凝结芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及凝结芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.人体的皮肤一般从25～30岁以后即随着年龄的增长而逐渐衰老，大约在35～40岁后逐渐出现比较明显的衰老变化。皮肤衰老也称为皮肤老化，是皮肤组织在内外环境的不断作用下细胞结构功能发生退化，出现皮肤质地改变(如弹性、张力、厚薄及表面纹理等)、色素改变、血管萎缩或增生的生理现象。皮肤衰老通常分为内源性老化(自然衰老)和外源性老化(光老化)。老化导致炎症发生，活性氧增加，氧化应激增加，细胞修复能力下降，同时细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分(胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等)随着皮肤衰老而显着减少。
3.在衰老机制的研究中发现，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老。寻求针对不同皮肤老化途径并且提升皮肤细胞状态的抗衰老物质是目前重要的研究方向。
4.人体皮肤作为抵御外来病原体侵害的第一道防线，通过多种机制主动或被动地保护宿主皮肤，这是自我保护其中一个重要机制就是表皮固有的分泌抗菌肽。
5.皮肤共生菌可通过调节抗菌肽的生成，从而调控皮肤受损后的炎症反应及参与局部免疫防御。皮肤正常共生菌可以通过直接分泌或诱导机体自身生成抗菌肽，抑制病原微生物的繁殖。它常见的作用方式是通过增加细菌细胞膜的通透性，裂解细菌，造成细菌的死亡。
6.真菌也是皮肤微生态系统的重要成员之一，限制马拉色菌(malassezia restricta)是人类皮肤上的优势菌属。最近的大规模测序分析表明，与健康头皮相比，有头皮屑的头皮上含有更多的限制性马拉色菌，这表明真菌与头皮屑之间存在关联，微生物群落失衡可能在头皮屑的产生中起作用。此外，马拉色菌是一种嗜脂性真菌，在皮肤皮脂腺分泌旺盛的情况下，该真菌依赖皮肤分泌的油脂生存和大量繁殖，以导致马拉色菌毛囊炎感染。
7.有益的皮肤微生物能够分解磷脂、固醇类、角质蛋白可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。因此，提供一种利用微生物技术开发的皮肤微生态相关产品，在改善皮肤状态方面具有广泛的应用价值。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供凝结芽孢杆菌及其应用。
9.本发明提供了保藏编号为cctcc no:m 20221164的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)。
10.进一步的，所述的凝结芽孢杆菌由西藏米堆冰川融化水距水面10～15cm的水层中采集获得，命名为gforu-22，通过革兰氏染色镜检及16s rdna测序鉴定其为凝结芽孢杆菌
(bacillus coagulans)。
11.本发明提供了含有所述凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)的菌群。
12.进一步的，本发明提供了含有所述的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)或所述菌群的菌剂。所述的菌剂的剂型包括颗粒、液体及干粉，本发明对此不做限定。
13.本发明提供了如下i)～iii)所示在制备改善肌肤状况的产品中的应用：
14.i)、本发明所述的凝结芽孢杆菌或其培养物、外泌体、裂解物和/或提取物；
15.ii)、本发明所述的菌群；
16.iii)、本发明所述的菌剂。
17.本发明中，所述改善皮肤细胞状况包括促进细胞增殖、抗衰老、提高细胞抗菌能力，抑制皮肤病原菌中的至少一种。
18.本发明中，所述的凝结芽孢杆菌可促进细胞增殖；所述细胞包括角质细胞和树枝状细胞；所述树枝状细胞包括黑素细胞、朗格汉斯细胞、麦克尔细胞及未定型细胞。
19.进一步的，所述的促进细胞增殖为促进损伤角质细胞的增殖；所述角质细胞包括hacat细胞和kc细胞。
20.更进一步的，在一些具体的实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清来检测对sds损伤的hacat细胞的修复能力的影响，实验结果表明，本发明所述的凝结芽孢杆菌可促进sds损伤的hacat细胞增殖，具有促进hacat细胞损伤修复能力。
21.本发明中，所述的凝结芽孢杆菌具有抗衰老能力，所述抗衰老包括如下a)～e)所示中的至少一种：
22.a)、上调细胞外基质相关基因的表达和/或抑制降解细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括sptssa和/或mkx；所述降解细胞外基质相关基因包括p38mapk和/或mmp家族中的至少一种；
23.b)、下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括caspase家族的至少一种；
24.c)、上调抑制细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括bcl-2；
25.d)、上调细胞抗氧化相关基因的表达；所述细胞抗氧化相关基因包括nrf2和/或sirt-3；
26.f)、上调免疫调节因子相关基因的表达；所述免疫调节因子相关基因包括mor；
