一种呋喃唑酮代谢物AOZ衍生化半抗原、完全抗原和血清抗体的制备方法及其应用

一种呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原、完全抗原和血清抗体的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫化学技术领域，具体是一种呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原、完全人工抗原的制备方法及其应用。


背景技术：

2.呋喃唑酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素，其原药和代谢物都具有相当大的毒性和致癌致畸致突变作用，已经被禁止使用，但是因为价格便宜，药效好，受经济利益驱使，目前许多国家非法使用现象仍很严重，因此加强对动物性食品中呋喃唑酮及其代谢物的检测监控就显得十分紧迫和必要。呋喃唑酮原药在动物体内不稳定，代谢迅速，无法直接检测，而其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(aoz)却能与动物组织中的蛋白质迅速并稳固结合，因此将 aoz作为检测动物性食品中呋喃唑酮残留量的靶向检测物。传统的aoz残留分析方法包括分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，这些方法虽然可以精确定量，但需要复杂昂贵的仪器和专业技术人员，存在高成本、低通量、操作复杂，检测速度慢等缺点，很难达到快速、简便、高通量的现场检测要求。
3.免疫分析方法是以抗原与抗体特异性、可逆分子识别理论为基础的分析技术，适用于复杂基质中痕量组分的分析，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、高通量、低成本、可现场检测等诸多优点，弥补了大型精密仪器分析技术的不足，目前发展迅速，逐渐成为有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，在食品安全监测中具有突出优势，也为呋喃唑酮代谢物aoz的检测提供了新的途径。
4.aoz是小分子物质(分子量太小，只有102.09)，免疫原性很低，单独作为抗原很难激发机体的免疫应答反应产生相对应的抗体，必须设法先将 aoz分子进行衍生化，设计出能够增大aoz分子结构且易于被机体细胞识别的抗原连接臂，得到的aoz衍生物与载体蛋白偶联制备出aoz衍生物人工完全抗原，才能诱导产生抗aoz衍生物特异性抗体，因此aoz衍生物抗原的分子设计、合成以及优选将直接影响能否制备出高质量的抗体，是呋喃唑酮代谢物aoz残留免疫分析的关键所在。国内学者常超等发现aoz-bsa的抗体对aoz灵敏度很低，ic
50
均大于100μg/ml，而通过对醛基苯甲酸作为连接臂与aoz偶联形成衍生化半抗原cpaoz后，cpaoz-bsa免疫产生的抗体对aoz苯甲醛衍生物(n-苯亚甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮，npaoz)灵敏度更高，特异性更好，说明合理的连接臂能够增强抗体亲和力，对建立高效、准确的aoz残留免疫检测方法具有重要作用。
5.目前文献报道的aoz衍生物半抗原连接臂的设计多数为只具有单个苯环的结构，均为同系物，形式较为单一，苯环上连接的碳链较短，得到的半抗原纯度不高，与载体蛋白偶联制备的完全人工抗原免疫小鼠后产生的血清抗体效价不稳定，其特异性和亲和力也不能很好地满足建立高效、准确的aoz 残留免疫检测方法的要求。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原、完全人工抗原的制备方法及其应用，以解决传统的aoz衍生物半抗原不足的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原，该半抗原的结构式如下：
[0009][0010]
其中，r表示r表示
[0011]
l表示(ch2)n或
[0012]
e表示c1-c20的直链或支链烷基；n表示1-20的自然数；a为1-17的自然数，b为1-17的自然数，且a b≤18。
