1.本公开涉及一种生产1,5-戊二胺的微生物，且特别涉及一种经基因重组的微生物及使用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。
背景技术：
：：2.1,5-戊二胺是化工产业中用以合成多聚物的重要原料，其生产及制备方法的改良及效率提升为该领域一直以来的主要课题。3.全细胞催化法(invitrowhole-cellbiotransformation)是现有以微生物生产1,5-戊二胺的其中一种方法，其利用完整的生物有机体作为催化剂而进行化学转化，即，将微生物培养至一定细胞量后，再加入基质进行催化，进而转化为产物。例如，使用基因重组微生物使其表达赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase，cada)，并通过高密度发酵提升菌量，借以增加赖氨酸脱羧酶的表达量，进而提升其催化赖氨酸的转化效率以生产戊二胺。然而，以全细胞催化法生产1,5-戊二胺时，还必须在反应系统中添加昂贵的磷酸吡哆醛(pyridoxal5’‑phosphate，plp)活化赖氨酸脱羧酶(cada)，以进一步提升全细胞催化法的效率。4.磷酸吡哆醛(plp)是维生素b6的活性形式，大肠杆菌细胞中具有两条磷酸吡哆醛的自生成途径，分别是从头合成法，即利用葡萄糖生产磷酸吡哆醛，而另一条则称为超级救援途径，即利用维生素b6的前体，如吡哆醛(pyridoxal，pl)和吡哆醇(pyridoxine，pn)等经催化生成磷酸吡哆醛。5.于先前技术中，已公开于催化过程中添加维生素b6的前体以取代磷酸吡哆醛的方法，如专利公开号cn109536542a，其公开在反应系统中加入浓度为0.05至0.5mm的吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等辅酶；另外，专利公开号cn109097408a则公开在连续酶反应器中加入赖氨酸脱羧酶和维生素b6辅酶；而专利公开号cn108997141a还公开在赖氨酸和赖氨酸脱羧酶混合系统中加入吡哆氨、吡哆醇、吡哆醛、磷酸吡哆醛等维生素b6辅酶。然而，上述直接添加磷酸吡哆醛前体对于生产1,5-戊二胺的效果不佳，仍需开发其他提升1,5-戊二胺产能的全细胞催化法。6.2015年，南京工业大学研究团队(ma,w.,cao,w.,zhang,b.,chen,k.,liu,q.,li,y.,&ouyang,p.(2015).engineeringapyridoxal5’‑phosphatesupplyforcadaverineproductionbyusingescherichiacoliwhole-cellbiocatalysis.scientificreports,5(1),1-10)尝试利用表达从头合成途径中的基因以提升戊二胺的产量，而韩国kim等人的团队(kim,j.h.,kim,j.,kim,h.j.,sathiyanarayanan,g.,bhatia,s.k.,song,h.s.&yang,y.h.(2017).biotransformationofpyridoxal5’‑phosphatefrompyridoxalbypyridoxalkinase(pdxy)tosupportcadaverineproductioninescherichiacoli.enzymeandmicrobialtechnology,104,9-15)则经由表达pdxy并添加pl作为前体的方法，其获得最高33g/l的戊二胺，生产率为5.5g/l/h，但这些方法的产能及生产效率并不符合需求，故仍需能进一步提高1,5-戊二胺产量的方法。7.有鉴于此，本公开所属
技术领域：
：对可有效提升生产1,5-戊二胺产能的方法仍有需求，以解决已知技术所存在的问题。技术实现要素：8.为解决上述的问题，本公开提供一种生产1,5-戊二胺的重组微生物，其包括至少两个基因，且该至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其中，该至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因。于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物所包括的赖氨酸脱羧酶以及生成磷酸吡哆醛的酶的基因表达被增强。9.于本公开的至少一个具体实施例中，生产1,5-戊二胺的重组微生物包括至少两个外源基因，其中，该外源基因为编码赖氨酸脱羧酶(cada)的基因和编码生成磷酸吡哆醛(plp)的酶的基因。10.于本公开的至少一个具体实施例中，该编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因为pdxh、pdxy、pdk或其任意组合。11.于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物包含表达载体，其中，该表达载体包括至少一个编码赖氨酸脱羧酶(cada)、编码生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动子序列。12.于本公开的至少一个具体实施例中，在该重组微生物所包含的表达载体中，该编码赖氨酸脱羧酶(cada)的核苷酸序列为具有与seqidno：11至少有80％序列一致性且与seqidno：11具有相同活性的序列，该编码pdxh的核苷酸序列为具有与seqidno：1至少有80％序列一致性且与seqidno：1具有相同活性的序列，该编码pdxy的核苷酸序列为具有与seqidno：3至少有80％序列一致性且与seqidno：3具有相同活性的序列，该编码pdxk的核苷酸序列为具有与seqidno：5至少有80％相似度且与seqidno：5具有相同活性的序列。13.于本公开的至少一个具体实施例中，该持续型启动子为j系列持续型启动子的其中一者。于本公开的一些具体实施例中，该j系列持续型启动子包括j23100、j23101、j23102、j23103、j23104、j23105、j23106、j23107、j23108、j23109、j23110、j23111、j23112、j23113、j23114、j23115、j23116、j23117、j23118及j23119。于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为j23100、j23109或j23114。14.于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为placi持续型启动子。15.于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物属于大肠杆菌属(escherichia)、克雷伯菌属(klebsiella)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗威登斯菌属(providencia)、棒状杆菌属(corynebacterium)或短杆菌属(brevibacterium)。于本公开的一些具体实施例中，该微生物为大肠杆菌k-12w3110菌株或bl21菌株。16.于本公开的至少一个具体实施例中，本公开所提供的重组微生物为大肠杆菌(escherichiacoli)jcada-wmut，于2021年1月11日以寄存编号dsm33754寄存于德国微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，dsmz，德国，不伦瑞克市，d-38124，因霍芬大街7b)。17.本公开还提供一种生产1,5-戊二胺的方法，其包括：将上述微生物与赖氨酸在第一溶液中混合，以将该赖氨酸转化为1,5-戊二胺；以及自该第一溶液中分离得到1,5-戊二胺。18.于本公开的一些具体实施例中，该方法进一步包括添加辅助因子至该第一溶液中。于本公开的一些具体实施例中，该辅助因子为磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’‑phosphate，plp)或其前体，如吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)。于本公开的至少一个具体实施例中，该第一溶液中赖氨酸的浓度为0.1m至2m，例如0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。19.于本公开的至少一个具体实施例中，该方法进一步包括：在分离得到1,5-戊二胺后，回收溶液中的微生物；将回收的微生物加入包含赖氨酸的第二溶液中；于第二溶液中加入前述微生物；以及自该第二溶液中分离得到1,5-戊二胺。20.于本公开的至少一个具体实施例中，该第二溶液中赖氨酸的浓度为0.1m至2m，例如0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。21.于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物加入至第二溶液中的量以od600值计为1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，且不以此为限。22.本公开透过使用非诱导型表达系统，于微生物宿主中同时表达赖氨酸脱羧酶(cada)及生成磷酸吡哆醛(plp)而作为全细胞催化剂，免除额外添加plp作为辅酶的步骤及成本，并进一步提高微生物的戊二胺催化效能及产量。该全细胞催化剂还可回收并循环利用，更进一步降低1,5-戊二胺的生产成本。以该全细胞催化剂生产1,5-戊二胺时，无须添加额外的磷酸吡哆醛(plp)辅酶，可因而降低1,5-戊二胺的生产成本，并简化生产程序，进而提升戊二胺的产量和生产速率，使1,5-戊二胺的大规模生产得以实现。附图说明23.