一种高载药量的靶向载药体系及其构建方法与应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高载药量的靶向载药体系及其构建方法与应用，特别涉及一种新型、高效、智能的靶向载药体系及其构建方法与应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的抗肿瘤化疗药物由于其对正常组织和细胞的毒副作用，使其在临床的使用受到一定的限制。以多柔比星(dox)为例，其是一种广泛在临床上使用的蒽醌类抗生素类化疗药物。dox分子结构中含有扁平的芳香环，可通过嵌入基因组dna，并优先与双链5'-gc-3'或3'-gc-5'碱基对结合，从而抑制dna的复制。但是各类化疗药物往往缺乏靶向性，在抑制癌细胞的同时也会对正常的组织细胞造成损伤，给患者带来肠胃、神经系统、心血管系统及肝脏的毒副作用。常规化疗药物普遍存在的毒副作用大、耐药性强等缺陷，是导致肿瘤患者治疗失败的主要原因。
3.将化疗药物辅以合适的载药体系，可以有效降低化疗药物的毒副作用并增强其疗效。由此，设计新型药物载体，用以提高常规化疗药物的疗效，达到高效、靶向治疗的目的，一直是药物研发的热点。自seeman教授首次公开阐明dna可以用来构建纳米结构以来，dna纳米技术引起了全球研究者们的广泛关注，并获得了长足发展。dna纳米结构不仅可以单独作为药物载体，还可以修饰到其它载体上，通过刺激响应控制释放药物。近年来，借助dna结构对肿瘤微环境的特殊响应而构建新型药物载体已成为纳米载药技术的研究热点，吸引了众多研究者的目光。但是，目前dna纳米载药体系依然存在对肿瘤细胞微环境响应性不强、自身易被免疫清除等弊端。针对上述问题，如何根据细胞特点，设计出响应性好、选择性高、不仅能高效载药更能智能释药的新型dna载药体系一直是药物研发人员追求的目标。
4.g-四链体(g-quadruplex)是由富含鸟嘌呤(g)串联重复的核苷酸序列形成的一种特殊二级结构，其二级结构可以随着体系环境中金属离子浓度或类型的变化而发生自主结构转换。寡聚核苷酸序列hu22是一种可以根据环境中不同离子类型及浓度呈现不同构型的g-四链体：在高钠溶液中呈分子内反平行g-四链体结构，而在高钾溶液中呈以分子内平行g-四链体结构为主的混合型结构。目前已有研究人员基于hu22g-四链体对环境中不同金属离子类型的响应以及核酸适配体对肿瘤细胞的靶向识别能力，设计并构建了一种靶向载药体系(zl 201810565680.x)。该载药体系主要是有三部分组成：适配体序列100、可变构序列200和连接序列300。其中适配体序列主要是靶向作用，可变构序列是起到载运和释放药物的作用，连接序列主要是为了保障不同功能dna之间不存在相互干扰。但上述载药体系对于化疗药物的载运主要依靠可变构序列(hu22 g-四链体)来实现，而hu22 g-四链体与化疗药物的配比是1:1或1:2，即一个g-四链体只能载运1～2个药物分子，存在载药量偏低的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种新型、高效、智能的靶向载药体系及其构建方法与应用。
6.为了实现上述目的，本发明首先提供了一种核酸分子。
7.本发明提供的核酸分子依次包括核酸适配体序列、单链dna分子甲、单链dna分子乙、可形成g-四链体的可变构序列、所述单链dna分子乙和所述单链dna分子甲的反向互补序列；
8.所述单链dna分子甲为由碱基g和/或碱基c组成的单链dna分子；
9.所述单链dna分子乙为由碱基t或碱基a组成的单链dna分子。
10.上述核酸分子即为本发明中的靶向载药体系，其包括核酸适配体序列、载药序列、缓冲延长序列和可形成g-四链体的可变构序列；
11.其中，所述核酸分子中的可形成g-四链体的可变构序列主要作用是载运和释放药物。
12.所述核酸分子中的单链dna分子甲和单链dna分子甲的反向互补序列互补配对后形成的双链互补dna序列即为载药序列，主要作用是载运和释放药物。
13.所述核酸分子中的单链dna分子乙为缓冲延长序列，其修饰在可变构序列的两端，主要作用是有效防止g-四链体和双链互补dna序列的相互干扰。
14.所述核酸分子中的核酸适配体序列主要作用是靶向肿瘤细胞。
15.上述核酸分子中，所述单链dna分子甲可为连续的碱基g或连续的碱基c或碱基g和碱基c交替排列组成的单链dna分子；所述单链dna分子甲的大小至少为2bp，具体可为2-10bp，如2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp，优选4bp。
