一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法与流程

1.本发明涉及转化纯化领域，尤其涉及ipcc12q1领域，更具体地，涉及一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法。


背景技术：

2.dna甲基化是修饰最稳定的表观遗传方式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表观。现有技术中，人们通常采用重亚硫酸盐转化方式来研究dna甲基化。dna在重亚硫酸盐处理过程中会将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后用重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性pcr法、限制性酶切分析法等来比较处理和未处理dna的序列，就能确定dna序列中哪些位点发生甲基化。但是传统重亚硫酸盐转化法反应时间长，且dna降解率高，检测出dna的灵敏度和准确度低，且一致性和重复性差，不方便应用。
3.现有技术中，授权公告号为cn 105462960b的专利申请文件，公开了一种dna亚硫酸盐转化及纯化的方法，选用的甲基化转化试剂和磁珠法纯化试剂，能够进行恒温转化，且使用过程中不使用氢氧化钠变性处理，提高了回收效率和dna纯度，但是其灵敏度较低，不适合检测微小残留疾病分子。
4.授权公告为cn103205418b的专利申请文件，公开了一种在dna重亚硫酸盐转化过程中纯化dna的方法，通过加入dna保护剂，放置dna在转化过程中降解，从而提高了核酸对于的回收率和测试灵敏度，但是对于难检测的血浆等样本检测效果较差。
5.因此，需要一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，不仅能够缩短反应时间，且能够降低dna的降解率，提高检测灵敏度和准确度，同时还能够提高dna的纯度和回收率，可以应用于绝大多数包括难检测的血浆等样本的检测。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明第一方面，提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，包括以下步骤：取样本加入重亚硫酸盐溶液、核酸保护液混合后，进行pcr孵育转化。
7.优选的，所述样本为外周血、血浆或血清、新鲜组织、细胞株、石蜡组织中的一种或多种样品中提取的dna。
8.优选的，所述重亚硫酸盐溶液的配置步骤为：向6000mg重亚硫酸盐中加入954ul重亚硫酸盐溶解液，搅拌均匀即得。
9.优选的，所述重亚硫酸盐选自亚硫酸氢铵、重亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氨、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁中的一种或多种。
10.优选的，所述重亚硫酸盐溶解液为ph值大于7的化合物的水溶液；所述ph值大于7的化合物的摩尔浓度为0.1-1m；进一步优选的，为0.5-0.75m。
11.优选的，所述ph值大于7的化合物为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钡、氢氧化镁、碳酸钙中的一种或多种；进一步优选的，为氢氧化钠。
12.优选的，所述重亚硫酸盐溶解液的配制步骤为：称取适量ph值大于7的化合物，加
入水，充分溶解混匀，即得。
13.优选的，所述核酸保护液包括水溶性维生素和醚类杂环化合物。
14.优选的，所述水溶性维生素为水溶性维生素c、水溶性维生素e中的一种或多种；进一步优选的，为水溶性维生素e。
15.优选的，所述水溶性维生素e为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸。
16.优选的，所述醚类杂环化合物为1,4-二氧六环、1,3,6-三氧杂环辛烷、四氢吡喃-4-醇、四氢呋喃中的一种或多种；进一步优选的，为1,4-二氧六环。
17.优选的，所述水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.05-0.15mol/l。