图1显示在w3110及bl21菌株中添加吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)等不同的前体，以包含自发型启动子psu-j23100或psu-placi的持续型质粒驱动pdxh、pdxy或pdxk基因的蛋白质表达。图中分别以箭头指出pdxh(25.5kda)、pdxy(31.7kda)及pdxk(31.2kda)于蛋白质电泳中的位置。jh：以psu-j23100启动子驱动pdxh基因的表达；ph：以psu-placi启动子驱动pdxh基因的表达；jy：以psu-j23100启动子驱动pdxy基因的表达；py：以psu-placi启动子驱动pdxy基因的表达；jk：以psu-j23100启动子驱动pdxk基因的表达；pk：以psu-placi启动子驱动pdxk基因的表达。24.图2显示在w3110及bl21菌株中，在添加吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)下，以包含自发型启动子psu-j23100或psu-placi的持续型质粒驱动pdxh、pdxy或pdxk基因的plp生成量。wt：未经任何质粒转形的原始菌株；jh：以psu-j23100启动子驱动pdxh基因的表达；ph：以psu-placi启动子驱动pdxh基因的表达；jy：以psu-j23100启动子驱动pdxy基因的表达；py：以psu-placi启动子驱动pdxy基因的表达；jk：以psu-j23100启动子驱动pdxk基因的表达；pk：以psu-placi启动子驱动pdxk基因的表达。dcw：细胞干重(drycellweight)。*p《0.05。25.图3a至图3c显示包含cada质粒及pdxy或pdxk质粒的双质粒bl21菌株的戊二胺生产情形。图3a显示细胞的生长情形；图3b显示戊二胺的产量；图3c显示胞内plp的自生成量。dcw：细胞干重(drycellweight)。*p《0.05。26.图4显示共表达cada及pdxy或pdxk的双质粒bl21菌株在不同浓度赖氨酸中的戊二胺生产量及赖氨酸消耗率。27.图5显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)的赖氨酸脱羧酶(cada)的活性分析。柱状图中的白色柱代表添加磷酸吡哆醛(plp)作为辅助因子，浅灰色柱代表添加吡哆醇(pn)作为辅助因子，深灰色柱代表添加吡哆醛(pl)作为辅助因子。dap：戊二胺(1,5-diaminopentane)28.图6显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)，利用pn或pl作为前体时催化赖氨酸(1.2m)生产戊二胺(1,5-diaminopentane，dap)的产量与转化率。29.图7显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)循环利用的赖氨酸转化率。具体实施方式30.以下通过特定的具体实施例说明本公开的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所描述的内容轻易地了解本公开的优点及功效。本公开也可通过其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同的观点与应用，在不悖离本公开所描述的范围下赋予不同的修饰与变更。此外，本文所有范围和数值皆为包含及可合并的。落在本文中所述范围内的任何数值或点，例如任何整数，都可以作为最小值或最大值以导出下位的范围。31.除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一”和“该”包括多个个体。32.除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的术语“或”包括“和/或”的含义。33.本公开提供一种表达载体，其包括编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因，其包括pdxh、pdxy及pdxk的核苷酸序列，以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的持续型启动子序列。本公开还提供一种包含该表达载体的重组微生物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。34.如本文中所使用，术语“磷酸吡哆醛”(plp)是指催化生物体反应生成1,5-戊二胺的赖氨酸脱羧酶的辅酶(或称为辅助因子)，磷酸吡哆醛为维生素b6的活性形式。如前所述，在大肠杆菌细胞内存在2条plp的自生成途径，分别为从头合成法，即利用葡萄糖生产plp，而另一条为超级救援途径，即利用维生素b6的前体，包括吡哆醛(pl)和吡哆醇(pn)等经催化生成plp。35.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxh基因的核苷酸序列为具有与seqidno：1至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：1具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxh活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxh具有seqidno：2的氨基酸序列或与seqidno：2具有保守变异的氨基酸序列。36.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxy基因的核苷酸序列为具有与seqidno：3至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：3具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxy活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxy具有seqidno：4的氨基酸序列或与seqidno：4具有保守变异的氨基酸序列。37.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxk基因的核苷酸序列为具有与seqidno：5至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：5具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxk活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxk具有seqidno：6的氨基酸序列或与seqidno：6具有保守变异的氨基酸序列。38.如本文中所使用，术语“序列一致性百分比”是指一候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基与一参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可先将候选蛋白质或核酸片段与所述的蛋白质或核酸片段并排(align)，并于必要时引入空位(gap)，以使二序列形成最高的序列一致性。在计算序列一致性时，保守变异的氨基酸残基将视为不同的残基；简并密码子的核苷酸残基也将视为不同的残基，例如同样编码天门冬酰氨酸的密码子aau和aac之间，将视为有一个不同的残基u或c。39.应当理解，相较于本公开中作为参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列，序列中的至少一部分经修饰(如缺失、取代或添加)的候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列也在本公开的范围内，只要所得的候选蛋白质或核酸片段实质上具有与参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸相同的生物活性，这是由于密码子的简并性(codondegeneracy)。举例而言，在本公开所编码生成磷酸吡哆醛的酶的核苷酸序列中，可在编码区中产生各种修饰，前提是其不改变自该编码区表达的多肽的活性。因此，本公开所编码生成磷酸吡哆醛的pdxh基因的核苷酸序列可为具有seqidno：1的核苷酸序列或与seqidno：1至少有80％序列一致性的任何核苷酸序列，只要该核苷酸序列所编码的蛋白质能够呈现生成磷酸吡哆醛的pdxh的活性。同理，本公开中生成磷酸吡哆醛的pdxh可为具有seqidno：2的氨基酸序列或与seqidno：2同源的任何蛋白质，只要该蛋白质实质上能够呈现生成磷酸吡哆醛的pdxh的活性。40.如本文中所使用，术语“持续型启动子”是指在多数或全部组织中保持持续活性的启动子，相对于诱导型启动子必须受到外界信号或诱导物而调控，持续型启动子可持续表达特定基因。41.适用于本公开的持续型启动子包括属于j系列持续型启动子中的成员，例如：j23100、j23101、j23102、j23103、j23104、j23105、j23106、j23107、j23108、j23109、j23110、j23111、j23112、j23113、j23114、j23115、j23116、j23117、j23118及j23119。于至少一个具体实施例中，本公开所使用的持续型启动子可为j23100、j23109或j23114。于一些具体实施例中，本公开所使用的持续型启动子具有seqidno：7的序列或与seqidno：7至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：7具有相同活性的序列，例如同样可作为持续型启动子的序列。42.