16.上述核酸分子中，所述单链dna分子乙的大小为2-8bp，具体可为2-8bp，如2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp，优选6bp。
17.上述核酸分子中，所述可形成g-四链体的可变构序列可为任一种可形成g-四链体的可变构序列，具体可为seq id no.1所示的hu22序列。
18.上述核酸分子中，所述核酸适配体可为任一种靶向肿瘤细胞的核酸适配体，如非小细胞肺癌细胞核酸适配体s6、核仁素核酸适配体as1411、黏蛋白1核酸适配体apt、酪氨酸核酸适配体sgc8或前列腺特异性膜抗原核酸适配体a10。
19.进一步的，所述核酸适配体序列和所述载药序列之间还包括连接序列；所述核酸分子依次由核酸适配体序列、连接序列、单链dna分子甲、单链dna分子乙、可形成g-四链体的可变构序列、所述单链dna分子乙和所述单链dna分子甲的反向互补序列组成。
20.更进一步的，所述连接序列具体可为两个碱基t。
21.在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸分子如seq id no.2所示。
22.在本发明的另一个具体实施方式中，所述核酸分子如seq id no.3所示。
23.在本发明的又一个具体实施方式中，所述核酸分子如seq id no.4所示。
24.上述核酸分子可作为药物载体，其中，可形成g-四链体的可变构序列在高钠溶液中呈分子内反平行g-四链体结构，可结合药物，而在高钾溶液中呈分子内平行g-四链体结构，可释放药物，与此同时，在所述可变构序列的3'端和5'端分别修饰的一段dna互补序列即载药序列，可以借助可变构序列对环境中金属离子的响应而发生结构转化的特性，同样可以实现药物的载运和释放，进一步提高了药物载体的载药量。由于人体的细胞内是高钾环境而细胞外则是高钠环境。由此，利用可变构序列在细胞内外不同离子浓度环境中构型转变的特性，可变构序列和载药序列共同实现了细胞外结合药物、细胞内精确释放药物的
效果。
25.为了实现上述目的，本发明还提供了一种药物组合物。
26.本发明提供的药物组合物包括上述核酸分子和药物。
27.本发明的药物组合物在钾离子浓度至少为100mm的环境中时，所述药物与所述核酸分子分离，在钠离子浓度至少为100mm的环境中时，所述药物与所述核酸分子结合。
28.进一步的，所述药物可为对肿瘤或肿瘤细胞具有杀伤治疗作用的任一种具有共轭平面的药物，优选具有苯环和/或萘环的药物、带有正电荷或金属离子的药物、具有氨基的药物，如多柔比星(dox)、米托蒽醌(mitx)、环磷酰胺(ctx)、顺铂(ddp)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、紫杉醇(tax)等。
29.在本发明的一个具体实施方式中，所述药物为多柔比星(dox)。
30.在本发明的另一个具体实施方式中，所述药物为米托蒽醌(mitx)。
31.更进一步的，所述核酸分子与所述药物的摩尔比可为1：(1～10)，具体可为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
32.为了实现上述目的，本发明最后提供了如下1)-7)任一种应用：
33.1)上述核酸分子在作为药物载体中的应用；
34.2)上述核酸分子在载运和释放药物中的应用；
35.3)上述核酸分子在提高载药量中的应用；
36.4)上述核酸分子在制备上述药物组合物中的应用；
37.5)上述核酸分子或上述药物组合物在制备抑制肿瘤细胞的产品中的应用；
38.6)上述核酸分子或上述药物组合物在制备治疗肿瘤的产品中的应用；
39.7)上述核酸分子或上述药物组合物在制备减少抗肿瘤药物对正常细胞的毒副作用的产品中的应用。
40.上述任一所述应用中，所述肿瘤可为任一种肿瘤，包括但不限于乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌和急性淋巴白血病。
41.所述肿瘤细胞可为任一种肿瘤细胞，包括但不限于乳腺癌细胞mcf-7、非小细胞肺癌细胞a549、肝癌细胞hepg-2和人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem。
42.本发明提供了一种新型高效智能靶向载药体系，该载药体系完全由核酸构成，包括核酸适配体序列、载药序列、缓冲延长序列和可形成g-四链体的可变构序列。本发明的载药体系可以在胞外环境中结合更多的药物，同时还具有良好的生物相容性，在避免抗癌药物对正常细胞损伤的同时可以安全的在人体内代谢降解，为肿瘤的高效治疗提供更精确安全的靶向给药模式。