18.优选的，所述核酸保护液的配置步骤为：取水溶性维生素与醚类杂环化合物混合，充分溶解，即得。
19.虽然选用重亚硫酸盐溶液来将核酸碱基中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但是其含碱量较高，反应体系中会生成大量活性氧基团，使得核酸发生片段化并发生降解，从而影响检测的灵敏度和后续纯化提取dna的回收率。申请人意外发现，选用一定量的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸作为水溶性维生素，和1,4-二氧六环作为醚类杂环化合物共同制备的核酸保护液，能够减少ph值大于7的化合物的添加对核酸处理过程中造成的核酸降解和片段化。特别的，当水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.05-0.15mol/l时，能够在少核酸降解的同时，促进未甲基化的胞嘧啶的转化。这可能是由于6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸与1,4-二氧六环协同作用，增强了酚羟基的酸性的同时，避免了过量的有机溶剂的使用可能会对细胞产生毒性，使得其抗氧化活性有所提升，从而能够保护核酸链，减少ph值大于7的化合物造成的核酸降解和片段化。但是对转化时间的促进有限。
20.优选的，所述pcr孵育转化选用pcr仪进行孵育转化。
21.优选的，所述pcr孵育转化的程序为(95-105)℃，(10-20)min；(45-55)℃，(25-35)min；(95-105)℃，(1-10)min；(45-55)℃，(85-95)min；进一步优选的，为99℃，15min；50℃，30min；99℃，5min；50℃，90min。
22.申请人发现，选用pcr仪进行孵育转化，且pcr孵育转化的程序为(95-105)℃，(10-20)min；(45-55)℃，(25-35)min；(95-105)℃，(1-10)min；(45-55)℃，(85-95)min，能够在缩短流程，节约转化时间的同时，还能够促进dna双链处于解链状态，从而促进对多种样本的检测。这可能是由于人为操作误差会影响到核酸的产量和纯度，而选用pcr仪进行孵育转化，不仅精密度高且效率高，还大大降低了人工成本。而孵育转化过程中，转化时间过长会影响核酸结构完整性，转化时间过短会导致转化不完全，二者都会导致检测信号过低或无信号，影响dna甲基化检测灵敏度。申请人通过多次创造性实验，意外发现当pcr孵育转化的程序为(95-105)℃，(10-20)min；(45-55)℃，(25-35)min；(95-105)℃，(1-10)min；(45-55)℃，(85-95)min时，不仅能够使得核酸碱基中未甲基化的胞嘧啶在较短时间内转化，还能减少核酸降解的发生，最大程度的保留核酸结构完整性，从而大大缩短转化时间的同时，还能够对多种样本，即便是难检测的血浆等样本进行检测，提高了其灵敏度。但是由于样本中有残留基因组的干扰，会导致检测准确度较低，影响实验结果。
23.本发明第二方面，提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐提取、纯化方法，包括以下步骤：
24.s1、将孵育转化后的样本、裂解液、磁珠混合后，分离磁珠，弃上清；
25.s2、加入去磺化溶液去磺化后，再次分离磁珠，弃上清；
26.s3、干燥后，加入te缓冲液混合后，分离磁珠，收集混合后的混合液，测试。
27.优选的，步骤s1中所述裂解液包括离液盐、螯合剂、缓冲剂和水。
28.优选的，所述离液盐为胍硫氰酸盐、盐酸胍、碘化钠中的一种或多种；进一步优选的，为胍硫氰酸盐。
29.优选的，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠盐、1,2-环己二胺四乙酸二钠、肌醇六磷酸脂、乙二胺四乙酸四钠、酒石酸钠、乙二胺四乙酸二钠钙、柠檬酸钙中的一种或多种；进一步优选的，为乙二胺四乙酸二钠盐。