适用于本公开的持续型启动子进一步包括placi持续型启动子。于一些具体实施例中，该持续型启动子具有seqidno：8的序列或与seqidno：8至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：8具有相同活性的序列，例如同样可作为持续型启动子的序列。43.根据本公开的至少一个具体实施例，本公开的表达载体进一步包括选自由下列所组成组的至少一者：标记基因序列、报告基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加强子序列、终止子序列以及调节子序列。44.于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有seqidno：9的序列或与seqidno：9至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：9具有相同活性的序列。于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有seqidno：10的序列或与seqidno：10至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：10具有相同活性的序列。45.如本文中所使用，术语“赖氨酸脱羧酶”是指参与生物体生成1,5-戊二胺反应的酶，包括两种赖氨酸脱羧酶，即赖氨酸脱羧酶1(lysinedecarboxylase1，cada)及赖氨酸脱羧酶2(lysinedecarboxylase2，ldcc)，其中cada为诱导型酶，由缺氧、过多赖氨酸供给及ph改变所诱导，而ldcc则为持续型酶，不受外在ph改变所影响。46.根据本公开的至少一个具体实施例，该编码赖氨酸脱羧酶cada的核苷酸序列为具有与seqidno：11至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：11具有相同活性的序列，例如可表现出具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质。于一些具体实施例中，该赖氨酸脱羧酶cada具有seqidno：12的氨基酸序列或与seqidno：12具有保守变异的氨基酸序列。于本公开至少一个具体实施例所提供的表达载体，其包括编码赖氨酸脱羧酶cada的核苷酸序列，以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的持续型启动子序列。于本公开的一些具体实施例中，提供有一种包含该赖氨酸脱羧酶cada表达载体的重组微生物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。于本公开的一些具体实施例中，该表达载体具有seqidno：13的序列或与seqidno：13至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：13具有相同活性的序列。47.根据本公开的至少一个具体实施例，本公开提供一种包含两种或两种以上不同表达载体的微生物，其包括表达赖氨酸脱羧酶cada的表达载体以及表达生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk的重组微生物。于一些具体实施例中，本公开所提供的重组微生物可同时表达赖氨酸脱羧酶cada及生成磷酸吡哆醛，生成该磷酸吡哆醛的酶为pdxh、pdxy或pdxk基因所编码的生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk。于一些具体实施例中，本公开提供一种可自行生成磷酸吡哆醛的重组微生物。48.如本文中所使用，术语“重组”是指以人工方式组合两个彼此分离的序列片段。一般而言，术语“重组”是指核酸、蛋白质或微生物含有源自于多个不同来源的遗传物质，或由源自于多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物。49.如本文中所使用，术语“外源基因”是指源自于一个或多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物，可以利用已知的基因重组技术将外源基因于选定的宿主中表达，例如，使用表达载体在宿主中表达外源基因。50.如本文中所使用，术语“微生物”属于微观生物体，包括细菌、古细菌、病毒或真菌等。如于本文中所使用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。51.适用于作为本公开的表达载体的微生物宿主包括，但不限于，属于大肠杆菌属(escherichia)、克雷伯菌属(klebsiella)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗威登斯菌属(providencia)、棒状杆菌属(corynebacterium)或短杆菌属(brevibacterium)的微生物。于一些具体实施例中，本公开所使用的微生物宿主能够于体内表达赖氨酸脱羧酶cada及pdxk、pdxh或pdxy所编码的磷酸吡哆醛生成酶。于一些具体实施例中，本公开所使用的微生物宿主除了能够于体内表达赖氨酸脱羧酶cada及pdxk、pdxh或pdxy所编码的磷酸吡哆醛生成酶外，对于戊二胺也具有耐受性。52.如本文中所使用，术语“辅酶”或“辅助因子”包含正常酶活性所需的非蛋白质化合物。该等化合物可为有机物或无机物，例如，适用于本公开的辅酶或辅助因子包括，但不限于，磷酸吡哆醛(plp)、吡哆醛(pl)和吡哆醇(pn)等维生素b6的前体。53.以下通过特定的具体实施例进一步说明本公开的特点及功效，但非用于限制本公开的范围。54.实施例55.实施例1：构建表达载体56.以大肠杆菌k-12mg1655的基因组作为模板，设计带有hindiii及spei切位的引物以构建持续型启动子表达plp的超级救援基因pdxh、pdxy及pdxk，所使用的引物如下表一所示。57.表一、用于构建表达载体的引物[0058][0059][0060]以mg1655基因组作为模板并使用上述引物进行聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)，得到相关基因的特定dna序列扩增片段。用于扩增特定dna序列片段的pcr反应所需要的材料包含dna模板、5’ꢀ端引物、3’端引物、三磷酸脱氧核苷酸(dntp)、10x聚合酶缓冲液以及聚合酶，其中在本实施例中所使用的聚合酶包括ex-taq。pcr产物以dna电泳分析并经割胶回收，得到扩增的plp超级救援基因pdxh、pdxy及pdxk片段。[0061]将扩增的基因片段以hindiii及spei进行酶切反应，接着将扩增的plp超级救援基因片段插入psu-j23100或psu-placi载体内，构建成psu-j23100-pdxh(以jh表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxh基因表达)、psu-placi-pdxh(以ph表示，即以psu-placi启动子驱动pdxh基因表达)、psu-j23100-pdxy(以jy表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxy基因表达)、psu-placi-pdxy(以py表示，即以psu-placi启动子驱动pdxy基因表达)、psu-j23100-pdxk(以jk表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxk基因表达)、以及psu-placi-pdxk(以pk表示，即以psu-placi启动子驱动pdxk基因表达)等质粒，再将质粒转化送入dh5α菌株。[0062]进行热转化时，取一管市售的dh5α胜任细胞，加入上述所得的质粒约10μl，先于冰上放置30分钟，再置于42℃水浴加热1.5分钟，之后置于冰上5至10分钟，接着加入400μl的lb(luriabertani)液态培养基或soc(superoptimalbrothwithcatabolitesrepression)培养基，置于37℃培养箱震荡培养约60至90分钟，再以4,000rpm离心3分钟，去除300μl的上清液，将含有重组dna的胜任细胞全数涂布于含抗生素的固态培养基上，并置于37℃环境下过夜培养。由此固态培养基上所生成的菌落，选取数颗接种于含抗生素的液态培养基中，于37℃培养箱过夜培养，获得含有各种质粒的dh5α菌液。[0063]实施例2：持续型自生成plp菌株的制备及其plp表达量[0064]抽取实施例1所制得并保存于dh5α细胞中的各质粒psu-j23100-pdxh、psu-placi-pdxh、psu-j23100-pdxy、psu-placi-pdxy、psu-j23100-pdxk及psu-placi-pdxk，经热转化送入大肠杆菌bl21或w3110菌株，将含有上述质粒的bl21或w3110菌株的胜任细胞涂布于含抗生素的固态培养基上，并置于37℃环境下过夜培养，再取数颗接种于含抗生素的液态培养基中，于37℃培养箱过夜培养，获得含有各质粒的bl21或w3110菌株，即为持续型自生成plp的菌株。[0065]将前述制得的持续型自生成plp的菌株培养于液态培养基中，在其中添加0.2mm的吡哆醇(pn)或吡哆醛(pl)进行培养，之后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)分析各菌株的蛋白质表达量，并以野生型的bl21或w3110作为对照。[0066]在此进一步说明sds-page蛋白质分析法的步骤。首先，收集细胞并调整至od600为4，以去离子水洗涤2次后，提取细胞蛋白质。取30μl蛋白质样品后混合10μl的蛋白质染剂，以100℃加热10分钟，于sds胶片样品槽中加入15μl的样品溶液，即可进行sds-page电泳分析。