附图说明
43.图1为本发明新型靶向载药体系的结构示意图。
44.图2为利用圆二色光谱测定寡聚核苷酸hu22序列在不同缓冲体系中的构型。
45.图3为荧光光谱验证连接了不同数量t碱基的hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力。
46.图4为荧光光谱验证连接了不同数量gc碱基对的hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力。
47.图5为新型靶向乳腺癌载药体系与单独药物对mcf-7细胞的抑制率。
48.图6为利用激光共聚焦显微镜观察细胞对药物的摄取。图中的纵坐标代表相对荧光强度。
49.图7为新型靶向人急性淋巴白血病细胞载药体系与单独药物对ccrf-cem细胞的抑制率。
具体实施方式
50.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
51.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
52.下述实施例中所涉及的细胞及来源如下：
53.乳腺癌细胞mcf-7：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：1101hum-pumc000013。
54.非小细胞肺癌细胞a549：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：1101hum-pumc000002。
55.肝癌细胞hepg-2：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：1101hum-pumc000035。
56.人脐静脉内皮细胞系huvec-t/t：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：4201pat-cctcc00692。
57.人正常乳腺上皮细胞mcf-10a：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：1101hum-pumc000406。
58.人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，资源编号：3101humtchu147。
59.下述实施例中所涉及的药物及来源如下：
60.多柔比星(dox)：cas号：25316-40-9，北京百灵威科技有限公司，产品编号：113424。
61.米托蒽醌(mitx)：cas号：70476-82-3，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，产品编号：m6545-50mg。
62.下述实施例中所涉及的细胞培养液及配方如下：
63.乳腺癌细胞mcf-7培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(gibco)，0.1mg/ml链霉素(sigma-aldrich)和100u/ml青霉素(sigma-aldrich)的dmem培养基(hyclone)。
64.非小细胞肺癌细胞a549培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(gibco)，0.1mg/ml链霉素(sigma-aldrich)和100u/ml青霉素(sigma-aldrich)的rpmi 1640培养基(hyclone)。
65.肝癌细胞hepg-2培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(gibco)，0.1mg/ml链霉素(sigma-aldrich)和100u/ml青霉素(sigma-aldrich)的dmem培养基(hyclone)。
66.人脐静脉内皮细胞huvec-t/t培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(gibco)，0.1mg/
3.714g，使用去离子水配制成500ml的ph7.4的缓冲液。
82.hu22序列：5'-agggttagggttagggttaggg-3'(seq id no.1)。