[0013]
在上述技术方案的基础上，本发明还提供以下可选技术方案：
[0014]
一种如上述所述的呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将化合物ⅰ和化合物ⅱ进行亲核取代反应合成得到中间体ⅲ； (2)将中间体ⅲ与化合物ⅳ进行亲和取代反应，并将所得产物进一步水解反应得到一类具有醛基和羧基及苯偶联芳香基结构的aoz衍生化半抗原活性连接手臂
ⅴ
；(3)将呋喃唑酮代谢物aoz与活性连接手臂
ⅴ
通过胺醛缩合反应进行偶联，合成得到了一大类具有苯偶联芳香基结构的aoz衍生化半抗原；
[0015]
其中，化合物ⅰ的结构式为：
[0016][0017]
所述化合物ⅱ的结构式为：
[0018]
br-r-oh
[0019]
所述中间体ⅲ的结构式为：
[0020][0021]
所述化合物ⅳ的结构式为：
[0022][0023]
所述活性连接手臂
ⅴ
的结构式为：
[0024][0025]
所述呋喃唑酮代谢物aoz的结构式为：
[0026][0027]
其中，r表示其中，r表示
[0028]
l表示(ch2)n或
[0029]
e表示c1-c20的直链或支链烷基；n表示1-20的自然数；a为1-17的自然数，b为1-17的自然数，且a b≤18。
[0030]
在一种可选方案中，该半抗原具体合成路线如下：
[0031][0032]
其中，r表示r表示
[0033]
l表示(ch2)n或
[0034]
e表示c1-c20的直链或支链烷基；n表示1-20的自然数；a为1-17的自然数，b为1-17的自然数，且a b≤18。
[0035]
一种呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原，是载体蛋白与权利要求 1所述的新型aoz衍生化半抗原偶联得到的偶联物，其结构式如下：
[0036][0037]
在一种可选方案中：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；完全人工抗原为免疫抗原时，载体蛋白采用牛血清白蛋白；完全人工抗原为包被抗原时，载体蛋白采用卵清蛋白。
[0038]
一种如上述所述的呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)取半抗原2mg溶于2ml dmf中，加入10.32mg dcc 和5.76mg nhs；在4℃下磁力搅拌反应过夜，将反应液在转速3000r/min下进行离心5min，取离心后上清液为a液；(2)称取bsa或ova42mg并溶于7ml浓度为6mol/l的碳酸缓冲液中，并加入1ml的dmf，搅拌溶解，制备的蛋白溶液为b液；(3)用2.5ml注射器吸取a液缓慢滴入b液中，在 4℃下磁力搅拌反应12h；反应停止后取出反应液，放入低温且转速5000r/min 的离心机离心10min，取上清液，移入透析袋中，在4℃下用pbs透析3天，每天更换3次透析液。得到的完全抗原分装于0.5ml离心管中，并放入-20℃冰箱冻存；得到呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原。
[0039]
上述所述的呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原作为包被抗原在检测小鼠血清抗体效价和特异性中的应用。
[0040]
一种小鼠血清抗体，通过上述所述的呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原制备的小鼠血清抗体；其中，完全人工抗原为免疫抗原。
[0041]
一种如上述所述的小鼠血清抗体的制备方法，包括以下步骤：将呋喃唑酮代谢物aoz衍生化完全人工抗原中免疫人工抗原按照既定免疫程序对6-8 周龄雌性spf级balb/c小鼠进行免疫，并于第四次免疫10天之后断尾采血于灭菌的0.5ml的pe管中，37℃放置2h，让血液有所凝结，再放入4℃冰箱过夜，目的使血块收缩，血清自然析出，再用细针将凝结在壁上的血块搅落，3000r/min，离心5min，收集血清加入甘油进行分装，-20℃保存备用，得到小鼠血清抗体。