sds-page的设定程序为先以80v进行30分钟，再以120v进行60分钟，待蓝色指示线跑出胶片的底端时停止，再以考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)染色40分钟至60分钟，并脱色约40分钟，视实际染色情况更换脱色液。待背景蓝色完全脱去后，换上去离子水，待背景颜色清楚后进行扫描。结果如图1所示，各种质粒在不同宿主菌株及添加pn或pl等不同前体所获得的蛋白质表达量不同，例如，添加pl前体时，含有jy、py及pk质粒的bl21菌株具有较高的plp蛋白质表达。[0067]进一步针对菌株的胞内plp进行定量。将过夜培养细胞定量至od600为20，以无菌水洗涤3次，再以12,000rpm离心3分钟，再将细胞回溶于1ml无菌水中。利用高压破碎仪以30kpsi破碎细胞，得到胞内代谢物，加入10％三氯醋酸，剧烈震荡后在冰上静置10分钟，以14,000g离心10分钟后去除蛋白质，取上清液以高效液相层析(highperformanceliquidchromatography，hplc)定量持续型自生成plp菌株中的plp产量。[0068]hplc定量plp的方式和分析条件包括将待分析样品通过0.2μm滤膜以进行过滤，使用的柱为反相色谱c18(ymc-c18色谱柱，4.6×250mm，粒径为5μm)，洗提缓冲液为0.1m的磷酸二氢钾(ph6.6)，洗提时间为0至20分钟，流速设为0.8ml/min，进样量为50μl。柱温维持在35℃，并且在340nm的波长处测量plp。以不同浓度标准品plp作为对照，即可测得样品中的plp浓度。[0069]图2显示bl21或w3110菌株中以不同质粒驱动plp表达的plp定量结果，其显示psu-j23100-pdxh(jh)质粒于w3110菌株宿主中的表达量相较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显著差异，而psu-j23100-pdxh(jh)、psu-placi-pdxh(ph)、psu-j23100-pdxy(jy)与psu-placi-pdxk(pk)质粒于bl21菌株宿主中的表达量相较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显著差异。[0070]实施例3：双质粒菌株的制备及活性和产量的测试[0071]构建psit-cada表达载体，从大肠杆菌mg1655(genbank：nc_000913)的基因组dna中扩增赖氨酸脱羧酶基因，使用限制性内切酶bamhi和noti切出粘性末端，再以连接酶接进psit载体(psit载体购自addgene，载体商品名称：pskduet16，编号：#41684)以生成psit-cada(seqidno.20)。将psit-cada与psu-j23100-pdxy或psu-placi-pdxk同时送入bl21细胞，并于含有卡那霉素(kanamycin)与氯霉素(chloramphenicol)的双抗性培养基进行筛选，以构建双质粒菌株。[0072]接着，进行生物发酵法，即，将上述双质粒系统在液态培养基中于37℃培养，并以200rpm震荡，当细胞培养至od600到达0.6时，添加0.01mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside，iptg)、0.2mm的pn与50g/l的赖氨酸，并将细胞改至30℃，并以200rpm震荡培养。定时取样，以测量细胞生长情形、赖氨酸的消耗量与戊二胺的生成量。[0073]如图3a的结果所示，含有psit-cada与psu-j23100-pdxy(ajy)和含有psit-cada与psu-placi-pdxk(apk)的双质粒系统在10小时后，其生物质(biomass)均较仅含有psit-cada(a)的菌株多，代表其生长情形较佳。图3b显示ajy可在短时间内促进戊二胺的生产，而apk则可以达到最大的转化。图3c另显示双质粒系统具有较高的自生成plp能力。[0074]以双质粒系统进行全细胞转化，其步骤包括将过夜培养的细胞以8,000g离心5分钟后收集，使用纯水清洗2次后投入不同浓度的赖氨酸溶液中，在37℃下，以200rpm的震荡条件进行全细胞催化反应。于一定时间后将反应液置于100℃下水煮10分钟，再以高速离心取上清液，并以hplc定量分析赖氨酸消耗率与戊二胺生成率。[0075]以hplc定量分析赖氨酸与戊二胺衍生化体系由340μl的0.05m硼酸缓冲液(ph9)、240μl的100％甲醇、6μl的样品和12μl的200mm的乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(diethylethoxymethylenemalonate，deemm)组成。将上述样品在70℃下加热2小时，以完全降解过量的deemm和衍生化副产物。使用deemm进行衍生化后，再利用hplc进行分析。c18柱(ymc-c18柱，4.6×250mm，粒径5μm)维持在35℃。流动相a由100％乙腈组成，流动相b由25mm乙酸钠水溶液(ph4.8)组成。使用0.8ml/min的流速，并采用以下梯度程序：0–2分钟，20–25％a；2–32分钟，25–60％a；32–40分钟，60–20％a。检测在284nm进行。[0076]图4显示双质粒系统于不同浓度赖氨酸的催化效果，结果显示，apk系统催化能力最佳，且具有最高的戊二胺产率及赖氨酸消耗率。[0077]实施例4：自生成plp驯化菌株活性比较[0078]以驯化方式获得一持续型自生成plp菌株，包括将含有psu-j23100-cada的w3110菌株培养于含有高浓度吡哆醛(pl)的lb液态培养基中，此处吡哆醛(pl)的浓度为10至150μm，过夜培养后将该菌株接种于新鲜的含有高浓度的吡哆醛(pl)的培养基中，如此反复继代10次。将上述菌株均匀涂布在含有20g/l赖氨酸和100μm吡哆醛(pl)的lb琼脂培养基上(ph5.0)，挑选所得到的单菌落，进行cada酶活性测试，从中筛选出酶活性最高的菌株，而获得同时表达cada及plp相关基因的自生成plp菌株(本文后以jcada-wmut代表此经驯化的菌株)。[0079]将过夜培养的细胞以8000xg离心共5分钟后进行收集，使用纯水清洗2次后投入1.2m的赖氨酸溶液中，并添加plp、pn或pl等不同的前体，在37℃、200rpm震荡的条件下进行全细胞催化反应，并参考文献以溴甲酚紫分析法(bromophenolpurpletest，bptest)测定cada活性(ting,w.w.,huang,c.y.,wu,p.y.,huang,s.f.,lin,h.y.,li,s.f.,chang,j.s.&ng,i.s.(2021).whole-cellbiocatalystforcadaverineproductionusingstable,constitutiveandhighexpressionofl-lysinedecarboxylaseinrecombinantescherichiacoliw3110.enzymeandmicrobialtechnology,109811)。[0080]测定赖氨酸脱羧酶(cada)活性的bp分析步骤如下，首先取得od600定量为5的液体培养后所得的细菌细胞，进行高压破菌(30kpsi)后，以12,000rpm离心5分钟，可得到含有赖氨酸脱羧酶的可溶性蛋白样品。初步测试不同浓度赖氨酸对最大反应速率的关系，发现初始赖氨酸浓度为40mm时可得到戊二胺与hplc结果最佳的关联性。bp分析法在碱性会呈现紫色，在酸性则会呈现黄色。经过赖氨酸脱羧酶的反应，可增加戊二胺，并使ph上升，故bp分析法可侦测在波长595nm下的呈色，以测定赖氨酸脱羧酶(cada)的活性。[0081]使用下表二中的反应条件测量赖氨酸脱羧酶的活性，最后加入3％的三氯乙酸(trichloroaceticacid，tca)使赖氨酸脱羧酶所进行的反应终止，并借由波长595nm的变化(△od595)经由hplc戊二胺的定量得到校准曲线。[0082]表二、赖氨酸脱羧酶活性测量方法的反应条件[0083]项目浓度体积(μl)赖氨酸40mm40plp0.01mm10*bp分析0.2g/l25试样(od600)525醋酸钠缓冲液，ph＝60.5m400总体积500μl[0084]*测试突变株cada酶活性时可不加plp[0085]如图5所示，jcada-wmut的cada活性以添加pl作为辅助因子时为最高，甚至高于添加plp作为辅助因子时。[0086]另外，如图6所示，使用pl作为前体，并使用jcada-wmut作为生物催化剂时，可催化1.2m赖氨酸完全转化为戊二胺，而不需添加辅助因子plp，最终可达95％以上的戊二胺转化率及124g/l的戊二胺产量。[0087]实施例5：使用jcada-wmut作为循环利用催化剂[0088]将上述于2m赖氨酸的全细胞催化液中的细胞以12,000rpm离心1分钟后回收，再投入至2m的赖氨酸溶液中，并添加新的jcada-wmut菌株细胞，添加量以od600值计分别为1、2、3及5，如此循环利用2次。每次催化时间为4小时。催化后的溶液使用hplc定量赖氨酸与戊二胺浓度。[0089]结果如图7所示，jcada-wmut在每次补料od600值为5的条件下，可以循环利用至少2次，且仍维持95％以上的赖氨酸转化率。[0090]上述实施例仅为例示性说明，而非用于限制本公开。任何本领域技术人员均可在不违背本公开的范围下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本公开的权利保护范围将由所附权利要求所定义，只要不影响本公开的效果及实施目的，皆应涵盖于本公开的内容中。