83.结果如图2所示，在高钾溶液中的hu22约在240nm处出现负峰(图2a)，说明hu22在细胞内是以平行g-四链体结构为主的混合g-四链体结构的形式存在。而处于高钠溶液中的hu22约在260nm处出现负峰，240nm和290nm处出现正峰(图2b)，说明hu22在细胞外是以反平行g-四链体结构为主的混合g-四链体结构的形式存在。
84.实施例3、最优缓冲延长序列的筛选
85.人工合成如下连接了不同数量t碱基的hu22-gc衍生序列：
[0086][0087][0088][0089][0090][0091][0092][0093][0094]
上述各序列中，下划线所示碱基为载药序列(gc互补序列)；加粗所示碱基为缓冲延长序列。
[0095]
将连接了不同数量t碱基的hu22-gc衍生序列(t2-t8)分别溶解在高钾溶液和高钠溶液(配方同实施例2)中，使其终浓度均为100μm作为储备液。然后分别将各储备液稀释至终浓度为0μm、0.25μm、0.5μm、1μm、5μm。再分别向不同浓度的hu22-gc衍生序列溶液中加入药物dox溶液，使药物dox在溶液中的终浓度均为5μm，最后通过荧光光谱验证不同hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力。荧光光谱的实验参数如下：激发波长485nm，电压700v，狭缝5nm。同时将hu22作为对照。
[0096]
结果如图3所示。从图可以看出，dox与hu22-gc衍生序列在高钠环境中结合后的荧光猝灭程度大于其在高钾环境中结合后的荧光猝灭程度，说明hu22-gc衍生序列确实在胞外(高na

环境中)与药物dox的结合强于胞内(高k

环境中)，可以通过响应细胞内外环境进行构型转变从而达到药物释放的目的。
[0097]
通过进一步对荧光猝灭数据进行分析，将上述不同碱基数缓冲序列与dox的结合常数进行了计算，结果见表1所示。从表1可知，当缓冲延长序列为6个t碱基时，载药体系在钠离子和钾离子条件下的结合常数差别最大，也就是可以有效实现在细胞外(高钠)的高效载运以及细胞内(高钾)的释放。
[0098]
表1、不同hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力
[0099][0100]
实施例4、最优载药序列的筛选
[0101]
人工合成如下连接了不同数量gc碱基对的hu22-gc衍生序列：
[0102][0103][0104][0105][0106][0107]
上述各序列中，下划线所示碱基为载药序列(gc互补序列)；加粗所示碱基为缓冲延长序列。
[0108]
将连接了不同数量gc碱基对的hu22-gc衍生序列分别溶解在高钾溶液和高钠溶液(配方同实施例2)中，使其终浓度均为100μm作为储备液。然后分别将各储备液稀释至终浓度为0μm、0.25μm、0.5μm、1μm、5μm。再分别向不同浓度的hu22-gc衍生序列溶液中加入药物dox溶液，使药物dox在溶液中的终浓度均为5μm，最后通过荧光光谱验证不同hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力。荧光光谱的实验参数如下：激发波长485nm，电压700v，狭缝5nm。同时将hu22作为对照。
[0109]
结果如图4和表2。从图中可以看出，dox与hu22-gc衍生序列在高na

环境中结合后的荧光猝灭程度大于其在高k

环境中结合后的荧光猝灭程度，说明hu22-gc衍生序列确实在胞外(高na

环境中)与药物dox的结合强于胞内(高k

环境中)。且对比不同gc碱基对数量的实验结果可以看出，当gc碱基对数量只有2对时，胞外与胞内环境(高na

与高k

环境)中药物dox与hu22-gc衍生序列的结合比都在5：1左右。而随着gc碱基对数量的增加，药物dox与hu22-gc衍生序列在胞外环境中(高na

环境)的结合比达到了10：1左右，而胞内环境中(高k

环境)结合比依然在5：1左右，药物dox与hu22-gc衍生序列在胞外环境中(高na

环境)的结合比大于在胞内环境中(高k

环境)的结合比(如表2所示)。说明对比胞内环境来说该载药体系确实可以在胞外环境中结合更多的药物dox，并通过响应细胞内外环境进行构型转变从而达到药物释放的目的。本发明新型靶向载药体系的载药序列中gc碱基对数量至少为2个时，可以实现较大载药量的目的，其中，最优载药序列为4对gc碱基对，如图4所示，4对gc