30.优选的，所述缓冲剂为醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、三羟甲基氨基甲烷醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、2-亚氨基硫烷盐酸盐中的一种或多种；进一步优选的，为三羟甲基氨基甲烷醋酸盐。
31.优选的，所述离液盐、缓冲剂、螯合剂的摩尔浓度比为(80-180)：(0.5-2)：(0.1-2)；进一步优选的，为(100-150)：(1-1.5)：(0.4-1.5)；更进一步的，为100:1:0.44。
32.优选的，步骤s1中所述裂解液的配置步骤为：称取适量离液盐、缓冲剂、螯合剂，加水充分溶解混匀，即得；进一步优选的，步骤s2中所述裂解液的配置步骤为：称取40-60g 4m硫氰酸胍粉末、1-5ml3m三羟甲基氨基甲烷醋酸盐，2-5ml 0.5m乙二胺四乙酸二钠盐，加入30-50ml水充分溶解混匀，即得。
33.申请人发现，选用胍硫氰酸盐作为离液盐，配合乙二胺四乙酸二钠盐作为螯合剂和三羟甲基氨基甲烷醋酸盐作为缓冲剂，共同制备的裂解液应用于纯化提取过程中，能够提高纯化提取的效率。这可能是由于胍硫氰酸盐是核酸酶的强抑制剂，不仅能够快速的破坏细胞膜，还能够使蛋白质变性沉淀，从而使得核酸能够与蛋白质分离，有利于提高核酸的浓度和质量，排除不同样本中残留基因组的干扰，从而提高后续检测的准确性，但是胍硫氰酸盐反应剧烈且较危险，与酸接触会释放有毒气体，每次使用都要现场配制，流程繁琐。申请人意外发现，当裂解液中加入乙二胺四乙酸二钠盐作为螯合剂和三羟甲基氨基甲烷醋酸盐作为缓冲剂，且所述离液盐、缓冲剂、螯合剂的摩尔浓度比为(80-180)：(0.5-2)：(0.1-2)时，制备出的裂解液不仅可以提高纯化和提取的效率，还能提高检测的准确度和灵敏性。这可能是由于缓冲剂和螯合剂协同作用，不仅能通过螯合二价阳离子来促进胍硫氰酸盐对核酸酶活性的抑制，还能调节体系ph值，使得胍硫氰酸盐能在体系中稳定存在的同时，发挥其高效作用，减少后续洗涤等过程的损失，从而在提高检测准确性的同时，还能提高检测灵敏度，可用于更低含量样品的检测，适用于大通量检测的要求。但是dna的回收率仍没有提高。
34.优选的，步骤s1中所述磁珠为磁性硅颗粒。
35.优选的，所述磁珠的粒径为400-600nm，铁泄漏量小于5ppm；进一步优选的，所述磁珠的粒径为500nm，铁泄漏量小于1ppm。
36.申请人意外发现，选用粒径为400-600nm，铁泄漏量小于5ppm的磁性硅颗粒作为磁珠，不仅可以提高dna的回收率，还能够缩短整个流程的时间，节约成本。这可能是由于粒径为400-600nm，铁泄漏量小于5ppm的磁性硅颗粒不仅对核酸的吸附性能较强，且能够减少对pcr的抑制，从而实现核酸的纯化和富集，提高了dna的回收率。此外，所述磁珠在高温下的重亚硫酸盐溶液中仍然具有较好的稳定性，从而使得核酸甲基化过程能直接在磁珠的表面
进行，而且将分离磁珠回收，不仅节约了成本，而且缩短了整个流程的时间。
37.在一些优选的方案中，所述磁珠可为市售，例如供应商英芮诚生化科技公司生产的enriching
38.优选的，步骤s1中所述分离磁珠，弃上清的具体步骤为：弃上清液，将弃上清液中的磁珠加入洗涤液静置后，弃上清液。
39.优选的，所述洗涤液为水。
40.优选的，步骤s2中所述去磺酸化溶液为ph值大于7的化合物的水溶液，所述ph值大于7的化合物的摩尔浓度为0.9～1.2m。
41.优选的，步骤s3中所述te缓冲液包括螯合剂、缓冲剂和水。
42.优选的，所述螯合剂和缓冲剂的摩尔浓度比为1：(5-15)；进一步优选的，为1:10。
43.有益效果：
44.1、通过选用一定量的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸作为水溶性维生素，和1,4-二氧六环作为醚类杂环化合物共同制备的核酸保护液，能够减少ph值大于7的化合物的添加对核酸处理过程中造成的核酸降解和片段化。
45.2、通过选用pcr仪进行孵育转化，且pcr孵育转化的程序为(95-105)℃，(10-20)min；(45-55)℃，(25-35)min；(95-105)℃，(1-10)min；(45-55)℃，(85-95)min，能够在缩短流程，节约转化时间的同时，还能够促进dna双链处于解链状态，从而促进对多种样本的检测，提高了检测灵敏度。