27.e)、抑制胶原蛋白酶活性。
28.本发明中，所述的凝结芽孢杆菌可促进细胞外基质的合成。所述细胞外基质是由胶原蛋白、酶、糖蛋白和羟基磷灰石等组成的三维网络，为周围细胞提供结构和生化支持。所述的促进细胞外基质合成包括上调细胞外基质相关基因的表达和/或下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括sptssa、mkx、col4a43、col4a4或col4a5；所述降解细胞外基质相关基因包括p38mapk和/或mmp家族中的至少一种。
29.进一步的，在一些具体的实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清，研究凝结芽孢杆菌对hacat细胞外基质合成的影响。结果表明，所述的凝结芽孢杆菌可上调细胞外基质相关基因sptssa和mkx的表达，和/或下调降解细胞外基质相关基因mmp家族中的至少一种基因的表达，起到促进hacat细胞外基质生成的作用。
30.本发明中，所述的凝结芽孢杆菌可抑制细胞凋亡。所述细胞凋亡是指细胞自主、有
序的死亡；所述的抑制细胞凋亡包括上调抑制细胞凋亡相关基因和/或下调细胞凋亡相关基因的表达；所述抑制细胞凋亡基因包括bcl-2、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1，所述细胞凋亡基因包括bax、bid、bak、bad、bcl-xs、bim或caspase家族的至少一种。
31.进一步的，在一些具体实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清，研究凝结芽孢杆菌对hff细胞凋亡的影响。结果表明，所述的凝结芽孢杆菌可上调hff细胞抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达和下调凋亡相关基因caspase家族基因中至少一种的表达，抑制hff细胞凋亡。
32.本发明中，所述的凝结芽孢杆菌可提高细胞抗氧化能力。所述的抗氧化包括上调抗氧化相关基因的表达。所述抗氧化相关基因包括但不限于nrf2、sirt-3、sod、cat或gsh-px。
33.进一步的，在一些具体实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清，研究凝结芽孢杆菌对hacat细胞和hff细胞抗氧化能力的影响。结果表明，所述的凝结芽孢杆菌可上调hacat细胞和hff细胞抗氧化相关基因nrf2和/或sirt-3的表达，提高细胞抗氧化的能力。
34.本发明所述的凝结芽孢杆菌可提高细胞免疫调节能力。所述提高细胞免疫调节能力包括上调免疫调节因子相关基因的表达。所述免疫调节因子相关基因包括但不限于mor。
35.进一步的，在一些具体实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清，研究凝结芽孢杆菌对hff细胞免疫调节能力的影响。结果表明，所述的凝结芽孢杆菌可上调hff细胞免疫调节相关基因mor的表达，提高细胞免疫调节能力。
36.本发明所述的凝结芽孢杆菌可抑制胶原蛋白酶活性来减少胶原蛋白降解，从而能起到抗衰老作用。
37.本发明所述的凝结芽孢杆菌可提高细胞抗菌能力。所述提高细胞抗菌能力包括上调细胞抗菌肽相关基因的表达。所述的抗菌肽相关基因包括但不限于s100a7、s100a8和/或ll-37。
38.进一步的，在一些具体实施例中，本发明利用所述的凝结芽孢杆菌的上清，研究凝结芽孢杆菌对hacat细胞抗菌能力的影响。结果表明，所述的凝结芽孢杆菌可上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8和/或ll-37的表达，提高细胞抗菌能力。
39.本发明所述的凝结芽孢杆菌可抑制限制马拉色菌生长，从而能起到减少皮肤病原菌,平衡皮肤菌群的作用。
40.本发明提供了改善皮肤状况的产品，其包括如下i)～iii)所示中的至少一种：
41.i)、本发明所述的凝结芽孢杆菌或其培养物、外泌体、裂解物和/或提取物；
42.ii)、本发明所述的菌群；
43.iii)、本发明所述的菌剂。
44.进一步的，本发明所述的产品包括化妆品，所述的化妆品剂型包括：膏霜类、乳液类、水剂类、凝胶类、油剂类、粉剂类、散粉、气雾剂类、膜类、冻干类中的至少一种。
45.本发明还提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、熏蒸、外敷或注射，本发明对此不做限定。
46.本发明分离得到凝结芽孢杆菌gforu-22，其保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221164。实验表明，gforu-22可促进细胞增殖，提高细胞抗衰老及
抗菌能力，抑制皮肤病原菌，可用于食品、药品、化妆品等领域。
47.生物保藏说明
48.凝结芽孢杆菌gforu-22(bacillus coagulans gforu-22)，于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 20221164。
具体实施方式
49.本发明提供了凝结芽孢杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
50.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
51.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