[0042]
本发明设计了一大类具有苯环偶联芳香环的双环结构的新型aoz衍生物半抗原连接臂(联苯型，苯偶联噻吩型，苯偶联吡咯，苯偶联呋喃，苯偶联哒嗪等)，并在碳链的设计上又分为不同饱和度和不同长度。
[0043]
本发明提供了一种新型aoz衍生物半抗原连接臂的制备方法。首先利用对羟基苯甲醛与原料br-r-oh进行亲核取代反应合成中间体，然后将中间体与溴代酸酯类化合物进行亲和取代反应，并将所得产物进一步水解反应得到具有醛基和羧基的aoz衍生物半抗原连接臂。
[0044]
本发明提供了一种新型aoz衍生物半抗原的制备方法；新型aoz衍生物半抗原是aoz与带有羧基和醛基的一系列苯偶联芳香环的连接臂通过胺醛缩合反应得到的产物。
[0045]
不同于以往所报道的单个芳香基的半抗原连接臂，本发明创新地设计并制备得到了一系列以苯偶联芳香基为本体的新型半抗原连接手臂，并带有醛基与羧基，易与aoz偶联成半抗原，也易与蛋白偶联成完全抗原。设计的双芳香基结构的新型半抗原连接手臂大大增加了aoz衍生物的分子量，制备得到的完全抗原更容易被免疫细胞识别，芳香基所带的s、n、o元素均为构成生命体的基本元素，使新型aoz衍生物完全抗原更具有免疫亲和性，希望
在aoz半抗原结构上的创新能够使动物机体产生更好的免疫应答效果，得到更高效价、更高灵敏度和特异性的优质抗aoz衍生物抗体。
[0046]
上述所述的小鼠血清抗体在检测小鼠血清抗体效价和特异性中的应用。
[0047]
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0048]
本发明创新地设计并制备得到了一系列以苯偶联芳香基为本体的新型半抗原连接手臂，并带有醛基与羧基，易与aoz偶联成半抗原，也易与蛋白偶联成完全抗原。设计的双芳香基结构的新型半抗原连接手臂大大增加了aoz 衍生物的分子量，制备得到的完全抗原更容易被免疫细胞识别，芳香基所带的s、n、o元素均为构成生命体的基本元素，使新型aoz衍生物完全抗原更具有免疫亲和性，希望在aoz半抗原结构上的创新能够使动物机体产生更好的免疫应答效果，得到更高效价、更高灵敏度和特异性的优质抗aoz衍生物抗体。
附图说明
[0049]
图1为实施例1中制得的aoz衍生物半抗原aoz-dp5的质谱图。
[0050]
图2为实施例1中制得的aoz衍生物半抗原aoz-dp5的核磁共振氢谱图。
[0051]
图3为实施例1中制得的aoz衍生物半抗原aoz-dp5的核磁共振碳谱图。
[0052]
图4为实施例2中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p1的质谱图。
[0053]
图5为实施例2中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p1的核磁共振氢谱图。
[0054]
图6为实施例2中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p1的核磁共振碳谱图。
[0055]
图7为实施例3中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p2的质谱图。
[0056]
图8为实施例3中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p2的核磁共振氢谱图。
[0057]
图9为实施例3中制得的aoz衍生物半抗原aoz-th-p2的核磁共振碳谱图。
[0058]
图10为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-dp5-bsa的紫外扫描鉴定图。
[0059]
图11为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-dp5-ova的紫外扫描鉴定图。
[0060]
图12为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p1-bsa的紫外扫描鉴定图。
[0061]
图13为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p1-ova的紫外扫描鉴定图。
