流感病毒疫苗及其用途的制作方法

流感病毒疫苗及其用途
1.引言
2.本发明涉及医学领域。本文提供了甲型流感血凝素(ha)茎部结构域多肽，编码所述多肽的核酸，包含所述多肽、核酸的药物组合物，以及前述各项的使用方法。
3.本发明(至少部分)是根据由hhs授予的合同号hhso100201700018c在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。


背景技术：

4.流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸道疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重程度范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有大约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。这些感染大多数可以归因于携带h1或h3血凝素亚型的甲型流感病毒，而乙型流感病毒的贡献较小，因此在季节性疫苗中通常包括这些病毒的代表。当前的免疫实践依赖于对流行的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸还在当前疫苗预防发病和死亡的失效中起作用。另外，由源自动物宿主并重配以增加人-人传播的高毒力病毒株系引起大范围流行病的可能性也仍然对全球健康造成严重且现实的威胁。
5.流感病毒是属于正粘病毒科的包膜rna病毒。其基因组由八个单链rna区段组成，这些单链rna区段编码11种不同的蛋白：一种核蛋白(np)、三种聚合酶蛋白(pa、pb1和pb2)、两种基质蛋白(m1和m2)、三种非结构蛋白(ns1、ns2和pb1-f2)以及两种外部糖蛋白：血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。
6.甲型流感病毒在自然界中分布广泛，并且可以感染多种鸟类和哺乳动物。这些病毒是基于ha和na蛋白的抗原结构的差异来分类的，其不同组合代表独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为特定流感病毒株系。虽然所有已知亚型都可以在鸟类中发现，但是当前流行的人甲型流感亚型是h1n1和h3n2。甲型流感病毒的系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要的所谓系统发育组：尤其是在系统发育组1(组1病毒)中的h1、h2、h5和h9亚型，以及尤其是在系统发育组2(组2病毒)中的h3、h4和h7亚型。
7.乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内ha中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的谱系在人体中流行，以b/山形/16/88(也称为b/山形)和b/维多利亚/2/87(b/维多利亚)谱系为代表。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院治疗的严重疾病。
8.已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(ha)。血凝素或ha是一种三聚体糖蛋白，该三聚体糖蛋白锚定在病毒膜中并且具有双重功能：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒rna释放到靶细胞的细胞
溶质中。ha包括较大的头部结构域和较小的茎部结构域。茎部结构域通过c-末端跨膜结构域序列锚定在病毒膜中。该蛋白经翻译后切割，产生两个ha多肽：ha1和ha2(完整序列称为ha0)(图1a、图1b)。膜远端头部结构域主要源自ha1，而膜近端茎部结构域主要源自ha2。需要切割ha前体分子ha0来激活病毒的感染性，并且活化蛋白酶在宿主中的分布是流感病毒致病性的决定因素之一。哺乳动物和非致病性禽病毒的ha在细胞外切割，这限制了它们在宿主中向遇到适当蛋白酶的组织的扩散。另一方面，致病性病毒的ha被普遍存在的蛋白酶在细胞内切割，因此具有感染多种细胞类型并引起全身感染的能力。
9.季节性流感疫苗必须每年更新的原因是该病毒的变异性很大。在ha蛋白中，这种变异特别表现在头部结构域中，在头部结构域中，抗原性漂移和转变产生大量不同的变体。由于这也是免疫显性区域，因此大多数中和抗体都针对该结构域，并且这些抗体通过干扰受体结合而起作用。头部结构域的免疫显性和较大变异的组合解释了感染一个特定株系不会对其他株系产生免疫的原因：首次感染引发的抗体只能识别有限数量的与首次感染的病毒密切相关的株系。
10.近来，缺乏完整的流感血凝素球状头部结构域或其实质部分的流感血凝素茎部多肽已有描述，并且已经用于产生针对该茎部结构域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。据信，茎部多肽的表位的免疫原性低于球状头部结构域的高免疫原性区域，并且茎部多肽中不存在球状头部结构域可能允许发展针对茎部多肽的一个或多个表位的免疫应答(steel等人，2010)。因此，steel等人通过使a/波多黎各/8/1934(h1n1)和a/香港/1/1968(h3n2)株系的ha1结构域缺失氨基酸残基53至276，并通过用短的柔性连接序列gggg替换该缺失序列，产生了流感ha茎部多肽。小鼠接种h3 hk68构建体并未产生与组1 ha交叉反应的抗血清。另外，如wo 2013/079473中所解释，茎部多肽是不稳定的并且未采取正确的构象，这一点已被以前显示能与全长野生型ha茎部区域的保守表位结合的抗体缺乏结合所证明。
11.bommakanti等人(2010)描述了一种基于ha2的多肽，该多肽包含氨基酸残基330-501(ha2)、7-氨基酸接头(gsagsag)、ha1的氨基酸残基16-55、6-氨基酸接头gsagsa，随后是ha1的残基290-321，在ha1中具有突变v297t、i300e、y302t和c305t。该设计基于h3 ha(a/香港/1/1968)的序列。该多肽仅针对h3亚型(a/phil/2/82)内的另一种流感病毒株系而不针对h1亚型(a/pr/8/34)提供交叉保护作用。在bommakanti等人(2012)的最新论文中，描述了基于来自h1n1 a/波多黎各/8/1934(h1ha0ha6)的ha的茎部多肽。在这种多肽中，氨基酸残基48至288的等效物已经缺失，并且产生了突变i297t、v300t、i302n、c305s、f392d、f395t和l402d。基于h3和h1两者的多肽均在大肠杆菌(e.coli)中表达，因此缺乏作为天然存在的ha蛋白的一部分的聚糖。
12.corbett等人(2019)已经描述了展示在自组装铁蛋白纳米颗粒上的甲型流感病毒h3和h7 ha茎部三聚体，这些三聚体在小鼠中引起保护性、同亚型抗体。尽管具有免疫原性，但与铁蛋白融合的ha抗原也可能诱导针对载体纳米颗粒的不需要的应答，这可能导致在重复免疫后ha定向的免疫应答及其寿命的降低。此外，ha-铁蛋白融合蛋白的表达水平和纯化挑战可能会阻碍大量疫苗剂量的生产。而且，对靠近此类纳米颗粒表面的ha表位(诸如cr8020的结合位点)的可及性可能减少对这些有利的保守ha表面的免疫应答。
13.直到现在，流感仍然是一个重大的全球卫生负担，尽管传统的鸡蛋生长的全灭活流感病毒疫苗的技术在70多年前就已开发出来。流感病毒血凝素(ha)的恒定抗原漂移加上
针对可变ha头部结构域的免疫显性株系特异性抗体应答导致传统疫苗的有效性在10％至60％之间，并且需要对已获许可的疫苗中所含的病毒株系进行季节性更新。此外，目前的疫苗方法对大流行流感病毒株系的保护作用很小。
14.对更好的组2疫苗的需要是特别迫切的，因为在过去十年中针对h3n2的疫苗有效性平均仅有33％(ballia等人(2016))，最近的h3n2株系已经表现出增强的毒力(garten等人(2017))，并且h7病毒代表了来自非季节性株系的最大大流行威胁之一。
15.因此，需要一种刺激产生强大的广泛中和抗体应答并针对大量当前和将来的流感病毒株系(季节性和大流行)提供保护作用的安全有效的“通用”疫苗，尤其是针对系统发育组2中的一种或多种甲型流感病毒亚型提供保护作用以有效预防流感的疫苗。


技术实现要素：

16.本发明提供了源自组2流感血凝素(ha)的新型单体和多聚体，特别是三聚体多肽，这些多肽包含流感ha茎部结构域而缺乏球状头部区域，本文称为流感血凝素(ha)茎部多肽或微型ha。这些多肽当施用给受试者，特别是人类受试者时，诱导针对至少组2流感病毒的细胞和/或体液免疫应答。本发明的多肽是热稳定的，并且在膜远端头部结构域中存在的显性表位不存在的情况下将组2 ha分子的膜近端茎部的保守表位呈递给免疫系统。
17.因此，在本发明的ha茎部多肽中，ha0蛋白的一级序列的一部分(即构成头部结构域的部分)已缺失，而其余的氨基酸序列已直接重新连接或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(“接头”)而重新连接以恢复多肽链的连续性。通过引入使ha分子其余部分的天然3维结构稳定的特异性修饰来进一步修饰所得的氨基酸序列。
18.在第一方面，本发明涉及单体甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，这些多肽包含组2甲型流感病毒的ha的ha1结构域和ha2结构域，所述ha茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
19.(i)该ha1结构域中头部区域的缺失；
20.(ii)该ha2结构域中三聚化区域的修饰；
21.(iii)能够形成至少一个单体内半胱氨酸桥的至少两个半胱氨酸残基；
22.并且其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是w；
23.其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人(1981)的ha命名法的h3编号，其对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
24.在某些实施例中，本发明涉及包含ha1结构域和ha2结构域的组2甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，其中所述ha茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
25.(i)该ha1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从对应于位置50处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置302处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列；
26.(ii)该ha2结构域中三聚化区域的修饰，优选c-螺旋中三聚化区域的修饰，所述三聚化区域包含从对应于位置405处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置419处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列；
27.(iii)(能够)形成单体内二硫桥的在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置311的氨基酸处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置308的氨基酸位置处的
半胱氨酸与在对应于位置418的位置处的半胱氨酸的组合；
28.并且其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是w；
29.其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人(同上)的ha命名法的h3编号，其对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
30.根据本发明，令人惊讶地证实，本发明的新型组2流感ha茎部多肽可以高水平重组表达，在不存在另外的人工c-末端三聚化结构域的情况下在细胞培养物上清液中是三聚体的，和/或具有增加的解链温度，这表明更高的热稳定性。此外，本发明的组2 ha茎部多肽通过稳定地呈递与组2 ha诸如cr9114(如wo 2013/007770中所述)和/或cr8020(如wo 2010/130636中所述)结合的ha茎部结合抗体的表位来模拟全长组2 ha的茎部。