52.实施例1 gforu-22的分离
53.用灭菌采样瓶于西藏米堆冰川融化水中采样，在距水面10～15cm的水层打开瓶塞取样，盖上盖子后再从水中取出，水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。低温运回实验室后取适当量水样以低速离心去除杂质，取上清划线于营养肉汤培养基固体平板，37℃恒温培养16h后，挑取菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为gforu-22。
54.革兰氏染色镜检：菌株gforu-22为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在营养肉汤平板上生长，可形成为2～3mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；在营养肉汤液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
55.实施例2 gforu-22的核酸鉴定
56.1、16s rdna基因序列分析：
57.挑取单菌落置营养肉汤液体培养基中，37℃摇床培养40h后，12000转离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f，1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
58.2、结果
59.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出gforu-22菌株为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)。
60.实施例3 gforu-22促进sds诱导的人永生化角质形成细胞hacat损伤修复实验
61.1、gforu-22上清液制备：
62.挑取凝结芽孢杆菌gforu-22单菌落于营养肉汤液体培养基，37℃摇床培养40h，酶标仪检测并以营养肉汤液体培养基稀释调整od
600
＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。
63.2、促进hacat细胞修复实验
64.接种hacat细胞(5
×
104cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/ml sds，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加5％上清液(对照组以等体积营养肉汤液体培养基替代上清液)培养24h。向每孔加入10μl的cck-8溶液，培养4h，
检测450nm处吸亮度a。
65.细胞增殖率计算公式及结果如表1：
66.表1.gforu-22促进hacat细胞修复
[0067][0068]
上表结果可知，gforu-22上清液对hacat细胞sds损伤具有修复作用。
[0069]
实施例4 gforu-22调节光老化hacat细胞外基质/抗氧化相关基因表达实验
[0070]
1、gforu-22上清液制备：
[0071]
制备方法参照实施例3。
[0072]
2、hacat细胞制备及紫外线损伤
[0073]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
[0074]
3、gforu-22添加
[0075]
将上清液5％(v/v)分别加入刺激过的hacat细胞(对照组以等体积营养肉汤液体培养基替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0076]
4、qpcr法检测细胞外基质/抗氧化相关基因相对表达倍数
[0077]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因sptssa，以及抗氧化相关基因nrf2，降解细胞外基质相关基因p38mapk和mmp1的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0078]
公式：f＝2-δδct
，其中：
[0079]
δct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
[0080]
δct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
[0081]
δδct＝δct
实验-δct
对照
。
[0082]
上清液上调细胞外基质相关基因sptssa，抗氧化相关基因nrf2；下调降解细胞外基质相关基因p38mapk和mmp1。结果见表2：
[0083]
表2.gforu-22上清液调节细胞外基质/抗氧化相关基因的表达
[0084][0085]
结果显示加入gforu-22具有促进hacat细胞外基质合成、增加抗氧化和减少细胞外基质降解的抗衰老作用。
[0086]
实施例5 gforu-22调节氧化损伤hff细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因
子相关基因表达实验
[0087]
1、gforu-22上清液制备：
[0088]
制备方法参照实施例3。
[0089]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0090]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0091]