[0062]
图14为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p2-bsa的紫外扫描鉴定图。
[0063]
图15为实施例5中制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p2-ova的紫外扫描鉴定图。
[0064]
图16为实施例5制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-dp5-bsa免疫小鼠后获得的血清抗体效价。
[0065]
图17为实施例5制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p1-bsa免疫小鼠后获得的血清抗体效价。
[0066]
图18为实施例5制得的aoz衍生物完全人工抗原aoz-th-p2-bsa免疫小鼠后获得的血清抗体效价。
具体实施方式
[0067]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明所列举的各实施例仅用以说明本发明，并非用以限制本发明的范围。对本发明所作的任何显而易知的修饰或变更都不脱离本发明的精神与范围。
[0068]
实施例1
[0069]
aoz衍生物半抗原aoz-dp5的合成，具体步骤如下：
[0070]
①
中间体4-羟基-1,1-联苯-4-甲醛的合成
[0071]
称取4-溴苯甲醛(1g，5.405mmol)，4-甲酰苯硼酸(1.232g，8.108mmol) 于三口瓶中，并加入25ml的thf(四氢呋喃)、5ml的2m k2co3和四(三苯基膦)钯(312mg，5.405mmol)，在n2气保护下，油浴60℃，有冷凝回流条件下，搅拌反应。用薄层色谱法追踪反应，反应8h后，将反应液倒入分液漏斗，加入适量水和二氯甲烷，萃取2～3次。收集下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。将所得的残留物再进行硅胶柱色谱纯化，洗脱剂比例为 (石油醚：丙酮＝30:1，v:v)，收集浓缩的产物，365nm紫外灯下为蓝色荧光，白色固体，产率为78.6％。
[0072]
将上步所得产物进行干燥后称取(822.5mg，3.879mmol)，取15ml二氯甲烷溶解在二口反应瓶中，恒压漏斗中加入6ml二氯甲烷，并加入 bbr30.582ml(5.82mmol)，使bbr3溶液缓慢滴入反应瓶中，在n2气体保护下，0℃冰浴搅拌反应，反应4h后，停止反应。滴加饱和nahco3溶液于反应中，至反应溶液ph为7。
[0073]
将反应液倒入分液漏斗中用二氯甲烷和蒸馏水，萃取2～3次。收集下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。
[0074]
将残留物进行硅胶柱色谱纯化，洗脱剂比例为(石油醚：丙酮＝10:1，v:v)，收集浓缩得到产物4-羟基-1,1-联苯-4-甲醛，365nm紫外灯下为蓝色荧光，干燥后为白色固体，产率57.8％。
[0075]
②
连接臂dp5的合成
[0076]
称取联苯型连接臂中间体(4-羟基-1,1-联苯-4-甲醛)(80.0mg，0.404mmol)，加入3倍原料当量的溴代酸乙酯系列药物7-溴庚酸乙酯1.212mmol于三口瓶中，再加入同样3倍于原料当量的其他反应药物k2co3(167.27mg，1.212mmol)，ki(201.19mg，1.212mmol)，15ml丙酮作为溶剂，在n2气体保护下，油浴60℃，有冷凝回流条件下，进行搅拌反应。
[0077]
用薄层色谱法追踪反应，反应时间6h后反应完全，停止反应，静置室温，用稀盐酸溶液调节ph至弱酸性，用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3次，减压旋蒸除去二氯甲烷，再用硅胶柱色谱进纯化，洗脱剂比例为(石油醚：丙酮＝5:1, v:v)，收集浓缩的产物。
[0078]