31.在第二方面，本发明涉及多聚体甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，该多肽包含至少两个如本文所述的ha茎部多肽单体。
32.在另一方面，本发明提供了编码组2流感ha茎部多肽的核酸分子。
33.在又一方面，本发明提供了包含编码流感ha茎部多肽的核酸的载体，尤其是重组腺病毒载体。
34.在另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中诱导针对组2流感ha的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用根据本发明的流感ha茎部多肽、核酸分子和/或载体。
35.在另一方面，本发明提供了药物组合物，这些药物组合物包含根据本发明的流感ha茎部多肽、核酸分子和/或载体，以及药学上可接受的载剂。
36.在另一方面，本发明提供了组2流感ha茎部多肽、编码所述流感ha茎部多肽的核酸分子，和/或包含所述核酸分子的载体，其用于诱导针对流感病毒的免疫应答，特别是用作预防由系统发育组2中的甲型流感病毒株系引起的疾病或病状的疫苗。
附图说明
37.图1.a.本发明多肽的示意总图(下图)；b.去除ha的头部区域产生本发明的茎部多肽(微型ha)；c.本发明的基于茎部的多肽单体(微型ha)的三维图示；d.本发明多肽(特别是多肽ufv180088)的示意图。
38.图2.a.通过octet(抗c-标签)测定的expi-cho培养物上清液的蛋白表达水平；b.对表达构建体180088的expi-cho细胞的培养物上清液的sec分析(左图)和对纯化的180088的sec-mals分析；c.通过elisa测定的mab cr9114与纯化的多肽的结合(ec
50
值)；d.通过差示扫描荧光测定法分析纯化的多肽的温度稳定性。
39.图3.表达本发明的几种茎部多肽的expi-293细胞的培养物上清液的sec图谱和洗脱分析。a.具有向野生型(wt)残基的回复突变的多肽的sec图谱；虚线是稳定化的无头微型ha参考(ufv180141)，黑线是向wt序列的突变微型ha；b.图a中sec图谱的洗脱时间(左)和三聚体峰高(右)；c.最小设计多肽的sec图谱和来自ufv180088的所选突变的逐步引入；虚线是最小设计微型ha参考(ufv180647)，黑线是突变微型ha；d.图c中sec图谱的洗脱时间和峰高。
40.图4.具有和不具有原聚体间(inter-protomeric)二硫桥的三聚体茎部多肽的稳定性。a.收获时expi293f细胞的培养物上清液(左图)和在4℃孵育一周后表达纯化多肽的expi-cho细胞的培养物上清液的sec分析，其中在位置398和408未引入(ufv180192)和引入
(ufv180141)半胱氨酸残基(如本图顶部的结构微型ha模型所示)；b.通过差示扫描荧光测定法测定的纯化的多肽的温度稳定性；c.在非还原和还原条件下对蛋白纯度的sds-page分析。如图所示，所引入的半胱氨酸形成原聚体间二硫桥并增加温度稳定性。
41.图5.a.通过对培养物上清液中由expi-293表达的多肽进行的alphalisa所测定的蛋白表达水平和抗体结合，这些多肽在位置355和482处不同。这些值通过alphalisa测定并归一化至参考值(ufv161333)；b.通过对培养物上清液中由expi-293表达的多肽进行的alphalisa所测定的蛋白表达、三聚体含量和抗体结合，这些多肽在位置380和432处发生突变。值归一化至参考值(ufv170991)；c.i.通过对培养物上清液中由expi-293表达的多肽进行的alphalisa所测定的蛋白表达、三聚体含量和抗体结合，这些多肽在位置435处发生突变。值归一化至参考值(ufv170611)；c.ii.通过octet(左图)和sec分析(右图)测定的在expi-cho培养物上清液中表达的构建体ufv171004(435n)和ufv171197(435r)的蛋白表达水平。纯化的多肽的体外表征(下图)：mab cr9114和mab ct149的结合(elisa，ec
50
值)和温度稳定性(差示扫描荧光测定法，tm
50
值以℃计)；d.通过对expi-cho培养物上清液的octet和sec分析测定的在位置388处发生突变的多肽的蛋白表达水平。
42.图6.ha头部结构域(ha1)去除的示意图。通过对培养物上清液中由expi-293细胞表达的多肽进行的alphalisa所测定的表达水平、三聚体含量和mab结合。将所有数据归一化至参考设计ufv161908(a)、ufv160653(b)和ufv160321(c)。a.在参考设计(ufv161908)中，将从位置46上的氨基酸开始直到并且包括位置306上的氨基酸的头部结构域部分去除，并且两个ha1末端通过人工“gpgs-接头”连接。显示了用于ha头部结构域去除(ha1向上应变)和ha1末端直接连接(即，在头部缺失后n-末端ha1区段与c-末端ha1区段的连接)的各种替代性切割位置。在构建体ufv170637(深灰色)中，与优选的构建体ufv180088、ufv180089和ufv180090相似，删除了从位置47处的氨基酸开始直到并且包括位置306处的氨基酸的头部结构域；b.去除ha头部结构域后ha1向上和/或向下应变的直接连接；c.借助源自头部结构域的同源接头序列连接ha1的n-末端和c-末端。所有构建体都具有从位置46处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列缺失。
43.图7.通过对培养物上清液中由expi-293表达的具有用于稳定b-环的突变的三聚体茎部多肽进行的alphalisa所测定的表达水平和mab结合。将所有数据归一化至参考设计ufv161686(a)、ufv161333(b、c)和ufv171187(d)；a.通过在位置401-403处引入糖基化基序以用于位置401处的n-连接的糖基化而优化和屏蔽b-环；b.通过点突变引入脯氨酸残基以稳定b-环；c.引入第二糖基化基序(用于位置393处的n-连接的糖基化)以进一步屏蔽b-环；d.将添加的n-连接的糖基化基序(在位置401和392或393处)与脯氨酸取代组合。通过octet(抗his2)测定的蛋白表达水平；e.表达多肽的expi-293细胞的培养物上清液的sec图谱显示，引入一个聚糖(ufv180208)或两个聚糖和两个脯氨酸(ufv180217)被很好地接受。对应于三聚体多肽的峰的保留时间和高度以灰色表示。
44.图8.expi-cho表达的三聚体茎部多肽的表达水平和mab结合，这些多肽在位置38处有和没有用于n-连接的聚糖的基序。a.通过octet(抗c-标签)测定的表达水平和通过elisa测定的抗体结合(ec
50
值)；b.ufv170282(实线)和ufv170278(虚线)的elisa稀释曲线。
45.图9.expi-293培养物上清液的分析，这些培养物上清液表达在所引入的原聚体内二硫桥的位置中具有变化的多肽。归一化至参考ufv160595的通过alphalisa测定的蛋白表
达和抗体结合。a.在参考构建体ufv160595中存在的位置附近引入替代性半胱氨酸；b.在第一二硫桥下方的区域中引入替代性第二二硫桥。
46.图10.expi-293培养物上清液的分析，这些培养物上清液表达在所引入的原聚体间二硫桥的位置中具有变化的多肽。归一化至参考ufv170051的通过alphalisa测定的蛋白表达和抗体结合。
47.图11.expi-293培养物上清液的分析，这些培养物上清液表达具有替代性c-末端截短(在ufv171272中的位置515处，并且逐步直至ufv171280中的位置499)的可溶性三聚体多肽变体。a.sec图谱，三聚体峰保留时间和高度以灰色表示；b.通过octet测定的多肽与广泛中和抗体cr9114和ct149的结合；显示了多肽与参考ufv170991(黑色)相比的相对k
on
值。
48.图12.具有在a-螺旋中从h3野生型(wt)向h1的残基取代的本发明多肽的体外表征。a.通过对含有所表达的多肽的expi-293细胞培养物上清液进行的alphalisa所测定的蛋白表达水平和抗体结合。将数值归一化至参考值(ufv161454)；b.通过octet(抗his2，左图)和sec-mals分析(右图)测定的三种独立的expi-cho培养物上清液的蛋白表达水平。纯化的多肽的体外表征(下图)：mab cr9114和ct149的结合(elisa，ec
50
值)和温度稳定性(差示扫描荧光测定法，tm
50
值)。
49.图13.对表达具有向h7 ha的茎部表面突变的三聚体茎部多肽的expi-293细胞的培养物上清液的分析。通过alphalisa测定的三聚体含量和抗体结合。将所有数据归一化至含有向h1的a-螺旋突变379和381的参考设计ufv172561(a)或在位置379和381处含有野生型h3 a-螺旋残基的参考设计ufv172562(b)。参考在sec图谱中以虚线表示。
50.图14.表达源自不同组2h3株系的多肽的expi-293细胞的培养物上清液的sec分析，这些株系含有用于生成可溶性三聚体茎部多肽的相关设计元件。a.含有组i设计元件并基于a/香港/1/1968、a/威斯康辛/67/05或a/新加坡/infimh/16/0019/2016的微型ha多肽的sec图谱(三聚体峰用
‘
t’表示)；b.在b-环中含有另外的稳定突变的多肽的sec图谱：设计i(虚线)、设计ii(灰色)和设计iii(黑色)元素。
51.图15.野生型h3 a/香港/1/1968(wt a/hk/1/1968)中和h3衍生的微型ha设计ufv180088、ufv180089和ufv180090中根据winter等人(1981)的h3编号的氨基酸位置编号。
52.图16.腺病毒(ad26.flu.004)驱动ufv180480(具有天然跨膜结构域的ufv18088)的表达和折叠。用a)ad26.空(10,000vp/细胞，阴性对照)和b)ad26.flu.004(5,000vp/细胞)对转导的mrc-5细胞进行facs分析。将转导的mrc-5细胞用cr9114抗体染色；c.用ad26.flu.004(5,000vp/细胞)或ad26.空(5,000vp/细胞)转导的mrc-5细胞裂解物的western印迹分析。作为阳性对照，上样ufv180088(200ng/泳道)。所有样品均在非还原(泳道1-3)或还原(泳道4-6)条件下运行。使用抗体cr9114检测所表达的微型ha。
53.图17.多肽ufv170278和ufv170282的体内表征，ufv170278是含有用于n-连接的糖基化的野生型基序38-nat-40的多肽，ufv170282是其中该聚糖基序被点突变t40i敲除的多肽。a.用本发明的多肽或pbs第三次免疫小鼠4周后的h3 a/香港/1/1968 fl ha茎部特异性抗体滴度。每组的水平线表示组中位数。b.左图：用本发明的指定多肽或pbs免疫的小鼠在h3n2 a/香港/1/1968攻击后的随访期中的存活比例；ufv170278上图，ufv170282下图。右图：用本发明的指定多肽或pbs免疫的小鼠在h3n2 a/香港/1/1968攻击后的随访期中的相对体重；ufv170278上图，ufv170282下图。相对于第0天来表示相对体重变化。通过计算曲线
下面积(auc)测定随访期间的累积体重减轻。误差线表示95％置信区间。
54.图18.本发明的多肽ufv180088、ufv180089和ufv180090在原初小鼠模型中的免疫原性的体内表征。a.用本发明的多肽或pbs免疫小鼠一次(1
×
)、两次(2
×
)或三次(3
×
)后的h3 a/香港/1/1968 fl ha茎部特异性抗体滴度。每组的水平线表示组中位数。b用本发明的多肽或pbs免疫小鼠一次(1
×
)、两次(2
×
)或三次(3
×
)后的fl ha h3 a/香港/1/1968、h3 a/德克萨斯/50/2012和h7 a/荷兰/219/2003抗体滴度。每组的水平线表示组中位数。虚线表示lloq，其中空心符号表示lloq处的值。
55.图19.本发明的多肽ufv180088、ufv180089和ufv180090在h3n2致死性原初小鼠模型中的体内表征。左图：用本发明的指定多肽或pbs免疫的小鼠在h3n2 a/香港/1/1968攻击后的随访期中的存活比例；ufv180088上图、ufv180089中图和ufv180090下图。右图：用本发明的指定多肽或pbs免疫的小鼠在h3n2 a/香港/1/1968攻击后的随访期中的相对体重。相对于第0天来表示相对体重变化。通过计算曲线下面积(auc)测定随访期间的累积体重减轻。误差线表示95％置信区间。h7n9致死性原初小鼠模型。
56.定义
57.以下给出如本发明中所用的术语的定义。