46.3、通过选用离液盐、缓冲剂、螯合剂的摩尔浓度比为(80-180)：(0.5-2)：(0.1-2)时，制备出的裂解液不仅可以提高纯化和提取的效率，还能提高检测的准确度和灵敏性。
47.4、通过选用粒径为400-600nm，铁泄漏量小于5ppm的磁性硅颗粒作为磁珠，不仅可以提高dna的回收率，还能够缩短整个流程的时间，节约成本。
48.5、本发明提供一种重亚硫酸盐转化，以及转化后纯化提取的方法，通过控制转化条件，可促进dna双链处于解链状态，促进转化的同时，减少dna降解等的发生，从而促进对多种样本，即便是难检测的血浆等样本的检测，其次，通过后续纯化提取，还可缩短纯化流程和时间的同时，提高dna的回收率，用于更少量样本的检测，排除不同样本中残留基因组的干扰，提高检测灵敏性和准确度。
49.6、本技术所述重亚硫酸盐转化，以及转化后纯化提取的方法相较于传统的过夜转化方法，可以大大缩短转化时间。该方法采用磁珠法进行纯化，可以在自动化仪器上实现高通量的操作。该转化方法能够针对微量的dna分子进行转化，灵敏度高，有利于微小残留疾病分子的检出。
附图说明
50.图1为实施例1-3的方法来转化及纯化未甲基化基因组dna的实时荧光pcr检测对比图；其中
①
为实施例1，
②
为实施例2，
③
为实施例3；图中cfdna样本来自上海思泰得医学检验实验室有限公司；
51.图2为实施例1和实施例5-6的方法来转化及纯化未甲基化基因组dna的实时荧光pcr检测对比图；其中
①
为实施例1，
②
为实施例5，
③
为实施例6。
具体实施方式
52.实施例
53.实施例1
54.实施例1第一方面提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，包括以下步骤：取10ul样本(体积不够可用无菌水或te缓冲液补齐)，加入47ul重亚硫酸盐溶液，13ul核酸保护液，总体积70ul，震荡混匀；利用pcr仪进行以下程序的孵育转化：99℃，15min；50℃，30min；99℃，5min；50℃，90min。
55.所述样本为细胞株中提取的dna。
56.所述重亚硫酸盐溶液的配置步骤为：向6000mg重亚硫酸盐中加入954ul重亚硫酸盐溶解液，搅拌均匀即得。
57.所述重亚硫酸盐为亚硫酸氢铵。
58.所述重亚硫酸盐溶解液为ph值大于7的化合物的水溶液。
59.所述ph值大于7的化合物的摩尔浓度为0.5m。
60.所述ph值大于7的化合物为氢氧化钠。
61.所述重亚硫酸盐溶解液的配制步骤为：称取适量ph值大于7的化合物，加入水，充分溶解混匀，即得。
62.所述核酸保护液包括水溶性维生素和醚类杂环化合物。
63.所述水溶性维生素为水溶性维生素e。
64.所述水溶性维生素e为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸。
65.所述醚类杂环化合物为1,4-二氧六环。
66.所述水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.1mol/l。
67.所述核酸保护液的配置步骤为：取水溶性维生素与醚类杂环化合物混合，充分溶解，即得。
68.所述pcr孵育转化选用pcr仪进行孵育转化。
69.所述te缓冲液包括螯合剂、缓冲剂和水。
70.所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠盐。
71.所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷醋酸盐。
72.所述螯合剂和缓冲剂的摩尔浓度比为1:10。
73.所述te缓冲液的制备步骤为：取50ul 1m缓冲剂，10ul 0.5m螯合剂，49.94ml水，混合均匀，即得。
74.实施例1第二方面提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐提取、纯化方法，包括以下步骤：
75.s1、向1.5ml离心管中加入400ul裂解液，5ul磁珠，再将70ul孵育转化后产物转移至1.5ml离心管中，充分震荡混匀，室温静置5分钟；选用技特32位自动化仪器进行纯化，将离心管至于磁力架上50秒，分离磁珠，弃上清；向离心管中加入400ul洗涤液，在磁力架上静置50秒，分离磁珠，弃上清；