[0091]生物材料寄存[0092]本公开所提供的重组微生物为大肠杆菌(escherichiacoli)jcada-wmut，于2021年1月11日以寄存编号dsm33754寄存于德国微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，dsmz，德国，不伦瑞克市，d-38124，因霍芬大街7b)。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.1,5-戊二胺是化工产业中用以合成多聚物的重要原料，其生产及制备方法的改良及效率提升为该领域一直以来的主要课题。3.全细胞催化法(invitrowhole-cellbiotransformation)是现有以微生物生产1,5-戊二胺的其中一种方法，其利用完整的生物有机体作为催化剂而进行化学转化，即，将微生物培养至一定细胞量后，再加入基质进行催化，进而转化为产物。例如，使用基因重组微生物使其表达赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase，cada)，并通过高密度发酵提升菌量，借以增加赖氨酸脱羧酶的表达量，进而提升其催化赖氨酸的转化效率以生产戊二胺。然而，以全细胞催化法生产1,5-戊二胺时，还必须在反应系统中添加昂贵的磷酸吡哆醛(pyridoxal5’‑phosphate，plp)活化赖氨酸脱羧酶(cada)，以进一步提升全细胞催化法的效率。4.磷酸吡哆醛(plp)是维生素b6的活性形式，大肠杆菌细胞中具有两条磷酸吡哆醛的自生成途径，分别是从头合成法，即利用葡萄糖生产磷酸吡哆醛，而另一条则称为超级救援途径，即利用维生素b6的前体，如吡哆醛(pyridoxal，pl)和吡哆醇(pyridoxine，pn)等经催化生成磷酸吡哆醛。5.于先前技术中，已公开于催化过程中添加维生素b6的前体以取代磷酸吡哆醛的方法，如专利公开号cn109536542a，其公开在反应系统中加入浓度为0.05至0.5mm的吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等辅酶；另外，专利公开号cn109097408a则公开在连续酶反应器中加入赖氨酸脱羧酶和维生素b6辅酶；而专利公开号cn108997141a还公开在赖氨酸和赖氨酸脱羧酶混合系统中加入吡哆氨、吡哆醇、吡哆醛、磷酸吡哆醛等维生素b6辅酶。然而，上述直接添加磷酸吡哆醛前体对于生产1,5-戊二胺的效果不佳，仍需开发其他提升1,5-戊二胺产能的全细胞催化法。6.2015年，南京工业大学研究团队(ma,w.,cao,w.,zhang,b.,chen,k.,liu,q.,li,y.,&ouyang,p.(2015).engineeringapyridoxal5’‑phosphatesupplyforcadaverineproductionbyusingescherichiacoliwhole-cellbiocatalysis.scientificreports,5(1),1-10)尝试利用表达从头合成途径中的基因以提升戊二胺的产量，而韩国kim等人的团队(kim,j.h.,kim,j.,kim,h.j.,sathiyanarayanan,g.,bhatia,s.k.,song,h.s.&yang,y.h.(2017).biotransformationofpyridoxal5’‑phosphatefrompyridoxalbypyridoxalkinase(pdxy)tosupportcadaverineproductioninescherichiacoli.enzymeandmicrobialtechnology,104,9-15)则经由表达pdxy并添加pl作为前体的方法，其获得最高33g/l的戊二胺，生产率为5.5g/l/h，但这些方法的产能及生产效率并不符合需求，故仍需能进一步提高1,5-戊二胺产量的方法。7.有鉴于此，本公开所属
技术领域：
：对可有效提升生产1,5-戊二胺产能的方法仍有需求，以解决已知技术所存在的问题。技术实现要素：8.为解决上述的问题，本公开提供一种生产1,5-戊二胺的重组微生物，其包括至少两个基因，且该至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其中，该至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因。于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物所包括的赖氨酸脱羧酶以及生成磷酸吡哆醛的酶的基因表达被增强。9.于本公开的至少一个具体实施例中，生产1,5-戊二胺的重组微生物包括至少两个外源基因，其中，该外源基因为编码赖氨酸脱羧酶(cada)的基因和编码生成磷酸吡哆醛(plp)的酶的基因。10.于本公开的至少一个具体实施例中，该编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因为pdxh、pdxy、pdk或其任意组合。11.于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物包含表达载体，其中，该表达载体包括至少一个编码赖氨酸脱羧酶(cada)、编码生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动子序列。12.于本公开的至少一个具体实施例中，在该重组微生物所包含的表达载体中，该编码赖氨酸脱羧酶(cada)的核苷酸序列为具有与seqidno：11至少有80％序列一致性且与seqidno：11具有相同活性的序列，该编码pdxh的核苷酸序列为具有与seqidno：1至少有80％序列一致性且与seqidno：1具有相同活性的序列，该编码pdxy的核苷酸序列为具有与seqidno：3至少有80％序列一致性且与seqidno：3具有相同活性的序列，该编码pdxk的核苷酸序列为具有与seqidno：5至少有80％相似度且与seqidno：5具有相同活性的序列。13.于本公开的至少一个具体实施例中，该持续型启动子为j系列持续型启动子的其中一者。于本公开的一些具体实施例中，该j系列持续型启动子包括j23100、j23101、j23102、j23103、j23104、j23105、j23106、j23107、j23108、j23109、j23110、j23111、j23112、j23113、j23114、j23115、j23116、j23117、j23118及j23119。于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为j23100、j23109或j23114。14.于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为placi持续型启动子。15.于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物属于大肠杆菌属(escherichia)、克雷伯菌属(klebsiella)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗威登斯菌属(providencia)、棒状杆菌属(corynebacterium)或短杆菌属(brevibacterium)。于本公开的一些具体实施例中，该微生物为大肠杆菌k-12w3110菌株或bl21菌株。16.于本公开的至少一个具体实施例中，本公开所提供的重组微生物为大肠杆菌(escherichiacoli)jcada-wmut，于2021年1月11日以寄存编号dsm33754寄存于德国微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，dsmz，德国，不伦瑞克市，d-38124，因霍芬大街7b)。17.本公开还提供一种生产1,5-戊二胺的方法，其包括：将上述微生物与赖氨酸在第一溶液中混合，以将该赖氨酸转化为1,5-戊二胺；以及自该第一溶液中分离得到1,5-戊二胺。18.于本公开的一些具体实施例中，该方法进一步包括添加辅助因子至该第一溶液中。于本公开的一些具体实施例中，该辅助因子为磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’‑phosphate，plp)或其前体，如吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)。于本公开的至少一个具体实施例中，该第一溶液中赖氨酸的浓度为0.1m至2m，例如0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。19.于本公开的至少一个具体实施例中，该方法进一步包括：在分离得到1,5-戊二胺后，回收溶液中的微生物；将回收的微生物加入包含赖氨酸的第二溶液中；于第二溶液中加入前述微生物；以及自该第二溶液中分离得到1,5-戊二胺。20.于本公开的至少一个具体实施例中，该第二溶液中赖氨酸的浓度为0.1m至2m，例如0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。21.于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物加入至第二溶液中的量以od600值计为1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，且不以此为限。22.本公开透过使用非诱导型表达系统，于微生物宿主中同时表达赖氨酸脱羧酶(cada)及生成磷酸吡哆醛(plp)而作为全细胞催化剂，免除额外添加plp作为辅酶的步骤及成本，并进一步提高微生物的戊二胺催化效能及产量。该全细胞催化剂还可回收并循环利用，更进一步降低1,5-戊二胺的生产成本。