58.根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(像例如d-脯氨酸(脯氨酸的d-对映异构体))或非天然存在于蛋白中的任何变体(像例如正亮氨酸)。标准氨基酸可以基于它们的性质分成几种类别。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些性质对于蛋白结构和蛋白-蛋白相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊的性质，例如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其与多肽骨架形成循环；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表7示出了标准氨基酸的缩写和性质。
59.如本文所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“但不限于”。
60.如本文所用，术语“感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的入侵。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的一种感染。此类感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官传播到其他细胞、组织和/或器官。感染还可以是潜伏性感染，即其中病毒不复制的一种感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在或由于病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。
61.流感病毒典型地分为以下流感病毒类型：甲型、乙型和丙型。如本文所用，术语“流感病毒亚型”是指以血凝素(h)和神经氨酸苷酶(n)病毒表面蛋白的组合为特征的甲型流感病毒变体。根据本发明，流感病毒亚型可以用其h号表示，例如像“包含h3亚型的ha的流感病毒”、“h3亚型的流感病毒”或“h3流感”，或用h号和n号的组合表示，例如像“流感病毒亚型h3n2”或“h3n2”。术语“亚型”具体包括每种亚型中的所有个体“株系”，这些“株系”通常是由突变引起的并且显示出不同的致病性谱，包括天然分离株以及人造突变体或重配体等。此类株系还可以称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“株系”和“分离株”可以互换使用。人类流感病毒株系或分离株的当前命名法包括病毒的类型(属)(即甲型、乙型或丙型)、首次分离的地理位置、株系编号和分离年份，通常在括号中给出了ha和na的抗原
描述，例如a/莫斯科/10/00(h3n2)。非人类株系在命名法中还包括起源宿主。
62.这些甲型流感病毒亚型可以通过参考其系统发育组进一步分类。系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要组别：尤其是在系统发育组1(“组1”流感病毒)中的h1、h2、h5和h9亚型，以及尤其是在系统发育组2(“组2”流感病毒)中的h3、h4、h7和h10亚型。
63.如本文所用，术语“流感病毒疾病”或“流感”是指因流感病毒例如甲型或乙型流感病毒在受试者中的存在而引起的病理状况。如本文所用，术语“疾病”和“病症”可互换使用。在特定的实施例中，该术语是指由受试者感染流感病毒而引起的呼吸系统疾病。
64.如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括dna分子(例如cdna或基因组dna)和rna分子(例如mrna)以及使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物。核酸可以是单链或双链的。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以进行化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等))、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和经修饰的键(例如，α异头核酸等)。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针和pcr引物。
65.如本文所用，ha中氨基酸的编号基于h3编号，如winter等人(1981)所述。因此，氨基酸残基或氨基酸位置的编号是指全长h3 ha中的编号(尤其是，a/爱知/2/68中的氨基酸位置的编号)，如winter等人(1981)所述和在图2中所示。因此，编号基于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。该编号尤其是指seq id no:1中氨基酸位置的编号。例如，措词“在位置392处的氨基酸”或“对应于位置392处的氨基酸的氨基酸”(在本技术全篇中可互换使用)是指根据winter等人(1981)的h3编号在位置392处的氨基酸残基。注意，因为在本发明的多肽中ha1结构域的一部分(头部结构域)已经缺失，所以如本文所用的编号不一定是指本发明的ha茎部多肽中的氨基酸的实际位置，而是指所述氨基酸在全长ha分子(即，没有头部缺失)中的位置。技术人员还将理解的是，其他流感病毒株系和/或亚型以及本发明的茎部多肽中的等效氨基酸(即，对应于seq id no:1中特定位置处的氨基酸的氨基酸)可以通过序列比对来确定。
66.如本领域技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的聚合物。如本文所用，该术语可指通过共价酰胺键连接的单条多肽链。该术语还可指通过非共价相互作用如离子接触、氢键、范德华接触和疏水性接触缔合的多条多肽链。本领域技术人员将认识到，该术语包括已被修饰的多肽，例如通过翻译后加工如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，n-连接和o-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，s-棕榈酰化)修饰的多肽。
[0067]“ha茎部多肽”是指不含天然存在的(或野生型)血凝素(ha)的头部结构域的ha衍生多肽。
[0068]
如本文所用，术语“野生型”是指源自天然流行的流感病毒的ha。
具体实施方式
[0069]
流感病毒对全球公共卫生具有重大影响，造成每年数百万例的严重疾病、数千人死亡以及相当大的经济损失。当前的三价或四价流感疫苗会引发对疫苗株系和密切相关的分离株的有效中和抗体应答，但是很少扩展到亚型中更多不同的株系或其他亚型。另外，对适当的疫苗株系的选择呈现出许多挑战，并经常产生次优保护作用。此外，目前尚无法预测下一大流行病毒的亚型，包括其出现的时间和地点。
[0070]
血凝素(ha)是来自流感病毒的主要包膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶标。血凝素在进入过程中具有两种主要功能。首先，血凝素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附着于靶细胞表面。其次，在病毒胞吞作用后，血凝素随后触发病毒膜和内体膜融合，以将其基因组释放到靶细胞的细胞溶质中。ha包含约500个氨基酸的大胞外域，该胞外域被宿主来源的酶切割，生成2个仍通过二硫键连接的多肽(ha1和ha2)。大部分n-末端片段(ha1结构域，约320-330个氨基酸)形成膜远端球状“头部结构域”，该膜远端球状“头部结构域”含有受体结合位点和大多数被病毒中和抗体识别的决定子。较小的c-末端部分(ha2结构域，约180个氨基酸)形成茎状结构(茎部结构域)，该茎状结构将球状结构域锚定至细胞膜或病毒膜。亚型之间的序列同一性程度在ha1多肽(亚型之间的同一性为34％-59％)中比在ha2多肽(同一性为51％-80％)中小。最保守的区域是蛋白酶切割位点周围的序列，特别是ha2 n端的23个氨基酸，该序列在所有甲型流感病毒亚型中都是保守的(lorieau等人，2010)。此区域的一部分在ha前体分子(ha0)中以表面环的形式暴露，但是当ha0切割为ha1和ha2时变得无法接近。
[0071]
大多数中和抗体与围绕受体结合位点的环结合，从而干扰受体的结合和附着。由于这些环是高度可变的，因此靶向这些区域的大多数抗体具有株系特异性，从而解释了当前疫苗引发此类有限的株系特异性免疫的原因。生成了针对流感病毒血凝素的具有广泛交叉中和效力的全人单克隆抗体，诸如cr6261(wo 2008/028946)。功能和结构分析揭示，这些抗体会干扰膜融合过程，并针对组1流感ha蛋白茎部结构域中高度保守的表位(throsby等人,2008；ekiert等人2009,wo 2008/028946)。通过鉴定与许多组1和组2 ha分子交叉反应的cr9114(如wo 2013/007770中所述)，很明显人类免疫系统有可能引发针对流感病毒的非常广泛的中和抗体。然而，考虑到对每年接种方案的需要，这些抗体显然并不总是在感染或接种h1和/或h3亚型的(季节性)流感病毒后引起保护性水平。
[0072]
根据本发明，提供了新型ha茎部多肽，这些新型ha茎部多肽模拟例如抗体cr9114(包含seq id no:7的重链可变区和seq id no:8的轻链可变区)和/或cr8020(包含seq id no:5的重链可变区和seq id no:6的轻链可变区)的特异性表位。当单独地或与其他预防性和/或治疗性处理组合在体内施用时，本发明的多肽可用于引发流感病毒结合和/或中和抗体，优选地交叉结合和/或交叉中和抗体。所谓“交叉结合和/或交叉中和抗体”是指能够结合和/或中和至少两种，优选至少三种、四种或五种来自系统发育组2的甲型流感病毒的不同亚型的抗体，或能够结合和/或中和至少一种组1流感病毒和至少一种组2流感病毒的抗体。
[0073]
稳定地呈递这些抗体cr6261和/或cr9114的表位的流感ha茎部多肽先前已经在wo 2013/079473中进行了描述。这些ha茎部多肽中的至少一些能够稳定地呈递cr6261和/或cr9114的表位，并且经证实在小鼠中具有免疫原性。另外的能够稳定地呈递cr6261和/或
cr9114的表位的ha茎部结构域多肽在wo 2014/191435、wo 2016/005480和wo 2016/005482中进行了描述。这些茎部多肽基于组1甲型流感病毒的ha并且仅诱导针对组1甲型流感病毒的免疫应答。
[0074]
在导致本发明的研究中，已经显示当使用组2流感病毒的ha时，在组1 ha茎部多肽中引入的修饰并未导致稳定的三聚体茎部多肽。
[0075]
本发明现在提供了包含新修饰的组2流感ha茎部多肽，这些多肽可以在哺乳动物细胞中良好表达，是三聚体的(例如，通过alphalisa和sec测量)和热稳定的(例如，通过例如动态扫描荧光测定法/差示扫描量热法(dsf/dsc)测量)。此外，已显示本发明的组2茎部多肽在体内诱导中和抗体。此外，所有测试的广泛中和抗体(bnab)对本发明多肽的亲和力小于1nm(通过octet和elisa测量)，这与抗体对全长ha的亲和力相似，这清楚地表明这些多肽模拟天然全长ha的茎部。此外，新型ha茎部多肽可以包含但不需要任何人工接头、标签，也不需要n-或c-末端三聚化结构域。
[0076]
在第一方面，本发明因此提供单体甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，这些多肽包含组2甲型流感病毒的ha的ha1结构域和ha2结构域，所述ha茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
[0077]
(i)该ha1结构域中头部区域的缺失；
[0078]
(ii)该ha2结构域中三聚化区域的修饰；
[0079]
(iii)能够形成至少一个单体内半胱氨酸桥的至少两个半胱氨酸残基；
[0080]
并且其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是w；
[0081]
其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人的ha命名法的h3编号，其对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
[0082]
因此，本发明提供ha茎部多肽(即，无头ha多肽)，这些多肽包含ha2结构域中的三聚化区域的修饰，优选地c-螺旋中的修饰，以及形成单体内二硫桥的至少2个半胱氨酸残基；其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是w；并且其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人的ha命名法的h3编号，其基于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