碱基对时不同离子环境中hu22-gc衍生序列对dox的负载存在比较明显的差异，具体体现为在钠离子环境中hu22-gc衍生序列对dox的负载为1：10，而在钾离子环境中为1：5，说明药物dox在钠离子环境中被hu22-gc衍生序列负载，而在钾离子环境中药物dox被hu22-gc衍生序列释放；且4对gc碱基对的hu22-gc衍生序列两端(3'端和5'端)的距离变化最明显，具体表现为在不同离子环境中dox与hu22-gc衍生序列结合后的荧光猝灭的差异程度最大。
[0110]
表2、不同hu22-gc衍生序列与药物dox的结合能力
[0111][0112]
与授权号为zl 201810565680.x中的靶向载药体系相比，其载运药物主要是通过化疗药物与hu22 g-四链体相结合，通过hu22 g-四链体的结构转换，实现抗肿瘤药物的靶向载运和释放。但是hu22 g-四链体与化疗药物的结合比是1：1或1:2，即一个g-四链体只能载运1～2个药物分子，载药量偏低，无法实现化疗药物的高效载运。而本发明的载运体系，其与化疗药物的结合比可以高达1:10(表2所示)。换言之，本发明对药物的载运能力为授权号为zl 201810565680.x中的载药体系的5倍，其可大幅提高对化疗药物的载药能力，具有载药量更多的优势。
[0113]
实施例5、新型靶向乳腺癌载药体系的构建及体外细胞毒活性测试
[0114]
1、新型靶向乳腺癌载药体系的构建
[0115]
将能在细胞内外不同离子类型及浓度环境中发生构型转变的hu22 g-四链体的3'端及5'端通过6个t碱基的延长链与一段含有4对gc碱基对的互补序列连接，并进一步将能特异识别乳腺癌细胞mcf-7的核酸适配体muc1与位于hu22序列5'端的gc互补序列通过2个t碱基相连，构成靶向乳腺癌的载药核酸分子，即新型智能靶向乳腺癌载药体系。载药核酸分子序列具体如下：
[0116]
muc1-hu22-(t)6：
[0117]
上述载药核酸分子muc1-hu22-(t)6中，波浪线所示碱基为hu22序列；加粗所示碱基为缓冲延长序列；下划线所示碱基为载药序列(gc互补序列)；斜体所示碱基为核酸适配体muc1序列；方框所示碱基为连接序列。
[0118]
2、体外细胞毒活性测试
[0119]
通过mtt实验对构建的新型智能靶向载药体系进行基于生物水平上的体外细胞毒活性测试。具体步骤如下：将mcf-7细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl(含1
×
106个细胞)，培养24小时后，加入2μl不同浓度的待测样品溶液。每个样品浓度设3个平行孔。药物
作用细胞72小时后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入200μl dmso，静置15min，于酶标仪490nm波长处测定吸光度值，计算细胞抑制率。细胞抑制率(％)＝1-(给药细胞od平均值/溶剂对照细胞od平均值)
×
100％。
[0120]
根据加入药物不同，分为dox组和mitx组。
[0121]
dox组分又分为如下各组：
[0122]
dox：待测样品溶液由药物dox和无菌水组成，药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml。
[0123]
muc1-hu22-(t)
6-dox：待测样品溶液由药物dox、载药核酸分子muc1-hu22-(t)6和无菌水组成，药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml，载药核酸分子muc1-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为1.81μg/ml、3.62μg/ml、36.21μg/ml、90.52μg/ml或181.03μg/ml。
[0124]
muc1-hu22-(t)6：待测样品溶液由载药核酸分子muc1-hu22-(t)6和无菌水组成，载药核酸分子muc1-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、500μg/ml。
[0125]
上述dox组均以无菌水作为对照组。
[0126]
mitx组又分为如下各组：
[0127]
mitx：待测样品溶液由药物mitx和含有1％(v/v)dmso的无菌水组成，药物mitx在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml或500μg/ml。
[0128]
muc1-hu22-(t)