取12ml thf将上步得到的产物溶解加入到50ml三口瓶中，并加入6ml6m hcl，在油浴60℃，有冷凝回流条件下，搅拌进行反应。用薄层色谱法追踪反应，反应时间为6h。停止反应，静置室温后，滴加饱和nahco3溶液，调整溶液ph至弱酸性。用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3次，取下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。再用硅胶柱色谱纯化分步洗脱，首先用洗脱剂比例为(石油醚：丙酮＝4:1，v:v)，再用洗脱剂比例为(二氯甲烷：甲醇＝10:1，v:v)，收集浓缩的产物即为联苯型连接臂dp5，在365nm紫外灯下显蓝紫色荧光，50℃真空干燥后为白色固体。取适量连接臂dp5放入核磁管中，用d
6-dmso溶解，进行核磁共振碳氢谱的鉴定，再取少量连接臂dp5，溶剂为甲醇，进行质谱鉴定。
[0079]
③
aoz衍生物半抗原aoz-dp5的合成
[0080]
取干燥后的联苯型连接臂dp50.25 mmol，aoz 0.5mmol，以甲醇为溶剂，在75℃下磁力搅拌反应，8h后，产物呈固态析出，收集所得固体，先用蒸馏水洗3遍，再用甲醇洗3遍，50℃真空干燥后即得到联苯型半抗原aoz-dp5 乳白色固体。
[0081]
实施例2
[0082]
aoz衍生物半抗原aoz-th-p1的合成，具体步骤如下：
[0083]
①
中间体5-(4-羟基-苯基)-噻吩-2-甲醛的合成
[0084]
称取对碘苯甲酰(800mg，3.418mmol)和3倍对碘苯甲酰当量的5-甲酰基-2-噻吩硼酸(1.6g，10.254mmol)于三口瓶中，并加入20ml thf，4ml 2mk2co3，四(三苯基膦)钯(197.56mg，17.09mmol),在n2气体保护下，油浴60℃，有冷凝回流条件下，搅拌反应。用薄层色谱法追踪反应，反应8h 后，将反应液倒入分液漏斗，加入适量水和二氯甲烷，萃取2～3次。收集下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。将所得的残留物物经硅胶柱色谱进一步纯化，洗脱比例为(石油醚：二氯甲烷：丙酮＝20:1:1，v:v:v)，收集浓缩的产物，在365nm紫外灯下显蓝色荧光，干燥后为淡黄色固体，产率为 79.3％。将上步所得产物进行干燥后称取(234.1mg，1.0738mmol)，溶解在 10ml二氯甲烷中，在恒压漏斗中加入4ml二氯甲烷，并加入bbr
3 0.16ml (1.6mmol)，使bbr3溶液缓慢滴入反应瓶中，在n2气体保护下，0℃冰浴搅拌反应，反应4h后，停止反应。滴加饱和nahco3溶液于反应中，至反应溶液ph为7。将反应液倒入分液漏斗中用二氯甲烷和蒸馏水，萃取2～3次。收集下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。将残留物进行硅胶柱色谱纯化，洗脱剂比例为(石油醚：二氯甲烷：丙酮＝9:1:2，v:v:v)，浓缩得到产物5-(4-羟基-苯基)-噻吩-2-甲醛，在365nm紫外灯下显蓝色荧光，干燥后为淡黄色固体，产率为60.6％。
[0085]
②
连接臂th-p1的合成
[0086]
取苯偶联噻吩型连接臂中间体5-(4-羟基-苯基)-噻吩-2-甲醛(188.10mg， 0.922mmol)，再取3倍原料当量的溴代酸乙酯系列药物4-溴-2-丁烯酸乙酯 2.766mmol加入三口瓶中，再加入同样3倍于原料当量的其他反应药物k2co
3 (381.73mg，2.766mmol)，ki(459.185mg,2.766mmol)，18ml丙酮作为溶剂，在n2气体保护下，油浴70℃，有冷凝回流条件下，磁力搅拌进行反应。
[0087]
通过薄层层析法用薄层色谱法追踪反应，反应7h后，停止反应，静置室温，用稀盐酸溶液调节ph至弱酸性，用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3次，减压旋蒸除去二氯甲烷，再用硅胶柱色谱进纯化，洗脱剂比例为(石油醚：二氯甲烷：丙酮＝20:3:3，v:v:v)，收集浓缩的产物。取15ml thf将上步得到的产物溶解加入到50ml三口瓶中，并加入8ml 6m hcl，在油浴60℃，有冷凝回流条件下，搅拌进行反应。用薄层色谱法追踪反应，反应时间为6h。停止反应，静置室温后，滴加饱和nahco3溶液，调整溶液ph至弱酸性。