[0083]
在某些实施例中，本发明提供单体甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，这些多肽包含组2甲型流感病毒的ha的ha1结构域和ha2结构域，所述ha茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
[0084]
(i)该ha1结构域中头部区域的缺失；
[0085]
(ii)该ha2结构域中三聚化区域的修饰；
[0086]
(iii)能够形成至少一个单体内半胱氨酸桥的至少两个半胱氨酸残基；
[0087]
并且其中这些多肽包含位置355处的氨基酸到w的突变；
[0088]
其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人的ha命名法的h3编号，其对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
[0089]
在某些实施例中，位置355处的氨基酸是w且位置432处的氨基酸是i，或位置355处的氨基酸是w且位置432处的氨基酸是i且位置380处的氨基酸是i。在某些实施例中，这些多肽包含位置355处的氨基酸到w的突变和位置432处的氨基酸到i的突变，或位置355处的氨基酸到w的突变和位置432处的氨基酸到i的突变和位置380处的氨基酸到i的突变。根据本
发明，已经显示这些氨基酸的存在增加本发明多肽的三聚体水平。
[0090]
在某些其他实施例中，位置355处的氨基酸是(突变成)w，位置378处的氨基酸是(突变成)t，位置379处的氨基酸是(突变成)n和/或位置381处的氨基酸是(突变成)v。已经显示这些氨基酸的存在增加广泛中和抗体的表达和结合。
[0091]
在某些实施例中，这些多肽进一步包含所引入的糖基化基序(nxt)，用于在位置401处的n-连接的糖基化以屏蔽b-环内的潜在新表位。因此，根据本发明，这些多肽在位置401-403处包含糖基化基序(nxt)，用于位置401处的n-连接的糖基化。
[0092]
在特定实施例中，本发明提供包含ha1结构域和ha2结构域的组2甲型流感血凝素(ha)茎部多肽，其中所述ha茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
[0093]
(i)该ha1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从对应于位置50处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置302处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列；
[0094]
(ii)该ha2结构域中三聚化区域的修饰，优选c-螺旋中三聚化区域的修饰，所述三聚化区域包含从对应于位置405处的氨基酸的氨基酸直到并且包括对应于位置419处的氨基酸的氨基酸的氨基酸序列；
[0095]
(iii)在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置311的氨基酸处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置308的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置418的位置处的半胱氨酸的组合，所述半胱氨酸残基(能够)形成单体内二硫桥；其中在该氨基酸序列中位置355处的氨基酸是w；并且其中ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人(同上)的ha命名法的h3编号，其基于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号。
[0096]
根据本发明，令人惊讶地发现，与先前生成的组2 ha茎部多肽相比，具有其中位置355处的氨基酸是w的氨基酸序列的组2流感ha茎部多肽在哺乳动物细胞中显示出高表达水平，具有增加的三聚化倾向和/或增加的热稳定性。此外，本发明的ha茎部多肽在体内诱导针对组2流感病毒的体液和/或细胞免疫应答。
[0097]
如本领域技术人员已知的，全长流感血凝素(ha0)典型地包含hal结构域和ha2结构域。此外，全长流感血凝素(ha0)典型地包含茎部结构域和头部结构域。茎部结构域由hal结构域的两个区段和大部分或整个ha2结构域形成。在一级序列中，hal结构域的两个片段被球状头部结构域隔开。如本文所述，与野生型全长ha多肽(ha0)的氨基酸序列，尤其是组2 ha的氨基酸序列相比，本发明的ha茎部多肽包含的氨基酸序列在ha1和/或ha2结构域中包含若干修饰。如本技术通篇所用，ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是根据winter等人(同上)的ha命名法的h3编号(即，对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号)。
[0098]
根据本发明，流感ha多肽的ha1结构域中的至少一部分高度可变的免疫显性头部已从全长ha(ha0)蛋白的ha1结构域中缺失以产生也称为“微型ha”的茎部多肽，所述部分至少包含从位置50处的氨基酸开始直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列。ha1结构域的剩余部分(即，ha1结构域的n-末端区段和ha1结构域的c-末端区段)直接(即，没有接头)或通过1至10个氨基酸的接头连接。因此，例如，当从位置50处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列缺失时，位置49处的氨基酸(n-末端ha1区段的最后一个氨
基酸)与位置303处的氨基酸(c-末端ha1区段的第一个氨基酸)直接连接，或通过用1至10个氨基酸的接头替换缺失的头部区域而连接。从位置50处的氨基酸直到并且包括位置302处的氨基酸的氨基酸序列的缺失是ha1结构域中的最小缺失。根据本发明，还可以缺失ha1结构域的较大部分，例如，从位置47处的氨基酸开始直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列，如图1a所示，下面的构建体。
[0099]
在一个优选的实施例中，ha1结构域中的缺失至少包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。在该实施例中，茎部多肽因此包含直到并且包括位置46处的氨基酸的n-末端ha1区段，以及从位置307处的氨基酸开始的c-末端ha1区段(图1a中的深灰色部分)。
[0100]
在一个优选的实施例中，ha1结构域中的缺失由从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列组成。
[0101]
在一些实施例中，ha1结构域中的缺失已被1至10个氨基酸的连接序列替换。
[0102]
另外，如本文所述，本发明的ha茎部多肽包含ha2结构域中三聚化区域的修饰，优选c-螺旋中的修饰，以在头部区域缺失之后改善ha茎部多肽的三聚化。在某些优选的实施例中，ha2结构域中的所述修饰是增强ha茎部多肽三聚化的修饰。
[0103]
在某些实施例中，所述修饰包括在c-螺旋中引入异源三聚化结构域。通常应理解，c-螺旋包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置434处的氨基酸的氨基酸序列(h3编号)。在一个优选的实施例中，所述异源三聚化结构域已经在与从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸的氨基酸序列相对应的位置处引入(图1a)。因此，在某些实施例中，ha2结构域中从位置405直到位置419的原始(wt)氨基酸序列已被相同长度(即具有相同数目的氨基酸)的异源三聚序列替换。
[0104]
在某些实施例中，异源三聚化结构域是gcn4序列。
[0105]
在某些优选的实施例中，经修饰的三聚化区域(即，包含异源三聚化结构域)包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
[0106]
405
rmkqiedkieeiesk
419
(seq id no:9)和
405
pmkqiedkieeiesk
419
(seq id no:10)。
[0107]
在一些实施例中，异源三聚序列的至少一个氨基酸已突变成c，使得能够形成单体间半胱氨酸桥(如下所述)。因此，在某些优选的实施例中，三聚化区域因此包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
[0108]
405
rmkciedkieeiesk
419
(seq id no:11)和
405
pmkciedkieeiesk
419
(seq id no:12)。在优选的实施例中，三聚化区域由氨基酸序列
405
pmkciedkieeiesk
419
(seq id no:12)组成。
[0109]
在某些实施例中，修饰包括对c-螺旋中，优选三聚化区域中的七肽重复序列的改变，优选优化，该七肽重复序列包含从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸的氨基酸序列。表示为[abcdefg]n的七肽重复序列典型地在a和d处具有疏水性残基，并且在e和g处具有极性/带电荷的残基。这些基序是大多数卷曲螺旋结构的基础，卷曲螺旋结构是蛋白中的结构基序，其中α-螺旋像绳的各股一样卷绕在一起(二聚体和三聚体是最常见的类型)(ciani等人，2010)。
[0110]
作为进一步的修饰，根据本发明的ha茎部多肽包含至少两个(能够)形成单体内(或原聚体内)半胱氨酸(或二硫)桥的半胱氨酸残基。可以通过使至少一个残基(如果另一个已经是半胱氨酸)突变，但通常是通过使空间上靠近的两个残基突变成半胱氨酸来引入
工程化半胱氨酸桥，半胱氨酸将自发地或通过主动氧化在这些残基的硫原子之间形成共价键。在一个优选的实施例中，这些多肽包含位置310处的半胱氨酸和位置422处的半胱氨酸，或在对应于位置311的氨基酸处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合；或在对应于位置308的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置418的位置处的半胱氨酸的组合，从而使得能够形成单体内半胱氨酸桥。在某些实施例中，这些多肽包含在对应于位置310和/或422的位置处向c的氨基酸突变，或在位置311和/或422处向c的氨基酸突变，或在对应于位置308和/或418的氨基酸位置处向c的氨基酸突变，所述半胱氨酸残基产生所述单体内半胱氨酸桥。因此，这些半胱氨酸残基形成使蛋白稳定的单体内(或原聚体内)半胱氨酸(或二硫)桥。在一个优选的实施例中，这些多肽在位置310处包含(突变成)半胱氨酸和在位置422处包含(突变成)半胱氨酸，从而形成至少一个单体内半胱氨酸桥。
[0111]
根据本发明的多肽典型地包含至少4个用于n-连接的糖基化的天然(即天然存在的)糖基化(或聚糖)基序(nxt)，例如在以下位置处的聚糖基序：位置8-10(8nst
10
)、位置22-24(
22
ngt
24
)、位置38-40(
38
nat
40
)和位置483-485(
483
ngt
485
)。在某些实施例中，这些多肽在位置401-403处包含至少一个引入的聚糖基序，用于位置401处的n-连接的糖基化，如上所述。在某些实施例中，多肽包含至少一个另外的引入的糖基化基序。因此，在某些实施例中，在位置392-394处存在和/或引入至少一个另外的n-连接的糖基化基序用于位置392处的n-连接的糖基化，和/或在位置393-395处存在和/或引入至少一个另外的n-连接的糖基化基序用于位置393处的n-连接的糖基化。在一个优选的实施例中，这些多肽在位置401-403处包含糖基化基序用于位置401处的n-连接的糖基化以及在位置393-395处包含糖基化基序用于位置393处的n-连接的糖基化。
[0112]
在进一步的实施例中，在对应于位置388的位置处的氨基酸是m。在某些实施例中，在对应于位置388的位置处的氨基酸突变成m。然而，在该位置处的其他氨基酸也是可能的，包括但不限于t、v、i、l、f、y、w、h、k和r。
[0113]
此外，在某些实施例中，这些多肽包含氨基酸序列，其中：