6-mitx：待测样品溶液由药物mitx、载药核酸分子muc1-hu22-(t)6和含有1％(v/v)dmso的无菌水组成，药物mitx在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、500μg/ml，载药核酸分子muc1-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为2.07μg/ml、4.13μg/ml、41.35μg/ml、103.37μg/ml、206.75μg/ml、2067.50μg/ml。
[0129]
muc1-hu22-(t)6：待测样品溶液由载药核酸分子muc1-hu22-(t)6和含有1％(v/v)dmso的无菌水组成，载药核酸分子muc1-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、500μg/ml。
[0130]
上述mitx组均以含1％(v/v)dmso的无菌水作为对照组。
[0131]
结果如图5所示。该载药体系载运dox时，muc1-hu22-(t)
6-dox比游离的dox对mcf-7细胞的抑制率强(图5a)。该载药体系载运另一种抗癌药物米托蒽醌(mitx)时，muc1-hu22-(t)
6-mitx同样比游离的mitx对mcf-7细胞的抑制率强(图5b)。说明本发明的新型靶向乳腺癌载药体系对于乳腺癌细胞具有很强靶向作用，可将药物靶向在乳腺癌细胞内部释放。
[0132]
实施例6、利用激光共聚焦显微镜观察细胞对药物的摄取
[0133]
配制如下各实验组：
[0134]
实验组1：在乳腺癌细胞mcf-7培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)，得到体系1，dox在体系1中的浓度为1.5μm。
[0135]
实验组2：在乳腺癌细胞mcf-7培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)和muc1-hu22-(t)6溶液(溶剂为无菌的高钠溶液)，得到体系2，dox在体系2中的浓度为1.5μm，muc1-hu22-(t)6在体系2中的浓度为0.15μm。
[0136]
实验组3：在非小细胞肺癌细胞a549培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶
剂为无菌水)，得到体系3，dox在体系3中的浓度为1.5μm。
[0137]
实验组4：在非小细胞肺癌细胞a549培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)和muc1-hu22-(t)6溶液(溶剂为无菌的高钠溶液)，得到体系4，dox在体系4中的浓度为1.5μm，muc1-hu22-(t)6在体系4中的浓度为0.15μm。
[0138]
实验组5：在肝癌细胞hepg-2培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)，得到体系5，dox在体系5中的浓度为1.5μm。
[0139]
实验组6：在肝癌细胞hepg-2培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)和muc1-hu22-(t)6溶液(溶剂为无菌的高钠溶液)，得到体系6，dox在体系6中的浓度为1.5μm，muc1-hu22-(t)6在体系6中的浓度为0.15μm。
[0140]
实验组7：在人脐静脉内皮细胞huvec-t/t培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)，得到体系7，dox在体系7中的浓度为1.5μm。
[0141]
实验组8：在人脐静脉内皮细胞huvec-t/t培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)和muc1-hu22-(t)6溶液(溶剂为无菌的高钠溶液)，得到体系8，dox在体系8中的浓度为1.5μm，muc1-hu22-(t)6在体系8中的浓度为0.15μm。
[0142]
实验组9：在人正常乳腺上皮细胞mcf-10a培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)，得到体系9，dox在体系9中的浓度为1.5μm。
[0143]
实验组10：在人正常乳腺上皮细胞mcf-10a培养液(含1
×
