，测试了不同目标序列。为了便于检测蛋白的表达，构建了含有荧光蛋白编码序列的构建体包括ires-gfp(seqidno:12)和ires-gluc(seqidno:13)。ires的加入可启动不依赖帽子结构的非经典翻译，使环状rna中的编码序列能够翻译成蛋白。[0149]针对不同的目标序列，使用了不同的方法来检测蛋白的表达。[0150]对于翻译产物是gfp的情况，通过在显微镜下观察荧光，用ripa裂解液(碧云天)裂解细胞，然后通过westernblot检测蛋白表达。确定通过本发明的方法获得了gfp的表达(图8a)。[0151]对于翻译产物是萤光素酶的情况，先用passive裂解液(promega)裂解细胞，然后用荧光素酶检测试剂盒(promega)通过酶标仪检测蛋白表达。确定通过本发明的方法获得了gluc蛋白的表达(图8b)。[0152]参考文献[0153]1.yangy,fanx,maom,songx,wup,zhangy,jiny,yangy,chenll,wangy,etal:extensivetranslationofcircularrnasdrivenbyn(6)‑ꢀmethyladenosine.cellres2017,27:626-641.[0154]2.aben,matsumotok,nishiharam,nakanoy,shibataa,maruyamah,shutos,matsudaa,yoshidam,itoy,abeh:rollingcircletranslationofcircularrnainlivinghumancells.scirep2015,5:16435.[0155]3.gaox,xiax,lif,zhangm,zhouh,wux,zhongj,zhaoz,zhaok,liud,etal:circularrna-encodedoncogenice-cadherinvariantpromotesglioblastomatumorigenicitythroughactivationofegfr-stat3signalling.natcellbiol2021,23:278-291.[0156]4.pamudurtinr,bartoko,jensm,ashwal-flussr,stottmeisterc,ruhel,hananm,wylere,perez-hernandezd,rambergere,etal:translationofcircrnas.molcell2017,66:9-21e27.[0157]5.puttarajum,beenmd:groupipermutedintron-exon(pie)sequencesself‑ꢀsplicetoproducecircularexons.nucleicacidsres1992,20:5357-5364.[0158]6.mikheevas,hakim-zargarm,carlsond,jarrellk:useofanengineeredribozymetoproduceacircularhumanexon.nucleicacidsresearch1997,25:5085-5094.[0159]7.wesselhoeftra,kowalskips,andersond:engineeringcircularrnaforpotentandstabletranslationineukaryoticcells.naturecommunications2018,9.[0160]8.saldanhar,mohrg,belfortm,lambowitzam:groupiandii型introns.fasebj1993,7:15-24。当前第1页12当前第1页12
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