[0114]-位置31处的氨基酸是e且位置34处的氨基酸是v；
[0115]-位置392处的氨基酸是s或p；
[0116]-位置395处的氨基酸是t或p；
[0117]-位置399处的氨基酸是s或p；
[0118]-位置435处的氨基酸是n或r；和/或
[0119]-位置439处的氨基酸是y。
[0120]
因此，在某些实施例中，位置31处的氨基酸是e且位置34处的氨基酸是v。在某些实施例中，这些多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含在位置31处向e的氨基酸突变和在位置34处向v的氨基酸突变。根据本发明，已经发现这些氨基酸残基(即，31e和34v)的存在优化氢键网络，这是本发明的多肽的稳定性的重要贡献因素。这些多肽可以进一步包含如下氨基酸序列，其中位置392处的氨基酸是(突变成)s或p；位置395处的氨基酸是(突变成)t或p；和/或位置399处的氨基酸是(突变成)s或p。因此，本发明的多肽可以在所谓的b-环中包含一个或多个突变，该b-环包含从位置385处的氨基酸开始直到并且包括位置404处的氨基酸的氨基酸序列(参见图1c)。b-环突变通过降低疏水性增加多肽的溶解性。在某些优选的实施例中，与野生型ha多肽相比，这些多肽因此在b-环中包含至少一种选自由以下项组成
的组的另外突变：
[0121]-对应于位置392处的氨基酸的氨基酸突变成s或p，优选突变成s；
[0122]-对应于位置395处的氨基酸的氨基酸突变成t或p；优选突变成t；以及
[0123]-对应于位置399处的氨基酸的氨基酸突变成s或p，优选突变成p。
[0124]
这些多肽可以进一步包含对应于位置435处的氨基酸的氨基酸突变成n或r，优选突变成n；和/或对应于位置439处的氨基酸的氨基酸突变成y。这些突变被认为优化了有助于溶液中的三聚体稳定性的三聚体界面。
[0125]
再次值得注意的是，如本文所用，氨基酸位置的编号基于根据winter等人(1981)的h3编号。还要再次注意的是，如本文所用的氨基酸位置的编号基于全长h3 ha多肽(ha0)中的位置编号。因此，如本文所用，“位置434处的氨基酸”是指h3 ha0中位置434处的氨基酸。因此，由于头部结构域的缺失，该编号不是指本发明的ha茎部多肽中氨基酸的实际位置(参见图15)。
[0126]
根据本发明，ha茎部多肽是组2 ha多肽。因此，根据本发明，本文所述的修饰已被引入来自系统发育组2的流感病毒(诸如包含h3、h7或h10亚型的ha的流感病毒)的ha中，从而产生了本发明的ha茎部多肽。在某些实施例中，ha茎部多肽是h3 ha多肽。因此，在某些实施例中，ha茎部多肽源自包含h3亚型的ha的甲型流感病毒的ha，诸如源自以下流感病毒：具有氨基酸序列seq id no:2的a/香港/1/68，或具有氨基酸序列seq id no:13的a/威斯康辛/67/2005，或具有氨基酸序列seq id no:14的a/新加坡/infmh/16/0019/2016。技术人员将理解，本发明的多肽还可以源自其他h3甲型流感病毒株系的ha，包括但不限于a/珀斯/16/2009(seq id no:15)、a/布里斯班/10/2007(seq id no:16)或a/巴拿马/2007/1999(seq id no:17)。
[0127]
如上所述，茎部多肽可以包含或不包含替换缺失的ha1头部序列从而连接两个剩余的ha1部分的1-10个氨基酸残基的连接序列。在某些实施例中，连接序列包含1至5个氨基酸。在某些实施例中，连接序列包含2、3或4个氨基酸。连接序列可以是异源连接序列，即，在天然存在的或野生型ha中不存在的氨基酸序列，诸如但不限于gggg和gpsg。
[0128]
在某些实施例中，连接序列是同源连接序列，即，源自缺失的相应头部区域的氨基酸序列，诸如但不限于nphr、gdph、nggs、ggsn、gsna、gpgs、gsgf、gsg、gg、ggs、sgs、hpst、ipni、glss、kpgd、dapi、tpn和tpng。
[0129]
在优选的实施例中，多肽不含连接序列。
[0130]
如上所述，流感ha0蛋白(在ha1和ha2中)的切割是其活性所必需的，通过引起宿主内体膜与病毒膜的融合而促进病毒基因组进入靶细胞。
[0131]
在某些实施例中，本发明的多肽包含天然蛋白酶切割位点。因此，已知跨越ha1和ha2的arg(r)-gly(g)序列(即氨基酸位置329和330)是胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点，并且典型地被切割以激活血凝素(图1a)。
[0132]
在某些实施例中，多肽不含蛋白酶切割位点。因此，在某些优选的实施例中，通过使位置329处的氨基酸残基突变成除精氨酸(r)或赖氨酸(k)以外的任何氨基酸，去除了蛋白酶切割位点。在某些实施例中，位置329处的氨基酸残基不是精氨酸(r)。在一个优选的实施例中，多肽包含位置329处的氨基酸到谷氨酰胺(q)的突变。因此，在某些优选的实施例中，本发明的多肽包含切割位点敲除突变r329q，以防止在施用后体外或体内产生期间对分
子的推定切割。
[0133]
在其他实施例中，多肽包含多元切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点。因此，多肽可以在细胞内被弗林蛋白酶样蛋白酶切割以产生经切割的微型ha，类似于天然折叠并加工的ha。
[0134]
在某些实施例中，多肽不含信号序列。信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是存在于预定进入分泌途径的大部分新合成的蛋白的n端的短肽(通常长度为16至30个氨基酸)。信号序列的作用是促使细胞将蛋白易位，通常易位至细胞膜。在许多情况下，包含信号肽的氨基酸一旦达到其最终目的地，就会从蛋白上切割下来。在流感ha中，信号序列典型地包含全长ha0的氨基酸序列的前16个氨基酸(对应于根据h3编号从位置-6到位置10的氨基酸，参见图15)。
[0135]
在某些实施例中，多肽包含信号序列(的一部分)。多肽可以包含野生型信号序列(的一部分)或者可以包含替代性信号序列的(一部分)，诸如但不限于选自由以下项组成的组的信号序列：
[0136]
mktiialsyifclalg(seq id no:18)；
[0137]
mktiialsyilclvfa(seq id no:19)；
[0138]
mktiialsyilclvft(seq id no:20)；以及
[0139]
mktivalsyilclvfa(seq id no:21)。
[0140]
在优选的实施例中，(可溶性)多肽不含信号序列。
[0141]
在一个优选的实施例中，本发明的多肽包含：
[0142]
(i)ha1结构域中头部区域的缺失，所述缺失由从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列组成，其中位置46处的氨基酸直接连接至位置307处的氨基酸；
[0143]
(ii)异源三聚化结构域的引入，该异源三聚化结构域包含氨基酸序列
405
pmkciedkieeiesk
419
(seq id no:12)，该氨基酸序列将原始氨基酸序列从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸进行替换；
[0144]
(iii)在对应于位置310处的氨基酸位置处的(突变成)半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的(突变成)半胱氨酸的组合；
[0145]
(iv)在以下位置处引入的糖基化基序：393-395(即，
393
nqt
395
)和401-403(即，
401
nat
403
)；
[0146]
并且其中，此外在该氨基酸序列中：
[0147]
(a)位置355处的氨基酸是(突变成)w；
[0148]
(b)位置432处的氨基酸是(突变成)i且位置380处的氨基酸是(突变成)i；
[0149]
(c)位置378处的氨基酸是(突变成)t且位置379处的氨基酸是(突变成)n和/或位置381处的氨基酸是(突变成)v；
[0150]
(d)位置388处的氨基酸是(突变成)m；
[0151]
(e)位置31处的氨基酸是(突变成)e且位置34处的氨基酸是(突变成)v；
[0152]
(f)位置392处的氨基酸是(突变成)s；
[0153]
(g)位置395处的氨基酸是(突变成)t；
[0154]
(h)位置398处的氨基酸是(突变成)c；
[0155]
(i)位置399处的氨基酸是(突变成)p；
[0156]
(j)位置408处的氨基酸是(突变成)c；
[0157]
(k)位置435处的氨基酸是(突变成)n；
[0158]
(l)位置439处的氨基酸是(突变成)y；以及
[0159]
(m)位置329处的氨基酸是(突变成)q；
[0160]
其中该ha茎部多肽氨基酸序列中的氨基酸位置的编号是对应于参考株系h3n2 a/爱知/2/68(seq id no:1)的全长ha编号的h3编号。
[0161]
在特定的实施例中，ha1结构域和ha2结构域来自包含h3亚型的ha的流感病毒，优选地来自甲型流感病毒/香港/1/68。
[0162]
在某些优选的实施例中，ha1结构域和ha2结构域来自包含h3亚型的ha的流感病毒，优选地来自甲型流感病毒/香港/1/68，其中所述h3 ha1结构域和ha2结构域中的一个或多个氨基酸已经突变成h7 ha的相应氨基酸。
[0163]
因此，在某些实施例中，ha1结构域和ha2结构域来自包含h3亚型的ha的流感病毒，优选地来自权利要求19的甲型流感病毒/香港/1/68，其中：
[0164]
(a)位置25处的氨基酸是(突变成)k；
[0165]
(b)位置367处的氨基酸是(突变成)y；
[0166]
(c)位置378处的氨基酸是(突变成)t；
[0167]
(d)位置475处的氨基酸是(突变成)d；
[0168]
(e)位置476处的氨基酸是(突变成)d；和/或
[0169]
(f)位置479处的氨基酸是(突变成)a。
[0170]
尽管不希望受到理论的束缚，但是据信，通过将具有所需特性(诸如表达、折叠和热稳定性)的稳定的h3衍生的茎部多肽表面重修为h7 ha，可以诱导出对更远的h7病毒可能更有保护作用的抗体应答，而不必完全转换为表现较差的h7衍生的茎部多肽，即，其更难以制造、具有较低的表达水平和较低的稳定性。
[0171]
在某些实施例中，这些多肽包含ha2结构域，该结构域包括跨膜(tm)和胞质(cd)结构域(所述tm和cd结构域包含对应于下述氨基酸序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列从对应于位置514处的氨基酸的氨基酸开始直到并且包括对应于位置550处的氨基酸的氨基酸(h3编号))。因此，提供了膜结合的微型ha多肽。
[0172]
为了产生分泌的可溶性茎部多肽，在某些实施例中，多肽不含跨膜和细胞质结构域。因此，在某些实施例中，多肽包含截短的ha2结构域，尤其是在c-末端处截短的ha2结构域。因此，根据本发明的截短的ha2结构域因缺失在ha2结构域c末端处的一个或多个氨基酸残基而比全长ha2序列短。
[0173]
在某些实施例中，从对应于位置514处的氨基酸的氨基酸开始的ha2结构域的c-末端部分已缺失，从而基本上去除了整个跨膜和胞质结构域。
[0174]
在某些实施例中，c-末端螺旋的一部分也已缺失。根据本发明，已经发现，即使当ha2结构域的较大部分缺失时，也可以提供稳定的可溶性ha茎部多肽。因此，在某些实施例中，从氨基酸位置500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513或514处开始的ha2结构域的c-末端部分已经缺失(再次根据如winter等人(同上)所述的h3编号进行编号)，以在细胞中表达后产生可溶性多肽。
[0175]
在一个优选的实施例中，从对应于506的位置开始的ha2结构域的c-末端部分已经缺失。
[0176]
任选地，异源氨基酸序列(即，在流感ha中不天然存在的氨基酸序列)可以与(截短的)ha2结构域连接。
[0177]
因此，在某些实施例中，his-标签序列，例如hhhhhh(seq id no:22)或hhhhhhh(seq id no:23)，或flag标签dykddddk(seq id no:24)，或c-标签epea(seq id no:25)，或这些的组合，已经连接到(任选截短的)ha2结构域的c-末端氨基酸以用于检测和/或纯化目的。在某些实施例中，异源氨基酸序列如his标签序列可以通过接头与(截短的)ha2结构域连接。在某些实施例中，接头可含有蛋白水解切割位点(的一部分)，例如氨基酸序列iegr(seq id no:26)或lvprgs(seq id no:27)，以在纯化后酶促去除his-标签序列。
[0178]