106个细胞)中加入dox溶液(溶剂为无菌水)和muc1-hu22-(t)6溶液(溶剂为无菌的高钠溶液)，得到体系10，dox在体系10中的浓度为1.5μm，muc1-hu22-(t)6在体系10中的浓度为0.15μm。
[0144]
将上述体系1-体系10孵育15min后使用488nm的激光器进行激光共聚焦显微镜的观察。
[0145]
结果如图6所示。从图中可以观察到，当只有药物dox单独作用时，癌症细胞(mcf-7、a549和hepg-2)对药物的摄取能力较差，细胞内很少可以观察到药物dox的绿色荧光，而当使用载药体系muc1-hu22-(t)6加载药物dox后，几种癌症细胞对药物dox的摄取明显增加，绿色荧光也更明显，证明载药体系muc1-hu22-(t)6可以有效增加抗癌药物dox在癌细胞中的积累。对于正常细胞(huvec-t/t和mcf-10a)，可以观察到单独的药物dox作用时会被细胞大量的摄取，而当载药体系muc1-hu22-(t)6加载药物dox后几种正常细胞中的绿色荧光减少，证明载药体系muc1-hu22-(t)6具有良好的靶向性，可以有效的减少正常细胞对抗癌药物dox的摄取。
[0146]
实施例7、新型靶向人急性淋巴白血病细胞载药体系的构建及体外细胞毒活性测试
[0147]
1、新型靶向人急性淋巴白血病细胞载药体系的构建
[0148]
将能在细胞内外不同离子类型及浓度环境中发生构型转变的hu22 g-四链体的3'及5'端通过6个t碱基的延长链与含有4对gc碱基对的互补序列连接，并进一步将能特异识别人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem的核酸适配体sgc8与位于hu22序列5'端的gc互补序列通过2个t碱基相连，构成靶向人急性淋巴白血病细胞的载药核酸分子，即新型智能靶向人急性淋巴白血病细胞载药体系。载药核酸分子序列具体如下：
[0149]
sgc8-hu22-(t)6：
[0150]
上述载药核酸分子sgc8-hu22-(t)6中，波浪线所示碱基为hu22序列；加粗所示碱基为缓冲延长序列；下划线所示碱基为载药序列(gc互补序列)；斜体所示碱基为核酸适配体sgc8序列；方框所示碱基为连接序列。
[0151]
2、体外细胞毒活性测试
[0152]
通过cck-8实验对构建的新型智能靶向载药体系进行基于生物水平上的体外细胞毒活性测试。具体步骤如下：将ccrf-cem细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl(含1
×
106个细胞)，培养24小时后，加入2μl不同浓度的待测样品溶液。每个样品浓度设3个平行孔。药物作用细胞72小时后，每孔加入cck-8试剂10μl，继续培养4小时，于酶标仪450nm波长处测定吸光度值。细胞抑制率(％)＝1-(给药细胞od平均值/溶剂对照细胞od平均值)
×
100％。
[0153]
根据加入待测样品的不同，分为如下三组：
[0154]
dox：待测样品溶液由药物dox和无菌水组成，药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml。
[0155]
sgc8-hu22-(t)
6-dox：待测样品溶液由药物dox、载药核酸分子sgc8-hu22-(t)6和无菌水组成，药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml，载药核酸分子sgc8-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为2.07μg/ml、4.15μg/ml、41.49μg/ml、103.72μg/ml或206.45μg/ml。
[0156]
sgc8-hu22-(t)6：待测样品溶液由载药核酸分子sgc8-hu22-(t)6和无菌水组成，载药核酸分子sgc8-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml。
[0157]
上述各组均以无菌水作为对照组。
[0158]
结果如图7所示，该载药体系载运dox时，sgc8-hu22-(t)
6-dox比游离的dox对ccrf-cem细胞的抑制率强。说明该新型智能靶向人急性淋巴白血病细胞载药体系对于急性淋巴白血病细胞具有很强靶向作用，可将药物靶向在急性淋巴白血病细胞内部释放。
[0159]
实施例8、靶向载药体系体外细胞毒活性对比
[0160]
为了对比本发明载药体系与授权号为zl 201810565680.x中的靶向载药体系在体外对肿瘤细胞a549的增殖抑制作用进行了如下实验：