[0088]
用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3次，取下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。通过硅胶柱色谱纯化，洗脱剂比例为(石油醚：二氯甲烷：乙醇＝5:15:4， v:v:v)，收集浓缩的产物即为噻吩联苯型aoz连接臂th-p1，在365nm紫外灯下显蓝绿色荧光，50℃真空干燥后为黄绿色固体。取适量连接臂th-p1 放入核磁管中，用d6-dmso溶解，进行核磁共振碳氢谱的鉴定，再取少量连接臂th-p1，溶剂为甲醇，进行质谱鉴定。
[0089]
③
aoz衍生物半抗原aoz-th-p1的合成
[0090]
取干燥后的苯偶联噻吩型连接臂th-p1 0.25mmol，aoz 0.5mmol，以甲醇为溶剂，在80℃下磁力搅拌反应，8h后，产物呈固态析出，收集所得固体，先用蒸馏水洗3遍，再用甲醇洗3遍，50℃真空干燥后即得到苯偶联噻吩型半抗原aoz-th-p1，为淡黄色固体。
[0091]
实施例3
[0092]
aoz衍生物半抗原aoz-th-p2的合成，具体步骤如下：
[0093]
①
中间体5-(4-羟基-苯基)-噻吩-2-甲醛的合成
[0094]
同实施例2。
[0095]
②
连接臂th-p2的合成
[0096]
取苯偶联噻吩型连接臂中间体5-(4-羟基-苯基)-噻吩-2-甲醛(188.10mg， 0.922mmol)，再取3倍原料当量的溴代酸乙酯系列药物4-溴丁酸乙酯2.766 mmol加入三口瓶中，再加入同样3倍于原料当量的其他反应药物k2co
3 (381.73mg，2.766mmol)，ki(459.185mg,2.766mmol)，18ml丙酮作为溶剂，在n2气体保护下，油浴70℃，有冷凝回流条件下，磁力搅拌进行反应。通过薄层层析法用薄层色谱法追踪反应，反应7h后，停止反应，静置室温，用稀盐酸溶液调节ph至弱酸性，用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3次，减压旋蒸除去二氯甲烷，再用硅胶柱色谱进纯化，洗脱剂比例为(石油醚：二氯甲烷：丙酮＝20:3:3，v:v:v)，收集浓缩的产物。取15ml thf将上步得到的产物溶解加入到50ml三口瓶中，并加入8ml 6m hcl，在油浴60℃，有冷凝回流条件下，搅拌进行反应。
[0097]
用薄层色谱法追踪反应，反应时间为6h。停止反应，静置室温后，滴加饱和nahco3溶液，调整溶液ph至弱酸性。用二氯甲烷和蒸馏水萃取2～3 次，取下层二氯甲烷层，减压旋蒸除去二氯甲烷。通过硅胶柱色谱纯化，洗脱剂比例为(石油醚：二氯甲烷：乙醇＝5:15:4，v:v:v)，收集浓缩的产物即为噻吩联苯型aoz连接臂th-p2，在365nm紫外灯下显蓝绿色荧光，50℃真空干燥后为黄绿色固体。取适量连接臂th-p2放入核磁管中，用d
6-dmso 溶解，进行核磁共振碳氢谱的鉴定，再取少量连接臂th-p2，溶剂为甲醇，进行质谱鉴定。
[0098]
③
aoz衍生物半抗原aoz-th-p2的合成
[0099]
取干燥后的苯偶联噻吩型连接臂th-p2 0.25mmol，aoz 0.5mmol，以甲醇为溶剂，在80℃下磁力搅拌反应，8h后，产物呈固态析出，收集所得固体，先用蒸馏水洗3遍，再用甲醇洗3遍，50℃真空干燥后即得到苯偶联噻吩型半抗原aoz-th-p2，为浅黄色固体。
[0100]
实施例4
[0101]
取适量实施例1～3中制得的3种aoz衍生物半抗原(aoz-dp5、 aoz-th-p1和aoz-th-p2)，溶剂为d
6-dmso，进行核磁共振碳、氢谱鉴定，再取少量半抗原，溶剂为dmf，进行高分辨质谱鉴定，测得的质谱图、核磁共振氢谱图和碳谱图如图1-图9所示。由图图1-图9可知实施例1～3中得到的3种苯偶联芳香基结构的新型aoz衍生物半抗原aoz-dp5、aoz-th-p1和aoz-th-p2都合成成功，半抗原纯度有较大的提高。
[0102]
图1-图3中半抗原aoz-dp5的质谱、核磁共振氢谱和碳谱数据如下：
[0103]