在某些实施例中，与(截短的)ha2结构域的c-末端氨基酸连接的异源氨基酸序列包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
[0179][0180][0181][0182][0183][0184][0185][0186][0186]
和
[0187][0188]
在某些实施例中，异源三聚化结构域已连接至(任选截短的)ha2结构域的c-末端氨基酸，诸如但不限于“foldon”三聚化结构域(如letarov等人(1993)；s-guthe等人(2004)所述)。
[0189]
在某些实施例中，本发明的ha茎部多肽包含选自seq id no:40-44、46-64、66、67、69-97、156-164、169-181和189-212的氨基酸序列。
[0190]
在优选的实施例中，多肽包含选自seq id no:40-42、207和210-212的氨基酸序列，优选选自210-212的氨基酸序列，更优选seq id no:210。
[0191]
在某些实施例中，当在合适的细胞(例如哺乳动物细胞)中表达时，多肽被糖基化。如上所述，本发明的多肽典型地包含4个天然糖基化基序(nxt)。也如上所述，根据本发明，在某些实施例中，多肽在位置401-403处包含至少一个引入的糖基化基序，用于位置401处的n-连接的糖基化。这些多肽优选地在位置393-395处包含另外的引入的糖基化基序，用于位置393处的n-连接的糖基化。
[0192]
在另一方面，本发明提供了多聚体，优选三聚体ha茎部多肽。为了获得稳定的三聚体ha茎部多肽，本发明的多肽优选地包含至少两个(能够)形成单体间(也称为原聚体间)半胱氨酸桥的半胱氨酸残基。因此，在某些实施例中，这些多肽包含在对应于位置396的位置处的半胱氨酸与在对应于位置408的位置处的半胱氨酸的组合，或在对应于位置397的位置处的半胱氨酸与在对应于位置408的位置处的半胱氨酸的组合，或在对应于位置398的位置处的半胱氨酸与在对应于位置408的位置处的半胱氨酸的组合，或在对应于位置398的位置处的半胱氨酸与在对应于位置405的位置处的半胱氨酸的组合。
[0193]
在某些实施例中，多肽包含位置396处的氨基酸到c的突变和位置408处的氨基酸到c的突变；或位置397处的氨基酸到c的突变和位置408处的氨基酸到c的突变；或位置398处的氨基酸到c的突变和位置408处的氨基酸到c的突变；或位置398处的氨基酸到c的突变和位置405处的氨基酸到c的突变；从而在以下半胱氨酸之间产生单体间半胱氨酸桥：在第一单体的位置396处的半胱氨酸与第二单体的位置408处的半胱氨酸之间；或在第一单体的位置397处的半胱氨酸与第二单体的位置408处的半胱氨酸之间；或在第一单体的位置398处的半胱氨酸与第二单体的位置408处的半胱氨酸之间形成单体间半胱氨酸桥；或在第一单体的位置398处的半胱氨酸与第二单体的位置405处的半胱氨酸之间。注意，在一些实施例中，位置405或408处的氨基酸在异源三聚序列内。
[0194]
在一个优选的实施例中，多肽在位置398处包含半胱氨酸并且在位置408处包含半胱氨酸，从而在第一单体的位置398处的半胱氨酸与第二单体的位置408处的氨基酸之间形成单体间半胱氨酸桥。
[0195]
本发明还提供了编码本发明的流感ha茎部多肽的核酸分子。本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术产生不影响由所描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码
氨基酸序列的核酸分子”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
[0196]
在某些实施例中，对编码流感ha茎部多肽的核酸分子进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞如人细胞中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已经描述(例如wo 96/09378)。
[0197]
在某些实施例中，编码流感ha茎部多肽的核酸分子包含选自seq id no:208和seq id no:209的核酸序列。
[0198]
流感血凝素茎部结构域多肽可以根据认为适合技术人员的任何技术(包括以下描述的技术)来制备。因此，本发明的多肽可以通过本领域已知的标准方法合成为dna序列，并使用合适的限制酶和本领域已知的方法克隆并随后在体外或体内表达。
[0199]
本发明还涉及包含编码本发明多肽的核酸分子的载体。因此，在某些实施例中，根据本发明的核酸分子是载体(例如质粒)的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且例如被设计为能够在原核和/或真核细胞中复制。所使用的载体可以是适合克隆dna并且可以用于转录目标核酸的任何载体。当使用宿主细胞时，优选载体是整合载体。替代性地，载体可以是游离复制载体。本领域技术人员能够选择适合的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列中。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，本领域技术人员熟知，能够驱动表达的序列可以与编码多肽的核酸序列功能性连接，从而产生可表达形式的编码蛋白或多肽的重组核酸分子。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子等，及其组合。这些应能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。本领域技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。目标核酸的表达可以从天然启动子或其衍生物开始或从完全异源的启动子开始(kaufman,2000)。在真核细胞中用于表达的一些熟知的并且常用的启动子包括源自病毒的启动子，如源自腺病毒的启动子，例如e1a启动子；源自巨细胞病毒(cmv)的启动子，如cmv立即早期(ie)启动子(本文称为cmv启动子)(例如可从pcdna获得，英杰(invitrogen))；源自猿猴病毒40(sv40)的启动子(das等人,1985)等等。合适的启动子也可以源自真核细胞，如金属硫蛋白(mt)启动子、延伸因子1α(ef-1α)启动子(gill等人,2001)、泛素c或ub6启动子(gill等人,2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。对启动子功能和启动子强度的测试是本领域技术人员的常规工作，并且通常例如可以涵盖在启动子序列后克隆测试基因如lacz、荧光素酶、gfp等，并进行测试该测试基因的表达。当然，可以通过其中序列的缺失、添加、突变来改变启动子，并测试其功能性，以发现新的、减毒的或改良的启动子序列。根据本发明，优选在选择的真核细胞中产生高转录水平的强启动子。
[0200]
可以使用本领域技术人员熟知的方法将构建体转染到真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或合适的原核表达系统如大肠杆菌中。在一些情况下，可以将合适的“标签”序列(像例如但不限于his-、myc-、strep-、分选酶、c-或flag-标签)或完全蛋白(像例如但不限于麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽s转移酶)添加到如上所述的本发明的序列上，以允许从细胞或上清液中纯化和/或鉴定多肽。任选地，可以包含含有特定蛋白水解位点的序列，以便之后通过蛋白水解消化去除标签。
[0201]
在优选的实施例中，多肽在哺乳动物细胞中产生。
[0202]
可以通过本领域已知的光谱方法(例如，圆二色光谱法、傅立叶变换红外光谱法和nmr光谱法或x射线晶体学)分析纯化的多肽，以研究所需结构如螺旋和β折叠的存在。elisa、alphalisa、无标记生物层干涉测定法(octet)和facs等可用于研究本发明的多肽与广泛中和抗体诸如cr8020和/或cr9114的结合。因此，可以选择具有正确构象的根据本发明的多肽。可以例如通过在非还原条件下使用sds凝胶电泳、在广泛中和抗体如cr8020和/或cr9114的抗体fab片段的存在下使用尺寸排阻色谱法，以及使用不同标记抗体的alphalisa来分析三聚体含量。可以如上所述在温度应力、冻融循环、增加的蛋白浓度或搅动之后评估多肽的稳定性。可以通过差示扫描荧光法(dsf)和/或差示扫描量热法(dsc)进一步评估多肽的解链温度。
[0203]
在某些实施例中，核酸插入可用作疫苗组分的重组载体中。优选地，重组载体是人腺病毒，例如血清型26的人腺病毒(ad26)。因此，本发明还提供了重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体包含编码根据本发明的ha茎部多肽的核酸分子。在优选的实施例中，编码茎部多肽的核酸分子包含选自由seq id no:208和seq id no:209组成的组的核酸序列。
[0204]
重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。如本文所用，针对腺病毒的术语“重组”暗示它已被人工修饰，例如其具有在其中以保持活性地克隆的经改变的末端和/或其包含异源基因，即它不是天然存在的野生型腺病毒。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在腺病毒基因组的e1区域(例如，e1a区域和/或e1b区域)的至少一种必需基因功能中是有缺陷的，e1区域属于病毒复制所必需的腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必需e3区域的至少部分上是有缺陷的。在某些实施例中，载体在e1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必需e3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述e1缺陷的，或e1、e3缺陷的腺病毒载体可以进一步在e4区域的至少一个必需基因和/或e2区域(例如，e2a区域和/或e2b区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法在本领域中是熟知的，并且在例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913中有所描述。
[0205]
在某些实施例中，腺病毒是血清型26或35的人腺病毒。
[0206]
本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的多肽、核酸和/或载体，以及药学上可接受的载剂。特别地，本发明涉及包含治疗有效量的本发明的多肽、核酸和/或载体的药物组合物。药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域熟知的(参见例如remington:the science and practice of pharmacy-22nd edition[雷明顿：药学科学与实践-第22版],loyd v.编著allen,医药出版社(pharmaceutical press)[2013]；pharmaceutical formulation development of peptides and proteins[肽和蛋白的药物制剂开发],s.frokjaer和l.hovgaard编著,泰勒-弗朗西斯出版社(taylor&francis)[2000]；remington:essentials of pharmaceutics[雷明顿：制药学精要],linda felton,医药出版社(pharmaceutical press)[2013]；以及handbook of pharmaceutical excipients[药物赋形剂手册],第3版,a.kibbe编著,医药出版社(pharmaceutical press)
[2000])。术语“载剂”是指与多肽、核酸和/或载体一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液及右旋糖和甘油水溶液可以例如用作液体载剂，特别是对于注射液而言。
[0207]
本发明的多肽或核酸分子还可以与纳米颗粒诸如聚合物、脂质体、病毒体、病毒样颗粒组合或缀合施用。多肽或核酸分子可以与纳米颗粒组合、包裹在纳米颗粒中或与纳米颗粒缀合(例如共价连接或吸附)。
[0208]
本发明还涉及用作药物的如本文所述的多肽、核酸和/或载体。
[0209]