以该全细胞催化剂生产1,5-戊二胺时，无须添加额外的磷酸吡哆醛(plp)辅酶，可因而降低1,5-戊二胺的生产成本，并简化生产程序，进而提升戊二胺的产量和生产速率，使1,5-戊二胺的大规模生产得以实现。附图说明23.图1显示在w3110及bl21菌株中添加吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)等不同的前体，以包含自发型启动子psu-j23100或psu-placi的持续型质粒驱动pdxh、pdxy或pdxk基因的蛋白质表达。图中分别以箭头指出pdxh(25.5kda)、pdxy(31.7kda)及pdxk(31.2kda)于蛋白质电泳中的位置。jh：以psu-j23100启动子驱动pdxh基因的表达；ph：以psu-placi启动子驱动pdxh基因的表达；jy：以psu-j23100启动子驱动pdxy基因的表达；py：以psu-placi启动子驱动pdxy基因的表达；jk：以psu-j23100启动子驱动pdxk基因的表达；pk：以psu-placi启动子驱动pdxk基因的表达。24.图2显示在w3110及bl21菌株中，在添加吡哆醛(pl)或吡哆醇(pn)下，以包含自发型启动子psu-j23100或psu-placi的持续型质粒驱动pdxh、pdxy或pdxk基因的plp生成量。wt：未经任何质粒转形的原始菌株；jh：以psu-j23100启动子驱动pdxh基因的表达；ph：以psu-placi启动子驱动pdxh基因的表达；jy：以psu-j23100启动子驱动pdxy基因的表达；py：以psu-placi启动子驱动pdxy基因的表达；jk：以psu-j23100启动子驱动pdxk基因的表达；pk：以psu-placi启动子驱动pdxk基因的表达。dcw：细胞干重(drycellweight)。*p《0.05。25.图3a至图3c显示包含cada质粒及pdxy或pdxk质粒的双质粒bl21菌株的戊二胺生产情形。图3a显示细胞的生长情形；图3b显示戊二胺的产量；图3c显示胞内plp的自生成量。dcw：细胞干重(drycellweight)。*p《0.05。26.图4显示共表达cada及pdxy或pdxk的双质粒bl21菌株在不同浓度赖氨酸中的戊二胺生产量及赖氨酸消耗率。27.图5显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)的赖氨酸脱羧酶(cada)的活性分析。柱状图中的白色柱代表添加磷酸吡哆醛(plp)作为辅助因子，浅灰色柱代表添加吡哆醇(pn)作为辅助因子，深灰色柱代表添加吡哆醛(pl)作为辅助因子。dap：戊二胺(1,5-diaminopentane)28.图6显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)，利用pn或pl作为前体时催化赖氨酸(1.2m)生产戊二胺(1,5-diaminopentane，dap)的产量与转化率。29.图7显示plp自生成菌株经psu-j23100-cada质粒克隆后(jcada-wmut菌株)循环利用的赖氨酸转化率。具体实施方式30.以下通过特定的具体实施例说明本公开的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所描述的内容轻易地了解本公开的优点及功效。本公开也可通过其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同的观点与应用，在不悖离本公开所描述的范围下赋予不同的修饰与变更。此外，本文所有范围和数值皆为包含及可合并的。落在本文中所述范围内的任何数值或点，例如任何整数，都可以作为最小值或最大值以导出下位的范围。31.除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一”和“该”包括多个个体。32.除非文中另有说明，否则本公开说明书及所附权利要求书中所使用的术语“或”包括“和/或”的含义。33.本公开提供一种表达载体，其包括编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因，其包括pdxh、pdxy及pdxk的核苷酸序列，以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的持续型启动子序列。本公开还提供一种包含该表达载体的重组微生物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。34.如本文中所使用，术语“磷酸吡哆醛”(plp)是指催化生物体反应生成1,5-戊二胺的赖氨酸脱羧酶的辅酶(或称为辅助因子)，磷酸吡哆醛为维生素b6的活性形式。如前所述，在大肠杆菌细胞内存在2条plp的自生成途径，分别为从头合成法，即利用葡萄糖生产plp，而另一条为超级救援途径，即利用维生素b6的前体，包括吡哆醛(pl)和吡哆醇(pn)等经催化生成plp。35.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxh基因的核苷酸序列为具有与seqidno：1至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：1具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxh活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxh具有seqidno：2的氨基酸序列或与seqidno：2具有保守变异的氨基酸序列。36.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxy基因的核苷酸序列为具有与seqidno：3至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：3具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxy活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxy具有seqidno：4的氨基酸序列或与seqidno：4具有保守变异的氨基酸序列。37.根据本公开的至少一个具体实施例，编码生成磷酸吡哆醛的pdxk基因的核苷酸序列为具有与seqidno：5至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：5具有相同活性的序列，例如可表现出具有生成磷酸吡哆醛的pdxk活性的蛋白质。于本公开的一些具体实施例中，生成磷酸吡哆醛的pdxk具有seqidno：6的氨基酸序列或与seqidno：6具有保守变异的氨基酸序列。38.如本文中所使用，术语“序列一致性百分比”是指一候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基与一参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可先将候选蛋白质或核酸片段与所述的蛋白质或核酸片段并排(align)，并于必要时引入空位(gap)，以使二序列形成最高的序列一致性。在计算序列一致性时，保守变异的氨基酸残基将视为不同的残基；简并密码子的核苷酸残基也将视为不同的残基，例如同样编码天门冬酰氨酸的密码子aau和aac之间，将视为有一个不同的残基u或c。39.应当理解，相较于本公开中作为参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列，序列中的至少一部分经修饰(如缺失、取代或添加)的候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列也在本公开的范围内，只要所得的候选蛋白质或核酸片段实质上具有与参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸相同的生物活性，这是由于密码子的简并性(codondegeneracy)。举例而言，在本公开所编码生成磷酸吡哆醛的酶的核苷酸序列中，可在编码区中产生各种修饰，前提是其不改变自该编码区表达的多肽的活性。因此，本公开所编码生成磷酸吡哆醛的pdxh基因的核苷酸序列可为具有seqidno：1的核苷酸序列或与seqidno：1至少有80％序列一致性的任何核苷酸序列，只要该核苷酸序列所编码的蛋白质能够呈现生成磷酸吡哆醛的pdxh的活性。同理，本公开中生成磷酸吡哆醛的pdxh可为具有seqidno：2的氨基酸序列或与seqidno：2同源的任何蛋白质，只要该蛋白质实质上能够呈现生成磷酸吡哆醛的pdxh的活性。40.如本文中所使用，术语“持续型启动子”是指在多数或全部组织中保持持续活性的启动子，相对于诱导型启动子必须受到外界信号或诱导物而调控，持续型启动子可持续表达特定基因。41.适用于本公开的持续型启动子包括属于j系列持续型启动子中的成员，例如：j23100、j23101、j23102、j23103、j23104、j23105、j23106、j23107、j23108、j23109、j23110、j23111、j23112、j23113、j23114、j23115、j23116、j23117、j23118及j23119。于至少一个具体实施例中，本公开所使用的持续型启动子可为j23100、j23109或j23114。于一些具体实施例中，本公开所使用的持续型启动子具有seqidno：7的序列或与seqidno：7至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：7具有相同活性的序列，例如同样可作为持续型启动子的序列。42.适用于本公开的持续型启动子进一步包括placi持续型启动子。