hrms:c23h26o4 for[m na] ,calculated 433.1734,found 433.17209；
[0104]1h nmr(600mhz,d6-dmso,tms):δ7.84(s,1h),7.76(d,j＝12.0hz, 2h),7.70(d,j＝12.0hz,2h),7.64(d,j＝12.0hz,2h),7.01(d,j＝12.0hz,2h), 4.49(t,j＝6.0hz,2h),3.99(t,j＝6.0hz,2h),3.95(t,j＝6.0hz,2h),2.20(t,j ＝6.0hz,2h),1.73 1.69(m,2h),1.54 1.49(m,2h),1.44 1.39(m,2h), 1.35 1.30(m,2h)；
[0105]
13
c nmr(125mhz,d6-dmso,tms):δ174.9,159.3,154.1,145.8,139.4, 137.5,132.3,127.4,126.2,123.3,115.6,68.0,62.0,42.8,34.1,28.9,28.7,25.7, 24.9。
[0106]
图4-图6中半抗原aoz-th-p1的质谱、核磁共振氢谱和碳谱数据如下：
[0107]
hrms:c18h16n2o5s for[m h] ,calculated 373.0853,found 373.08530；
[0108]1h nmr(600mhz,d6-dmso,tms):δ8.01(s,1h),7.65(d,j＝12.0hz, 2h),7.41 7.38(m,2h),7.03(d,j＝6.0hz,2h),6.95 6.91(m,1h),4.02(t,j＝ 6.0hz,2h),6.03(d,j＝12.0hz,1h),4.83 4.82(m,2h),4.47(t,j＝6.0hz, 2h),3.91(t,j＝6.0hz,2h)；
[0109]
13
c nmr(125mhz,d6-dmso,tms):δ167.1,158.4,154.1,145.5,143.0, 139.4,137.8,132.3,127.5,126.8,123.5,122.9,115.8,66.7,62.0,42.8。
[0110]
图7-图9中半抗原aoz-th-p2的质谱、核磁共振氢谱和碳谱数据如下：
[0111]
hrms:c18h18n2o5s for[m h] ,calculated 375.1009,found 375.09991；
[0112]1h nmr(600mhz,d6-dmso,tms):δ8.01(s,1h),7.62(d,j＝12.0hz, 2h),7.39 7.37(m,4h),6.98(d,j＝6.0hz,2h),4.47(t,j＝6.0hz,2h),4.02(t, j＝6.0hz,2h),3.91(t,j＝6.0hz,2h),2.38(t,j＝6.0hz,2h),1.96 1.92(m, 2h)；
[0113]
13
c nmr(125mhz,d6-dmso,tms):δ174.5,159.2,154.1,145.7,139.6, 137.6,132.3,127.4,126.3,123.3,115.6,67.3,62.0,42.8,30.6,24.7。
[0114]
实施例5
[0115]
将实施例1～3中制得的3种aoz衍生物半抗原和相同载体蛋白进行偶联得到完全人工抗原，包括免疫抗原和包被抗原，免疫抗原和包被抗原的不同之处在于偶联的载体蛋白种类不同，免疫抗原采用的载体蛋白为牛血清蛋白(bsa)，包被抗原采用的载体蛋白为卵清蛋白(ova)。
[0116]
新型aoz衍生物完全人工抗原通过以下方法制备，其步骤如下：取半抗原2mg溶于2ml dmf中，加入10.32mg dcc和5.76mg nhs。4℃下磁力搅拌反应过夜，将反应液进行离心，3000r/min，5min，取离心后上清液为a液，称取bsa或ova42.00mg溶于7ml浓度为6mol/l的碳酸缓冲液(ph9.6) 中。并加入dmf 1ml，搅拌溶解制备蛋白溶液为b液。用2.5ml注射器吸取a液缓慢滴入b液中，在4℃下磁力搅拌反应12h。反应停止后取出反应液，放入低温高速离心机，5000r/min，10min，取上清液，移入透析袋中，4℃下用pbs(ph7.4)透析3d，每天更换3次透析液。得到的完全抗原分装于 0.5ml离心管中，并放入-20℃冰箱冻存。