76.s2、从磁力架上取下离心管，并向离心管中加入200ul去磺酸化溶液，室温静置20分钟；将离心管至于磁力架上，静置50秒，分离磁珠，弃上清；向离心管中加入400ul洗涤液，静置50秒，弃上清；重复一次，向离心管中加入400ul洗涤液，静置50秒，弃上清；
77.s3、空气干燥7分钟后，从磁力架上取下离心管，向磁珠中加入40ulte缓冲液，充分震荡混匀，静置3分钟；将离心管置于磁力架上，静置50秒，分离磁珠，然后收集洗脱的dna至一个新的离心管中。
78.所述裂解液包括离液盐、螯合剂、缓冲剂和水。
79.所述离液盐为胍硫氰酸盐。
80.所述离液盐、缓冲剂、螯合剂的摩尔浓度比为100:1:0.44。
81.所述裂解液的配置步骤为：称取47.26g 4m硫氰酸胍粉末、4ml 3m三羟甲基氨基甲烷醋酸盐，3.52ml 0.5m乙二胺四乙酸二钠盐，加入40ml水充分溶解混匀，即得。
82.所述磁珠为磁性硅颗粒。
83.所述磁珠的粒径为500nm，铁泄漏量小于1ppm。
84.所述磁珠购买自供应商英芮诚生化科技公司生产的enriching
85.所述分离磁珠，弃上清的具体步骤为：弃上清液，将弃上清液中的磁珠加入洗涤液静置后，弃上清液。
86.所述洗涤液为水。
87.所述去磺酸化溶液为氢氧化钠的水溶液。
88.所述氢氧化钠的摩尔浓度为1m。
89.所述去磺酸化溶液的配制步骤为：取20ml 3m naoh，45ml水，混合均匀，即得。
90.实施例2
91.实施例2提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：利用pcr仪进行以下程序的孵育转化：95℃，30sec；(95℃，30sec；58℃，20min，循环4次)。
92.实施例3
93.实施例3提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：利用pcr仪进行以下程序的孵育转化：98℃，10min；60℃，150min。
94.实施例4
95.实施例4提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：所述磁珠购买自供应商苏州唯善生物生产的vr0000105中的磁珠。
96.实施例5
97.实施例5提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：所述样本为石蜡样本中提取的dna。
98.实施例6
99.实施例6提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：所述样本为外周血游离中提取的dna。
100.实施例7
101.实施例7提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：所述水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.01mol/l。
102.实施例8
103.实施例8提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，具体实施方式同实施例1，不同点在于：所述离液盐、缓冲剂、螯合剂的摩尔浓度比为400:1:0.44。
104.性能测试
105.对于实施例1-8的方法得到的dna采用实时荧光pcr进行甲基化检测，检测结果见表1。
106.表1实时荧光pcr进行甲基化检测ct值
[0107] ct-1ct-2ct-3ct-4ct-5平均值方差实施例123.6323.9623.5723.7623.2023.620.28实施例220.3224.9524.4727.3923.3824.102.57实施例321.1324.1125.6225.5525.1424.311.88实施例433.7127.3126.4327.3226.9428.343.02实施例522.1322.0621.8021.7322.2422.000.41实施例621.3520.1821.1721.1521.4521.060.51实施例719.0619.4420.0422.0426.3721.393.01实施例821.4122.9934.5222.8027.1125.775.34