于一些具体实施例中，该持续型启动子具有seqidno：8的序列或与seqidno：8至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：8具有相同活性的序列，例如同样可作为持续型启动子的序列。43.根据本公开的至少一个具体实施例，本公开的表达载体进一步包括选自由下列所组成组的至少一者：标记基因序列、报告基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、加强子序列、终止子序列以及调节子序列。44.于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有seqidno：9的序列或与seqidno：9至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：9具有相同活性的序列。于一些具体实施例中，本公开的表达载体具有seqidno：10的序列或与seqidno：10至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：10具有相同活性的序列。45.如本文中所使用，术语“赖氨酸脱羧酶”是指参与生物体生成1,5-戊二胺反应的酶，包括两种赖氨酸脱羧酶，即赖氨酸脱羧酶1(lysinedecarboxylase1，cada)及赖氨酸脱羧酶2(lysinedecarboxylase2，ldcc)，其中cada为诱导型酶，由缺氧、过多赖氨酸供给及ph改变所诱导，而ldcc则为持续型酶，不受外在ph改变所影响。46.根据本公开的至少一个具体实施例，该编码赖氨酸脱羧酶cada的核苷酸序列为具有与seqidno：11至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：11具有相同活性的序列，例如可表现出具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质。于一些具体实施例中，该赖氨酸脱羧酶cada具有seqidno：12的氨基酸序列或与seqidno：12具有保守变异的氨基酸序列。于本公开至少一个具体实施例所提供的表达载体，其包括编码赖氨酸脱羧酶cada的核苷酸序列，以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的持续型启动子序列。于本公开的一些具体实施例中，提供有一种包含该赖氨酸脱羧酶cada表达载体的重组微生物，以及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。于本公开的一些具体实施例中，该表达载体具有seqidno：13的序列或与seqidno：13至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％)序列一致性且与seqidno：13具有相同活性的序列。47.根据本公开的至少一个具体实施例，本公开提供一种包含两种或两种以上不同表达载体的微生物，其包括表达赖氨酸脱羧酶cada的表达载体以及表达生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk的重组微生物。于一些具体实施例中，本公开所提供的重组微生物可同时表达赖氨酸脱羧酶cada及生成磷酸吡哆醛，生成该磷酸吡哆醛的酶为pdxh、pdxy或pdxk基因所编码的生成磷酸吡哆醛的pdxh、pdxy或pdxk。于一些具体实施例中，本公开提供一种可自行生成磷酸吡哆醛的重组微生物。48.如本文中所使用，术语“重组”是指以人工方式组合两个彼此分离的序列片段。一般而言，术语“重组”是指核酸、蛋白质或微生物含有源自于多个不同来源的遗传物质，或由源自于多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物。49.如本文中所使用，术语“外源基因”是指源自于一个或多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物，可以利用已知的基因重组技术将外源基因于选定的宿主中表达，例如，使用表达载体在宿主中表达外源基因。50.如本文中所使用，术语“微生物”属于微观生物体，包括细菌、古细菌、病毒或真菌等。如于本文中所使用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。51.适用于作为本公开的表达载体的微生物宿主包括，但不限于，属于大肠杆菌属(escherichia)、克雷伯菌属(klebsiella)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗威登斯菌属(providencia)、棒状杆菌属(corynebacterium)或短杆菌属(brevibacterium)的微生物。于一些具体实施例中，本公开所使用的微生物宿主能够于体内表达赖氨酸脱羧酶cada及pdxk、pdxh或pdxy所编码的磷酸吡哆醛生成酶。于一些具体实施例中，本公开所使用的微生物宿主除了能够于体内表达赖氨酸脱羧酶cada及pdxk、pdxh或pdxy所编码的磷酸吡哆醛生成酶外，对于戊二胺也具有耐受性。52.如本文中所使用，术语“辅酶”或“辅助因子”包含正常酶活性所需的非蛋白质化合物。该等化合物可为有机物或无机物，例如，适用于本公开的辅酶或辅助因子包括，但不限于，磷酸吡哆醛(plp)、吡哆醛(pl)和吡哆醇(pn)等维生素b6的前体。53.以下通过特定的具体实施例进一步说明本公开的特点及功效，但非用于限制本公开的范围。54.实施例55.实施例1：构建表达载体56.以大肠杆菌k-12mg1655的基因组作为模板，设计带有hindiii及spei切位的引物以构建持续型启动子表达plp的超级救援基因pdxh、pdxy及pdxk，所使用的引物如下表一所示。57.表一、用于构建表达载体的引物[0058][0059][0060]以mg1655基因组作为模板并使用上述引物进行聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)，得到相关基因的特定dna序列扩增片段。用于扩增特定dna序列片段的pcr反应所需要的材料包含dna模板、5’ꢀ端引物、3’端引物、三磷酸脱氧核苷酸(dntp)、10x聚合酶缓冲液以及聚合酶，其中在本实施例中所使用的聚合酶包括ex-taq。pcr产物以dna电泳分析并经割胶回收，得到扩增的plp超级救援基因pdxh、pdxy及pdxk片段。[0061]将扩增的基因片段以hindiii及spei进行酶切反应，接着将扩增的plp超级救援基因片段插入psu-j23100或psu-placi载体内，构建成psu-j23100-pdxh(以jh表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxh基因表达)、psu-placi-pdxh(以ph表示，即以psu-placi启动子驱动pdxh基因表达)、psu-j23100-pdxy(以jy表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxy基因表达)、psu-placi-pdxy(以py表示，即以psu-placi启动子驱动pdxy基因表达)、psu-j23100-pdxk(以jk表示，即以psu-j23100启动子驱动pdxk基因表达)、以及psu-placi-pdxk(以pk表示，即以psu-placi启动子驱动pdxk基因表达)等质粒，再将质粒转化送入dh5α菌株。[0062]进行热转化时，取一管市售的dh5α胜任细胞，加入上述所得的质粒约10μl，先于冰上放置30分钟，再置于42℃水浴加热1.5分钟，之后置于冰上5至10分钟，接着加入400μl的lb(luriabertani)液态培养基或soc(superoptimalbrothwithcatabolitesrepression)培养基，置于37℃培养箱震荡培养约60至90分钟，再以4,000rpm离心3分钟，去除300μl的上清液，将含有重组dna的胜任细胞全数涂布于含抗生素的固态培养基上，并置于37℃环境下过夜培养。由此固态培养基上所生成的菌落，选取数颗接种于含抗生素的液态培养基中，于37℃培养箱过夜培养，获得含有各种质粒的dh5α菌液。[0063]实施例2：持续型自生成plp菌株的制备及其plp表达量[0064]抽取实施例1所制得并保存于dh5α细胞中的各质粒psu-j23100-pdxh、psu-placi-pdxh、psu-j23100-pdxy、psu-placi-pdxy、psu-j23100-pdxk及psu-placi-pdxk，经热转化送入大肠杆菌bl21或w3110菌株，将含有上述质粒的bl21或w3110菌株的胜任细胞涂布于含抗生素的固态培养基上，并置于37℃环境下过夜培养，再取数颗接种于含抗生素的液态培养基中，于37℃培养箱过夜培养，获得含有各质粒的bl21或w3110菌株，即为持续型自生成plp的菌株。[0065]将前述制得的持续型自生成plp的菌株培养于液态培养基中，在其中添加0.2mm的吡哆醇(pn)或吡哆醛(pl)进行培养，之后利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)分析各菌株的蛋白质表达量，并以野生型的bl21或w3110作为对照。[0066]在此进一步说明sds-page蛋白质分析法的步骤。首先，收集细胞并调整至od600为4，以去离子水洗涤2次后，提取细胞蛋白质。取30μl蛋白质样品后混合10μl的蛋白质染剂，以100℃加热10分钟，于sds胶片样品槽中加入15μl的样品溶液，即可进行sds-page电泳分析。sds-page的设定程序为先以80v进行30分钟，再以120v进行60分钟，待蓝色指示线跑出胶片的底端时停止，再以考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)染色40分钟至60分钟，并脱色约40分钟，视实际染色情况更换脱色液。