3、gforu-22添加
[0092]
将上清液5％(v/v)分别加入刺激过的hff细胞(对照组以等体积营养肉汤液体培养基替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0093]
4、qpcr法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因相对表达倍数
[0094]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因mkx，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2，抗氧化相关基因sirt-3，免疫调节因子相关基因mor；以及降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因caspase家族的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0095]
上清液上调细胞外基质相关基因mkx，抑制细胞凋亡基因bcl-2，抗氧化相关基因sirt-3，免疫调节因子相关基因mor；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因caspase家族。结果见表3：
[0096]
表3.gforu-22上清液调节细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因的表达
[0097][0098]
结果显示加入gforu-22具有促进hff细胞外基质合成、减少细胞凋亡、增加抗氧化、增加细胞免疫调节因子、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。
[0099]
实施例6 gforu-22抑制胶原蛋白酶活性实验
[0100]
1、gforu-22上清液制备：
[0101]
制备方法参照实施例3。
[0102]
2、胶原蛋白酶活性抑制率检测
[0103]
将50μl 0.2％的明胶(胶原蛋白)溶液和50μl 0.1mol/l ph 7.5tris-hcl(含50mmol/l cacl2)溶液混合，加入上清液25μl(对照组以等体积mrs替代上清液)，加入胶原
蛋白酶液25μl在37℃反应0.5h。终止反应后以茚三酮显色在593nm下测定各组胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。
[0104]
胶原蛋白活性抑制率计算公式及结果见表4：
[0105]
表4.gforu-22胶原蛋白酶抑制率
[0106][0107][0108]
结果显示gforu-22上清液抑制胶原蛋白酶活性的抗衰老作用。
[0109]
实施例7 gforu-22上调hacat抗菌肽相关基因表达实验
[0110]
1、gforu-22上清液制备：
[0111]
制备方法参照实施例3。
[0112]
2、hacat细胞制备
[0113]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0114]
3、gforu-22添加及lps刺激
[0115]
将上清液5％(v/v)分别加入培养过夜的hacat细胞中(对照组分别以等体积营养肉汤液体培养基替代上清液)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
[0116]
4、qpcr法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
[0117]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测s100a7、s100a7和ll-37基因的表达。以等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。结果见表5：
[0118]
表5.gforu-22上清液上调抗菌肽相关基因的表达
[0119][0120]
结果显示gforu-22上清液具有促进抗菌肽基因表达的作用。
[0121]
实施例8 gforu-22抑制限制马拉色菌的作用
[0122]
1、gforu-22上清液制备：
[0123]
挑取凝结芽孢杆菌gforu-22单菌落于营养肉汤液体培养基，37℃摇床培养16～18h，酶标仪检测并以营养肉汤液体培养基稀释调整od
600
＝2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。
[0124]
2、限制马拉色菌菌液制备：
[0125]
将限制马拉色菌(malassezia restricta)cicc 33081，挑取单菌落于麦芽汁液体培养基，30℃培养箱静置培养过夜，检测并以麦芽汁液体培养基稀释调整od
600
＝0.1。
[0126]
3、抑制限制马拉色菌实验
[0127]
将灭活上清液以添加量10％(v/v)加入病原菌菌液中，以添加等体积营养肉汤液体培养基为对照，30℃培养24h，检测菌液浓度(od
600
)并计算病原菌抑制率。
[0128]
计算公式及结果如表6：
[0129]
表6.gforu-22对限制马拉色菌的抑制作用
[0130][0131]
结果显示gforu-22上清液抑制限制马拉色菌生长增殖。
[0132]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。