[0117]
通过紫外扫描根据最大吸收峰的位移来判断aoz衍生物半抗原与载体蛋白是否偶联成功，紫外扫描图如图10-图15所示，由图10-图15可知6种具有苯偶联芳香基结构的新型aoz衍生物完全人工抗原aoz-dp5-bsa、 aoz-dp5-ova、aoz-th-p1-bsa、aoz-th-p1-ova、aoz-th-p2-bsa、 aoz-th-p2-ova都偶联成功。采用考马斯亮兰法测定6种完全人工抗原的浓度。
[0118]
实施例6
[0119]
将实施例5中制得的3种新型aoz衍生物免疫抗原aoz-dp5-bsa、 aoz-th-p1-bsa、aoz-th-p2-bsa按照既定免疫程序对6-8周龄雌性spf 级balb/c小鼠进行免疫，并于第四次免疫10天之后断尾采血于灭菌的0.5ml 的pe管中，37℃放置2h，让血液有所凝结，再放入4℃冰箱过夜，目的使血块收缩，血清自然析出，再用细针将凝结在壁上的血块搅落，3000r/min，离心5min，收集血清加入甘油进行分装，-20℃保存备用。
[0120]
采用间接elisa法进行小鼠血清抗体效价的测定，测定的步骤如下：将包被原用包被缓冲液稀释成1μg/ml，100μl/孔，置于4℃过夜；倾去孔内液体，每孔加洗涤缓冲液300μl，洗涤3次，每次2min，然后甩净、拍干；每孔加入250μl封闭液，37℃封闭60min，洗涤、拍干；除最前面一列孔加入阴性血清作为对照组外，其余各列孔加入从1:2000开始用pbs倍比稀释的待检血清，每孔100μl，每只老鼠血清两个平行，37℃反应45min，洗涤、甩净、拍干；每孔加入100μl hrp-羊抗鼠igg(1:4000稀释)，37℃反应45min，洗涤同上、甩净、拍干；取显色液a液和b液等体积混合，现配现用，每孔加入显色液100μl，置于37℃显色15min；每孔加入50μl的终止液(10％ h2so4)以终止反应；在反应终止15min后，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光值。得到的血清抗体效价数据如图16-图18所示，由图16-图18可知，使用实施例1～3中制得的3种aoz衍生物半抗原偶联得到的完全抗原免疫小鼠，小鼠血清抗体效价均可以稳定在1:16000以上。
[0121]
采用间接竞争elisa法进行小鼠血清抗体特异性和灵敏度的测定，测定的步骤如下：(1)将包被原用包被缓冲液稀释成1μg/ml，100μl/孔，置于 4℃过夜；倾去孔内液体，每孔加洗涤缓冲液300μl，洗涤3次，每次2min，然后甩净、拍干；每孔加入250μl封闭液，37℃封闭60min，洗涤、拍干；加入不同浓度呋喃唑酮代谢物aoz衍生物标准溶液50μl/孔，再加入配制好的小鼠血清抗体溶液50μl/孔，每只老鼠血清两个平行，37℃反应45min，洗涤、甩净、拍干；每孔加入100μl hrp-羊抗鼠igg(1:4000稀释)，37℃反应45min，洗涤同上，甩净、拍干；取显色液a液和b液等体积混合，现配现用，每孔加入显色液100μl，置于37℃显色15min；每孔加入50μl的终止液(10％h2so4)以终止反应；在反应终止15min后，用酶标仪测定各孔在 450nm处的吸光值。得到的血清抗体特异性和灵敏度数据如表1所示，由表 1可知，使用实施例5中制得的3种aoz衍生物完全免疫抗原免疫小鼠得到的血清抗体都具有特异性，灵敏度均可达100ng/ml左右。
[0122]
表1间接竞争elisa测试不同浓度aoz衍生物标准品od值
[0123][0124]
注：b/b0是指不同浓度的标准品测试孔od值与浓度为0的标准品测试孔od值的比值。
[0125]
本发明制备得到了一大类具有苯偶联芳香基结构的新型aoz衍生物半抗原，实施方式中只详细介绍了aoz-dp5、aoz-th-p1和aoz-th-p2三种新型aoz衍生物半抗原，本发明其它苯偶联芳香基结构aoz衍生物半抗原的实施方式和上述三种aoz衍生物半抗原的实施
方式相似。
[0126]
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。