[0161]
本发明新型智能靶向载药体系：
[0162]
s6-hu22-(t)6：
[0163][0164]
上述载药核酸分子s6-hu22-(t)6中，波浪线所示碱基为hu22序列；加粗碱基为缓冲延长序列；下划线所示碱基为载药序列(gc互补序列)；斜体碱基为核酸适配体s6序列；方框所示碱基为连接序列。
[0165]
授权号为zl 201810565680.x中的靶向载药体系：
[0166]
hu22-(t)5ggccac-s6：
[0167][0168]
通过mtt实验对本发明新型智能靶向载药体系和授权号为zl 201810565680.x中的靶向载药体系进行基于生物水平上的体外细胞毒活性测试。具体步骤如下：将a549细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl(含1
×
106个细胞)，培养24小时后，加入2μl不同浓度的待测样品溶液。每个样品浓度设3个平行孔。药物作用细胞72小时后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入200μl dmso，静置15min，于酶标仪490nm波长处测定吸光度值，计算细胞抑制率。
[0169]
细胞抑制率(％)＝1-(给药细胞od平均值/溶剂对照细胞od平均值)
×
100％。
[0170]
根据加入待测样品的不同，分为如下4组：
[0171]
s6-hu22-(t)6：待测样品溶液由载药核酸分子s6-hu22-(t)6和无菌水组成，载药核酸分子s6-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为0.01m、0.05m、0.1m、0.5m、1m或2m。
[0172]
hu22-(t)5ggccac-s6：待测样品溶液由载药核酸分子hu22-(t)5ggccac-s6和无菌水组成，载药核酸分子hu22-(t)5ggccac-s6在待测样品溶液中的浓度为0.01m、0.05m、0.1m、0.5m、1m或2m。
[0173]
s6-hu22-(t)
6-dox：待测样品溶液由药物dox、载药核酸分子s6-hu22-(t)6和无菌水组成，其中药物dox与s6-hu22-(t)6的摩尔浓度比为10:1。药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.1m、0.5m、1m、5m、10m和20m。载药核酸分子s6-hu22-(t)6在待测样品溶液中的浓度为0.01m、0.05m、0.1m、0.5m、1m或2m。
[0174]
hu22-(t)5ggccac-s6-dox：待测样品溶液由药物dox、载药核酸分子hu22-(t)5ggccac-s6和无菌水组成，其中药物dox与hu22-(t)5ggccac-s6的摩尔比为10:1。药物dox在待测样品溶液中的浓度为0.1m、0.5m、1m、5m、10m和20m。载药核酸分子hu22-(t)5ggccac-s6在待测样品溶液中的浓度为0.01m、0.05m、0.1m、0.5m、1m或2m。
[0175]
表3、不同载药体系对人非小细胞肺癌a549细胞株的ic
50
值
[0176]
样品细胞半数抑制率ic
50
值dox15.5
±
2.0μms6-hu22-(t)650.5
±
1.0μmhu22-(t)5ggccac-s653.5
±
2.0μms6-hu22-(t)
6-dox4.5
±
0.2μmhu22-(t)5ggccac-s6-dox7.5
±
1.3μm
[0177]
结果如表3所示。结果表明：单独的抗肿瘤药物dox对人非小细胞肺癌细胞a549的增殖均具有抑制作用，其ic
50
值为15.5
±
2.0μm。两种载药体系与dox结合后，均可明显提高dox对肿瘤细胞增殖的抑制效果。进一步，通过对比可知，s6-hu22-(t)
6-dox对a549细胞株的ic
50
值(4.5
±
0.2μm)远高于hu22-(t)5ggccac-s6-dox的ic
50
值(7.5
±
1.3μm)。说明本发明的靶向载药体系对化疗药物dox的靶向载运效果显著优于授权号为zl 201810565680.x中的靶向载药体系。
[0178]
综上所述，本发明的新型智能靶向载药体系对于肿瘤细胞具有很强靶向作用，可将抗肿瘤药物靶向在肿瘤细胞内部释放，为肿瘤的高效治疗提供更精确安全的靶向给药模式。
[0179]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。