本发明特别涉及如本文所述的多肽、核酸和/或载体用于诱导针对流感病毒，优选组2流感病毒的免疫应答。
[0210]
本发明还涉及在有需要的受试者中诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的多肽、核酸分子和/或载体。根据本发明的受试者优选是能够感染流感病毒或以其他方式可以从诱导免疫应答受益的哺乳动物，此类受试者例如是啮齿类动物(例如小鼠、白鼬)，或是家畜或农场动物，或是非人类灵长类动物，或是人。优选地，该受试者是人类受试者。
[0211]
在某些实施例中，本发明提供了诱导针对组2甲型流感病毒的免疫应答的方法。免疫应答可以包括体液(即诱导流感病毒中和抗体)和/或细胞免疫应答。在某些实施例中，本发明提供诱导针对组2流感病毒的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种亚型的免疫应答的方法。在某些实施例中，本发明提供了诱导针对包含h3亚型的ha的流感病毒的免疫应答的方法。
[0212]
在某些实施例中，诱导的免疫应答有效预防由组2甲型流感病毒引起的流感病毒感染，诸如包含h3亚型的ha的甲型流感病毒，和/或包含h7亚型的ha的甲型流感病毒。在某些实施例中，诱导的免疫应答有效预防由包含h3亚型的ha的甲型流感病毒引起的流感病毒感染。在某些实施例中，诱导的免疫应答有效预防由包含h3和h7亚型的ha的甲型流感病毒引起的流感病毒感染。
[0213]
本发明进一步涉及如本文所述的多肽、核酸和/或载体用作流感疫苗，特别是用作针对由组2流感病毒株系引起的流感的疫苗。
[0214]
在某些实施例中，本发明的多肽、核酸分子和/或载体与佐剂组合施用。可以在本发明的多肽、核酸分子和/或载体施用之前、同时或之后施用佐剂。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如mf59(参见，例如wo 90/14837)；皂苷配制品，例如像qs21和免疫刺激复合物(iscoms)(参见，例如us 5,057,540；wo 90/03184、wo 96/11711、wo 2004/004762、wo 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质a(mpl)、3-o-脱酰基化mpl(3dmpl)(任选地配制在脂质体中)、含cpg基序的寡核苷酸、adp-核糖基化细菌毒素或其突变体，诸如大肠杆菌热不稳定性肠毒素lt、霍乱毒素ct、百日咳毒素pt或破伤风类毒素tt、基质m或其组合。另外，可以使用已知的免疫增强技术，如将本发明的多肽与本领域已知的蛋白融合以增强免疫应答(例如破伤风类毒素、crm197、rctb、细菌鞭毛蛋白等)，或将这些多肽包括在病毒体中，或其组合。
[0215]
根据本发明的多肽、核酸分子和/或载体的施用可以使用标准的施用途径来进行。非限制性实例包括肠胃外施用，如静脉内、皮内、透皮、肌内、皮下等，或粘膜施用，例如鼻内、经口等。技术人员将能够确定施用根据本发明的多肽、核酸分子和/或载体以便诱导免
疫应答的各种可能性。
[0216]
在某些实施例中，多肽、核酸分子和/或载体施用一次以上，即以所谓的同源初免-加强方案进行施用。第二剂的施用可以例如在本发明的多肽、核酸分子和/或载体的第一剂施用后一周、在第一剂施用后两周、在第一剂施用后三周、在第一剂施用后一个月、在第一剂施用后六周、在第一剂施用后两个月、在第一剂施用后3个月或在第一剂施用后4个月或更久等直到在第一剂施用后数年进行。也可以将多肽、核酸辅助分子和/或载体施用两次以上，例如三次、四次等，以便在首次初免施用后再进行一次以上的加强施用。
[0217]
多肽、核酸分子和/或载体还可以在异源初免-加强方案中作为初免来施用或作为加强来施用。
[0218]
本发明进一步提供了在有需要的受试者中预防流感病毒疾病的方法，这些方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的多肽、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指多肽、核酸和/或载体有效预防、缓解和/或治疗因感染流感病毒而引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播或者抑制或减少与流感病毒感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所用，改善可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
[0219]
需要治疗的受试者包括已经患有因感染流感病毒而引起的病状的受试者，以及其中要预防感染流感病毒的那些受试者。因此，可以将本发明的多肽、核酸和/或载体施用于原初受试者，即，未患有因流感病毒感染引起的疾病或尚未感染流感病毒和当前尚未感染流感病毒的受试者，或施用于已经感染了流感病毒的受试者。
[0220]
在一个实施例中，预防可针对易受流感病毒感染的患者群体。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、免疫功能低下的受试者以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。
[0221]
本发明的多肽、核酸分子和/或载体可以与一种或多种其他活性剂如替代性流感疫苗、单克隆抗体、抗病毒剂、抗菌剂和/或免疫调节剂组合施用于受试者。一种或多种其他活性剂可有益于治疗和/或预防流感病毒疾病或者可改善与流感病毒疾病相关的症状或病症。在一些实施例中，一种或多种其他活性剂是止痛药、退烧药或缓解或协助呼吸的治疗剂。
[0222]
在以下实例和附图中进一步说明了本发明。这些实例并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
[0223]
实例
[0224]
实例1：基于ha茎部的多肽-本发明的优选多肽ufv180088、ufv 180089和ufv180090的结构和设计元件
[0225]
代表来自h3甲型流感病毒/香港/1/68的未切割流感病毒血凝素(ha0)的茎部(或茎干)的多肽ufv180088通过从ha1缺失(至少一部分)头部结构域，特别是包含从位置47处开始的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的区域而产生(图1a和图1b)。值得注意的是，对于本发明中氨基酸位置的编号，使用winter等人(同上)的h3编号。本发明的多肽(微型ha)的主要结构元件(包括a-螺旋、b-环以及c-螺旋、d-螺旋和e-螺旋)如图1c所示。
[0226]
当表达为可溶性胞外结构域时，本发明的多肽在最后一个螺旋(其终止于位置
499)之后在c-末端截短。ufv180088在位置506处被截短，即从位置506处的氨基酸开始的ha序列的c-末端部分缺失。
[0227]
通过将位置329处的天然一元切割位点氨基酸精氨酸(r)(即，ha1结构域的c-末端氨基酸，参见图1)突变成例如谷氨酰胺(q)，使得本实例中所述的本发明多肽ufv 180088对蛋白酶切割具有抗性。与天然全长ha相反，含有突变r329q的本发明的多肽不能再被切割，并且不能经历相关的将疏水性融合肽埋藏在蛋白内部的构象变化。
[0228]
头部结构域的去除使ha分子先前与水性溶剂隔绝的一部分暴露出来。为此，与来自a/香港/1/1968的亲本野生型全长ha相比，b-环中的几个氨基酸残基，即包含氨基酸385-404的区域(图1c)被突变，以稳定茎部多肽。特别地，位置388处的氨基酸突变成m，并且位置392处的氨基酸突变成s。
[0229]
此外，为了降低b-环的螺旋倾向，引入脯氨酸，特别是位置399处的脯氨酸。最后，为了屏蔽b-环内的潜在新表位，在b-环中引入一个或两个n-连接的糖基化基序(即nxt)，特别是位置393-395处的糖基化基序，用于位置393处的n-连接的糖基化，以及位置401-403处的糖基化基序，用于位置401处的n-连接的糖基化。
[0230]
此外，为了促进可溶性ha茎部衍生的多肽的稳定三聚化，在ha2结构域中，特别是c-螺旋中引入gcn4衍生的三聚化结构域序列
405
pmkciedkieeiesk
419
(seq id no:12)，从而将原始(即，野生型)氨基酸序列从位置405处的氨基酸直到并且包括位置419处的氨基酸进行替换。
[0231]
此外，在位置398和408处引入半胱氨酸(如果尚不存在的话)(注意，位置408位于所引入的gcn4序列中)，以在第一单体的位置398处的半胱氨酸与相邻单体的位置408处的半胱氨酸之间形成原聚体间二硫桥，从而将单体共价连接到三聚体茎部多肽。
[0232]
为了进一步稳定和增加多肽ufv180088的表达，以及确保与野生型全长ha的茎部相似的正确折叠，在多肽中引入另外的突变，特别是在位置31(d31e)、34(i34v)、310(k310c)、355(h355w)、378(n378t)、379(379n)、380(k380i)、381(l381v)、422(s422c)、432(e432i)、435(h435r)和439(l439y)处(图1d)。
[0233]
制备了多肽ufv180088的变体，即ufv 180089和ufv180090。与ufv180088相比，这些多肽包含另外的突变。因此，ufv180089包含另外的突变(与ufv180088相比)l367y、n475d、a476d和e479a。ufv180090包含另外的(与ufv 180088相比)突变l25k、l367y、a476d和e479a，而不含突变g379n和l381v。
[0234]
实例2：本发明的三聚体多肽的表达、纯化和体外表征
[0235]
哺乳动物细胞中的蛋白表达
[0236]
合成(金斯瑞(genscript))编码本发明多肽ufv180088、ufv180089和ufv180090(如实例1所述)的dna片段，并克隆到pcdna2004表达载体(具有增强的cmv启动子的公司内部的修饰的pcdna3质粒)中。通过使用expifectamine
tm
转染试剂(gibco，赛默飞世尔科技(thermofisher scientific))根据制造商的方案瞬时转染相应的工业级dna，在expicho
tm
表达培养基中培养的expicho悬浮细胞中产生多肽。根据制造商的方案，在转染后1天向细胞培养物中添加expifectamine cho增强子和expicho进料(gibco，赛默飞世尔科技)。在第7-11天之间收获含有分泌多肽的培养物上清液，并通过离心而澄清，然后经0.2μm瓶盖式过滤器(康宁(corning))过滤。
[0237]
蛋白纯化
[0238]
通过两步方案纯化多肽。首先，将收获和澄清的培养物上清液上样到hiscale 16/20柱(通用医疗(ge healthcare))上，该柱填充有亲和树脂(capture select)，该亲和树脂由固定在基于琼脂糖的珠粒(赛默飞世尔科技)上的c-标签特异性单结构域抗体组成。此树脂对c-标签是高度特异性的，c-标签是与多肽的c-末端融合的四残基酸性肽(e-p-e-a(seq id no:25))。在纯化前通过octet测定所收获的培养物上清液中所产生的多肽的量(参见段落：培养物上清液和纯化的蛋白分析)。使用含有2m mgcl2的tris缓冲液进行c-标记蛋白的洗脱。基于uv信号(a280)，合并洗脱级分并通过millex-gv 0.22μm滤膜(默克密理博(merck millipore))过滤。随后，将收集的洗脱峰施加到在运行缓冲液(20mm tris，150mm nacl，ph 7.8)中平衡的superdex 200pg 26/60柱(通用医疗)上以除去潜在的多聚体和/或单体蛋白杂质。合并三聚体级分，并通过分析型sec-mals评估纯度。
[0239]
培养物上清液和纯化的蛋白分析
[0240]
如上所述，在通过使用octet平台(佛特比奥(fort
é
bio))的生物层干涉测定法纯化之前，评估所收获的培养物上清液中表达的茎部多肽的水平。简言之，将captureselect
tm
生物素抗-c-标签缀合物(赛默飞世尔科技)固定在链霉亲和素(sa)生物传感器(佛特比奥)上，然后通过评估明确的参考批次的纯化同源多肽的稀释系列的结合移位来建立标准曲线。随后，测量含有本发明多肽的预稀释收获的培养物上清液(在动力学缓冲液(佛特比奥)中稀释10倍和30倍)的结合移位，并使用建立的标准曲线计算多肽的浓度。
[0241]