待背景蓝色完全脱去后，换上去离子水，待背景颜色清楚后进行扫描。结果如图1所示，各种质粒在不同宿主菌株及添加pn或pl等不同前体所获得的蛋白质表达量不同，例如，添加pl前体时，含有jy、py及pk质粒的bl21菌株具有较高的plp蛋白质表达。[0067]进一步针对菌株的胞内plp进行定量。将过夜培养细胞定量至od600为20，以无菌水洗涤3次，再以12,000rpm离心3分钟，再将细胞回溶于1ml无菌水中。利用高压破碎仪以30kpsi破碎细胞，得到胞内代谢物，加入10％三氯醋酸，剧烈震荡后在冰上静置10分钟，以14,000g离心10分钟后去除蛋白质，取上清液以高效液相层析(highperformanceliquidchromatography，hplc)定量持续型自生成plp菌株中的plp产量。[0068]hplc定量plp的方式和分析条件包括将待分析样品通过0.2μm滤膜以进行过滤，使用的柱为反相色谱c18(ymc-c18色谱柱，4.6×250mm，粒径为5μm)，洗提缓冲液为0.1m的磷酸二氢钾(ph6.6)，洗提时间为0至20分钟，流速设为0.8ml/min，进样量为50μl。柱温维持在35℃，并且在340nm的波长处测量plp。以不同浓度标准品plp作为对照，即可测得样品中的plp浓度。[0069]图2显示bl21或w3110菌株中以不同质粒驱动plp表达的plp定量结果，其显示psu-j23100-pdxh(jh)质粒于w3110菌株宿主中的表达量相较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显著差异，而psu-j23100-pdxh(jh)、psu-placi-pdxh(ph)、psu-j23100-pdxy(jy)与psu-placi-pdxk(pk)质粒于bl21菌株宿主中的表达量相较于未经任何质粒转形的原始菌株具有显著差异。[0070]实施例3：双质粒菌株的制备及活性和产量的测试[0071]构建psit-cada表达载体，从大肠杆菌mg1655(genbank：nc_000913)的基因组dna中扩增赖氨酸脱羧酶基因，使用限制性内切酶bamhi和noti切出粘性末端，再以连接酶接进psit载体(psit载体购自addgene，载体商品名称：pskduet16，编号：#41684)以生成psit-cada(seqidno.20)。将psit-cada与psu-j23100-pdxy或psu-placi-pdxk同时送入bl21细胞，并于含有卡那霉素(kanamycin)与氯霉素(chloramphenicol)的双抗性培养基进行筛选，以构建双质粒菌株。[0072]接着，进行生物发酵法，即，将上述双质粒系统在液态培养基中于37℃培养，并以200rpm震荡，当细胞培养至od600到达0.6时，添加0.01mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside，iptg)、0.2mm的pn与50g/l的赖氨酸，并将细胞改至30℃，并以200rpm震荡培养。定时取样，以测量细胞生长情形、赖氨酸的消耗量与戊二胺的生成量。[0073]如图3a的结果所示，含有psit-cada与psu-j23100-pdxy(ajy)和含有psit-cada与psu-placi-pdxk(apk)的双质粒系统在10小时后，其生物质(biomass)均较仅含有psit-cada(a)的菌株多，代表其生长情形较佳。图3b显示ajy可在短时间内促进戊二胺的生产，而apk则可以达到最大的转化。图3c另显示双质粒系统具有较高的自生成plp能力。[0074]以双质粒系统进行全细胞转化，其步骤包括将过夜培养的细胞以8,000g离心5分钟后收集，使用纯水清洗2次后投入不同浓度的赖氨酸溶液中，在37℃下，以200rpm的震荡条件进行全细胞催化反应。于一定时间后将反应液置于100℃下水煮10分钟，再以高速离心取上清液，并以hplc定量分析赖氨酸消耗率与戊二胺生成率。[0075]以hplc定量分析赖氨酸与戊二胺衍生化体系由340μl的0.05m硼酸缓冲液(ph9)、240μl的100％甲醇、6μl的样品和12μl的200mm的乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(diethylethoxymethylenemalonate，deemm)组成。将上述样品在70℃下加热2小时，以完全降解过量的deemm和衍生化副产物。使用deemm进行衍生化后，再利用hplc进行分析。c18柱(ymc-c18柱，4.6×250mm，粒径5μm)维持在35℃。流动相a由100％乙腈组成，流动相b由25mm乙酸钠水溶液(ph4.8)组成。使用0.8ml/min的流速，并采用以下梯度程序：0–2分钟，20–25％a；2–32分钟，25–60％a；32–40分钟，60–20％a。检测在284nm进行。[0076]图4显示双质粒系统于不同浓度赖氨酸的催化效果，结果显示，apk系统催化能力最佳，且具有最高的戊二胺产率及赖氨酸消耗率。[0077]实施例4：自生成plp驯化菌株活性比较[0078]以驯化方式获得一持续型自生成plp菌株，包括将含有psu-j23100-cada的w3110菌株培养于含有高浓度吡哆醛(pl)的lb液态培养基中，此处吡哆醛(pl)的浓度为10至150μm，过夜培养后将该菌株接种于新鲜的含有高浓度的吡哆醛(pl)的培养基中，如此反复继代10次。将上述菌株均匀涂布在含有20g/l赖氨酸和100μm吡哆醛(pl)的lb琼脂培养基上(ph5.0)，挑选所得到的单菌落，进行cada酶活性测试，从中筛选出酶活性最高的菌株，而获得同时表达cada及plp相关基因的自生成plp菌株(本文后以jcada-wmut代表此经驯化的菌株)。[0079]将过夜培养的细胞以8000xg离心共5分钟后进行收集，使用纯水清洗2次后投入1.2m的赖氨酸溶液中，并添加plp、pn或pl等不同的前体，在37℃、200rpm震荡的条件下进行全细胞催化反应，并参考文献以溴甲酚紫分析法(bromophenolpurpletest，bptest)测定cada活性(ting,w.w.,huang,c.y.,wu,p.y.,huang,s.f.,lin,h.y.,li,s.f.,chang,j.s.&ng,i.s.(2021).whole-cellbiocatalystforcadaverineproductionusingstable,constitutiveandhighexpressionofl-lysinedecarboxylaseinrecombinantescherichiacoliw3110.enzymeandmicrobialtechnology,109811)。[0080]测定赖氨酸脱羧酶(cada)活性的bp分析步骤如下，首先取得od600定量为5的液体培养后所得的细菌细胞，进行高压破菌(30kpsi)后，以12,000rpm离心5分钟，可得到含有赖氨酸脱羧酶的可溶性蛋白样品。初步测试不同浓度赖氨酸对最大反应速率的关系，发现初始赖氨酸浓度为40mm时可得到戊二胺与hplc结果最佳的关联性。bp分析法在碱性会呈现紫色，在酸性则会呈现黄色。经过赖氨酸脱羧酶的反应，可增加戊二胺，并使ph上升，故bp分析法可侦测在波长595nm下的呈色，以测定赖氨酸脱羧酶(cada)的活性。[0081]使用下表二中的反应条件测量赖氨酸脱羧酶的活性，最后加入3％的三氯乙酸(trichloroaceticacid，tca)使赖氨酸脱羧酶所进行的反应终止，并借由波长595nm的变化(△od595)经由hplc戊二胺的定量得到校准曲线。[0082]表二、赖氨酸脱羧酶活性测量方法的反应条件[0083]项目浓度体积(μl)赖氨酸40mm40plp0.01mm10*bp分析0.2g/l25试样(od600)525醋酸钠缓冲液，ph＝60.5m400总体积500μl[0084]*测试突变株cada酶活性时可不加plp[0085]如图5所示，jcada-wmut的cada活性以添加pl作为辅助因子时为最高，甚至高于添加plp作为辅助因子时。[0086]另外，如图6所示，使用pl作为前体，并使用jcada-wmut作为生物催化剂时，可催化1.2m赖氨酸完全转化为戊二胺，而不需添加辅助因子plp，最终可达95％以上的戊二胺转化率及124g/l的戊二胺产量。[0087]实施例5：使用jcada-wmut作为循环利用催化剂[0088]将上述于2m赖氨酸的全细胞催化液中的细胞以12,000rpm离心1分钟后回收，再投入至2m的赖氨酸溶液中，并添加新的jcada-wmut菌株细胞，添加量以od600值计分别为1、2、3及5，如此循环利用2次。每次催化时间为4小时。催化后的溶液使用hplc定量赖氨酸与戊二胺浓度。[0089]结果如图7所示，jcada-wmut在每次补料od600值为5的条件下，可以循环利用至少2次，且仍维持95％以上的赖氨酸转化率。[0090]上述实施例仅为例示性说明，而非用于限制本公开。任何本领域技术人员均可在不违背本公开的范围下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本公开的权利保护范围将由所附权利要求所定义，只要不影响本公开的效果及实施目的，皆应涵盖于本公开的内容中。[0091]生物材料寄存[0092]本公开所提供的重组微生物为大肠杆菌(escherichiacoli)jcada-wmut，于2021年1月11日以寄存编号dsm33754寄存于德国微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，dsmz，德国，不伦瑞克市，d-38124，因霍芬大街7b)。当前第1页12当前第1页12
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