一种基于融合蛋白的抗NK细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基与流程

一种基于融合蛋白的抗nk细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基
技术领域
1.本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种基于融合蛋白的抗natural killer细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基。


背景技术：

2.nk细胞是人体先天免疫的核心组成部分，在机体抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。nk细胞具有主要组织相容性复合体(mhc)非限制性杀伤的特点。nk细胞的表型是cd3-cd56 。nk细胞对肿瘤细胞的杀伤主要包括以下4种途径：(1)穿孔素和颗粒酶介导的直接杀伤；(2)膜肿瘤坏死因子家族分子介导的肿瘤细胞凋亡；(3)通过分泌多种细胞因子，协同抑制或杀伤肿瘤细胞；(4)nk细胞表面表达免疫球蛋白fc片段的低亲和力受体cd16分子，当它与抗体结合后，会诱导抗体依赖性细胞毒性作用(adcc)，特异性杀伤与抗体igg结合的肿瘤细胞。这保证了nk细胞用于肿瘤免疫治疗的效果。
3.目前，nk细胞用于肿瘤免疫治疗主要是先获得患者的nk细胞，然后体外培养，再回输到患者体内，以发挥治疗作用。但是，有的患者因为机体自身原因，其nk细胞在体外非常容易衰老，杀伤力较低，导致回输后治疗作用不及预期。
4.为了克服部分患者nk细胞体外培养易衰老、回输后杀伤力较低的问题，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于融合蛋白的抗natural killer细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基。
6.本发明目的通过以下技术方案实现：
7.一种抗natural killer细胞衰老的融合蛋白，该融合蛋白为重组人突触融合蛋白12。
8.一种基于融合蛋白的抗natural killer细胞衰老的体外培养方法，在natural killer细胞体外培养时给予重组人突触融合蛋白12干预培养。
9.一种抗natural killer细胞衰老的培养基，该培养基中含有重组人突触融合蛋白12。
10.有益技术效果：
11.本发明细胞试验证明重组人突触融合蛋白12体外干预natural killer细胞培养时，可以有效抑制natural killer细胞衰老；动物试验证明重组人突触融合蛋白12干预培养的natural killer细胞在体内对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。这些试验证明重组人突触融合蛋白12不仅可以抗natural killer细胞衰老，还可以提高natural killer细胞对肿瘤的杀伤力。据此，可以开发相应的natural killer细胞培养基。
条件下培养，每2～3天换液，传代，取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞并确定细胞活力不低于95％，调整细胞终密度为3
×
106/0.2ml细胞悬液备用。
31.常规nk细胞：分离纯化的nk细胞用nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养12d。
32.stx12干预nk细胞：分离纯化的nk细胞用含800ng/ml重组人突触融合蛋白12的nk细胞培养基在37℃、5％co2条件下培养12d。
33.取上述细胞悬液以每只0.2ml接种于裸鼠右下肢外侧皮下，饲养于标准条件的spf层流实验室中，给予无菌饲料和水自由饮食。接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，游标尺测量肿瘤大小。待瘤体生长到合适大小时，随机将裸鼠分为2组，每组4只。常规nk细胞组：每隔2d腹腔注射常规nk细胞1
×
106个/0.2ml；stx12干预nk细胞组：每隔2d腹腔注射stx12干预nk细胞1
×
106个/0.2ml。共注射nk细胞5次，最后1次注射次日应用水合氯醛处死裸鼠。剥取肿瘤组织，称重。
34.6、统计学分析
35.采用spss 19.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值
±
标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。***p《0.05为差异具有统计学意义。
36.三、实验结果
37.1、nk细胞分离纯化
38.nk细胞免疫磁珠分选是分离纯化nk细胞最高效的手段。经过nk细胞免疫磁珠分选，cd3-cd56 代表的nk细胞的纯度从分选前的9.4％提高到99.3％，nk细胞分离纯化成功。
39.2、细胞衰老水平测定
40.sa-β-gal染色阳性的细胞代表衰老细胞。各组染色结果如图1所示，与对照组相比，衰老组阳性细胞明显增多，说明高糖诱导衰老模型成功；与衰老组相比，stx12-a组、stx12-b组阳性细胞明显减少，且可见剂量依赖性，说明stx12干预培养可以有效抗nk细胞衰老。
41.3、体内杀伤力测定
42.如图2所示，与常规nk细胞相比，stx12干预nk细胞组移植瘤大小和重量均明显降低，说明重组人突触融合蛋白12干预培养的nk细胞在体内对肿瘤具有更强的杀伤力。
43.以上实施例是为了具体介绍本发明的实质性内容。本领域技术人员应当知道，不应将本发明保护范围局限于以上具体实施例。


技术特征：
1.一种抗natural killer细胞衰老的融合蛋白，该融合蛋白为重组人突触融合蛋白12。2.一种基于融合蛋白的抗natural killer细胞衰老的体外培养方法，其特征在于：在natural killer细胞体外培养时给予重组人突触融合蛋白12干预培养。3.一种抗natural killer细胞衰老的培养基，该培养基中含有重组人突触融合蛋白12。

技术总结
本发明公开了一种基于融合蛋白的抗NK细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基，保护一种抗Natural Killer细胞衰老的融合蛋白—重组人突触融合蛋白12。本发明细胞试验证明重组人突触融合蛋白12体外干预Natural Killer细胞培养时，可以有效抑制Natural Killer细胞衰老；动物试验证明重组人突触融合蛋白12干预培养的Natural Killer细胞在体内对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。这些试验证明重组人突触融合蛋白12不仅可以抗Natural Killer细胞衰老，还可以提高其对肿瘤的杀伤力。还可以提高其对肿瘤的杀伤力。还可以提高其对肿瘤的杀伤力。


技术研发人员：ꢀ(51)Int.Cl.C07K14/47
受保护的技术使用者：南京良纬生物科技有限公司
技术研发日：2022.09.29
技术公布日：2022/11/18