通过使用高效液相色谱(hplc)infinity 1260系列装置(安捷伦(agilent))的尺寸排阻色谱法-多角度光散射(sec-mals)分析来评估培养物上清液中的多肽和纯化的多肽的三聚体含量。使各40μg的纯化多肽在tsk凝胶g3000swxl柱(西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich))上运行(1ml/min)，并通过minidawn treos多角度光散射检测器和optilab t-rex差示折光计(怀雅特科技(wyatt technology))测量洗脱物质的摩尔质量。通过astra 6软件包(怀雅特科技)分析数据并从折射率信号得到分子量计算值。
[0242]
通过elisa(抗体结合的ec
50
值)评估本发明的纯化多肽的正确折叠。为此，以10nm的浓度包被茎部多肽，并与一系列稀释的单克隆抗体(mab)cr9114(如wo 2013/007770中所述)以70nm作为起始浓度一起孵育。通过与抗人fc hrp二抗(小鼠抗人igg，杰克逊免疫研究(jackson immunoresearch))一起孵育来确定抗体结合，并且通过添加pod底物来使其可视化。使用ensight
tm
多模式酶标仪(珀金埃尔默(perkinelmer))进行读数。使用spotfire套件(tibco软件公司(tibco software inc.))计算ec
50
值。
[0243]
通过差示扫描荧光测定法(dsf)经监测添加至6μg多肽溶液中的sypro橙染料(赛默飞世尔科技)的荧光发射，来确定经纯化多肽的热稳定性。随着温度从25℃逐渐升高到95℃(每小时60℃)，多肽去折叠并且荧光染料与暴露的疏水性残基结合，这导致了发射的特性改变。使用viia7实时pcr机(应用生物系统(applied biosystems))测量解链曲线，并通过spotfire套件(tibco软件公司)计算tm
50
值。tm
50
值表示50％的蛋白已经去折叠时的温度，并因此是多肽温度稳定性的量度。
[0244]
结果与结论
[0245]
在转染后第9天，在两个独立的70ml expicho转染物中测定多肽的表达水平和三聚体含量(图2a)。所有多肽表达良好。h3n2 a/香港/1/68衍生的多肽ufv180088以约700mg/
l培养物上清液的水平表达。多肽ufv180089和ufv180090，在设计上类似于多肽ufv180088并且包含表面氨基酸的进一步改变(即，改变表面以更接近地类似于h7 ha)：l367y、n475d、a476d和e479a以及改变l25k、l367y、n379g、v381l、a476d和e479a，分别以约500mg/l和约350mg/l的水平表达。
[0246]
通过分析型sec分析粗细胞培养物上清液(图2b，左图)表明存在明确的可溶性三聚体多肽群体(约8.3分钟保留时间)。类似的分析也表明两步纯化方案产生非常纯的三聚体多肽(图2b，右图)。此外，三聚体多肽正确折叠并展示广泛中和性单克隆抗体cr9114的表位。这通过elisa分析而证明，其显示出强的cr9114结合，ec
50
值低于1nm(图2c)。另外，通过dsf测定50％多肽解折叠时的温度。所有多肽均是温度稳定的，并且对于ufv180088、ufv180089和ufv180090，分别展示出66.6℃、64.6℃和60.9℃的tm
50
值(图2d)。
[0247]
总之，本实例中描述的本发明的多肽表达良好，并从细胞培养物上清液中作为正确折叠的三聚体多肽而纯化。
[0248]
实例3：对本发明的多肽中单点突变的表征(sec图谱)
[0249]
设计
[0250]
为了评估在本发明的三聚体多肽(在图1中示意性示出)中引入的突变的贡献，将氨基酸回复突变到骨架株系a/香港/1/1968中的原始氨基酸(表1，图3a)，从多肽ufv 180141开始(包含ufv180088的所有特征，即：从位置47处的氨基酸开始直到并且包括位置306处的氨基酸的头部区域的缺失(即缺失47-306)，在ha2结构域中位置405-419处引入的三聚化区(注意，引入的gcn4序列与ufv180088相比略有不同：即
405
rmkciedkieeiesk
419
(seq id no:11)，包含在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合(形成原聚体内二硫键)，包含在位置329处的q(抗蛋白酶切割)，并且其中位置355处的氨基酸是w；并且位置378处的氨基酸是t，并且位置379处的氨基酸是n，并且位置381处的氨基酸是v；并且在位置401-403处包含聚糖基序)，并且包含在对应于位置398的位置处的半胱氨酸与在对应于位置408的位置处的半胱氨酸的组合(在gcn4序列中)，从而形成原聚体间二硫键，并且包含位置388处的m、位置31处的e和位置34处的v、位置380和432处的i、位置392处的s、位置395处的t、位置399处的s和位置435处的n和位置439处的y)。与ufv180088类似，多肽ufv180141在位置506处的氨基酸之后被截短。然而，ufv180141在位置393-395处不含另外的糖基化基序，在位置405处不含b-环稳定化脯氨酸，并且携带399s而不是399p。此外，ufv180088包含c-末端标签epea(seq id no:25)，而ufv180141包含不同的c-末端标签。
[0251]
例外是c408q突变，它不是回复到野生型h3的突变，而是回复突变到所引入的gcn4三聚化结构域序列(在位置405-419处引入)。通过分析型sec评估不存在特异性突变的影响。
[0252]
评估所选择的突变的有益效果的替代性方法是将它们逐步引入最小设计多肽即ufv180647中，该多肽包含以下特征：从位置47处的氨基酸开始直到并且包括位置306处的氨基酸的头部区域的缺失(即，缺失47-306)，在ha2结构域中引入的三聚化区域，即在位置405-419处引入的
405
rmkciedkieeiesk
419
(seq id no:.11)；在对应于位置310的氨基酸位置处的半胱氨酸与在对应于位置422的位置处的半胱氨酸的组合(形成原聚体内二硫桥)，包含在位置329处的q(抗蛋白酶切割)，并且其中位置355处的氨基酸是w；位置378处的氨基酸
是t，位置379处的氨基酸是n且位置381处的氨基酸是v；并且包含在位置401-403处的聚糖基序，并且包含在对应于位置398的位置处的半胱氨酸与在对应于位置408的位置处的半胱氨酸的组合(形成原聚体间二硫桥)，并且包含在位置388处的m。通过分析型sec对具有添加的突变的构建体进行分析并与最小设计多肽进行比较(表2，图3c)。
[0253]
表1.在稳定化的三聚体多肽ufv180141中对回复为野生型a/香港/1968残基的选定突变的逆转
[0254][0255][0256]
表2.向最小设计多肽ufv180647逐步引入选定的突变
[0257][0258]
哺乳动物expi293f细胞中的蛋白表达
[0259]
如实例2所述合成编码表1和表2中所列多肽的dna片段。在真核悬浮细胞系expi293f中以微量规模(200μl)产生包含用于筛选目的和纯化的c-末端flag-接头-his标签的多肽。简言之，使用expifectamine 293转染试剂盒(gibco，赛默飞世尔科技)用工业级dna于96半深孔板(system duetz)中以2.5e 06vc/ml的细胞密度对细胞进行瞬时转染，并且使细胞在含有expi293表达培养基的摇瓶(gibco，赛默飞世尔科技)中于37℃、250rpm、8％co2和75％湿度下进行孵育。在第3天收获含有分泌多肽的细胞培养物上清液，并且通过
离心(以400xg离心10min)而澄清，然后过滤(96孔滤板，0.22μm pvdf膜，康宁)。
[0260]
培养物上清液分析
[0261]
在高效液相色谱(hplc)infinity 1260系列装置(安捷伦)中通过分析型sec评估expi-293细胞培养收获物中本发明多肽的含量。将100μl进样体积的培养物上清液在tsk凝胶g3000swxl柱(西格玛-奥德里奇)上运行(1ml/min)，并通过uv检测法监测洗脱(图3a)。替代性地，使用具有beh200a柱(沃特世(waters)，进样体积40μl，流速0.35ml/min)的vanquish系统(赛默飞世尔科技)通过超高效液相色谱法(uhplc)分析样品，并通过helios光散射检测器(怀雅特科技，图3c)监测洗脱级分。通过astra 6软件包(怀雅特科技)分析sec图谱。sec图谱的洗脱时间和三聚峰(高度和形状)在图3b和图3d中示出。
[0262]
结果与结论
[0263]
回复突变的子集似乎对茎部多肽的表达有害，例如由ufv180193(w355h回复突变)、ufv180194(gcn4缺失)、ufv180195(分子内二硫桥缺失)和ufv180199(i432e回复突变)所示，而其他回复突变则被接受(图3a和图3b)。
[0264]
缺乏在ufv180088中引入的稳定突变的多肽(表2)显示，在递增添加本发明的突变后最小三聚体茎部多肽的表达水平显著改善(针对ufv180088设计)。例如，如图3c所示，在引入突变k380i、e432i后，多肽ufv1801034的三聚体峰在洗脱时间上发生偏移并且在高度上增加(图3d)。在b-环中递增添加稳定化突变(ufv181042：f392s、h393n、i395t、f399p、r405p)进一步增加了三聚体多肽的表达。
[0265]
本实例表明至少以下氨基酸位置(例如突变)对于获得高水平的所需可溶性三聚体多肽是有益的：即，位置355处(突变成)w和/或位置378处(突变成)t，位置379处(突变成)n和位置381处(突变成)v和/或位置432处(突变成)i，或位置432和380处(突变成)i，以及位置401-403处的糖基化基序，用于位置401处的n-连接的糖基化。在b-环中添加稳定化突变(例如f392s、h393n、i395t和f399p)进一步增加三聚体多肽的表达。
[0266]
实例4：原聚体间二硫桥；本发明的多肽的稳定性
[0267]
设计
[0268]
为了评估在本发明多肽中形成原聚体间二硫桥的在b-环和c-螺旋中引入的半胱氨酸的贡献(在图4中示意性示出)，将半胱氨酸回复突变成它们相应的存在于骨架株系a/香港/1/1968(位置398)中的野生型残基(谷氨酸)和存在于所引入的gcn4三聚化结构域序列(405-419)中的谷氨酰胺(残基408)。通过分析型sec、dsf和sds-page评估省略半胱氨酸和随后的二硫桥的影响。
[0269]
蛋白表达、纯化和表征
[0270]
如实例3所述在expi293f细胞中以微量规模以及如实例2所述在expicho细胞中以中等规模(约60ml，在第8天收获)产生编码多肽ufv180192和ufv180141的dna片段。如实例2中，在收获当天(微量规模)或在收获的培养物上清液在4℃下孵育1周后(中等规模)，通过分析型sec分析培养物上清液。从收获的培养物上清液(中等规模)中，使用avant 25系统(通用医疗生命科学(ge healthcare life sciences))以两步方案纯化his-标记的多肽。首先，使用预填充的complete his标签纯化柱(罗氏(roche))进行固定化金属亲和色谱法，该柱用1mm的咪唑洗涤，并用300mm的咪唑洗脱。其次，使用srt-10c sec-300柱(赛分科技(sepax technologies))进行尺寸排阻色谱法，并收集三聚体峰级分。通过dsf(如实例2
中)测定纯化蛋白的热稳定性，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)在非还原和还原条件下通过使用bolt系统并按照制造商说明(英杰)运行10％bis-tris凝胶来评估蛋白的纯度。
[0271]
结果与结论
[0272]
通过分析型sec对细胞培养物上清液的评估表明，具有(ufv180141)和不具有(ufv180192)在b-环(在位置398处)和c-螺旋(位置408)中引入的半胱氨酸的多肽在溶液中均表达了三聚体多肽(图4a；左图)。在小规模转染后3天的收获日，多肽ufv180192的丰度比多肽ufv180141更高。然而，在更高的规模下，在第8天收获并在4℃下储存含有ufv180192的上清液一周后，出现第二个非三聚体峰(约8.5min保留时间)，表明缺乏原聚体间二硫桥的构建体的结构不稳定性(图4a；右图)。通过对纯化多肽的dsf评估证实了稳定性的差异。缺少原聚体间二硫桥的多肽(ufv180192)在50.8℃解折叠，而在位置398和408处引入了半胱氨酸的多肽在67.7℃解折叠(图4b)。对纯化多肽的sds-page分析显示，正如预期的那样，在位置398和408处没有半胱氨酸的多肽在非还原和还原条件下以约40kda的单体高度运行。相反，具有两个引入的半胱氨酸的多肽的主带在非还原条件下在约120kda处观察到，如共价结合的三聚体所预期的那样，并且在还原条件下以约40kda的预期单体高度观察到(图4c)。
[0273]
该实例中显示的数据表明，通过在位置398和408处引入两个半胱氨酸以形成原聚体间二硫键来共价连接单体产生明显更稳定的可溶性三聚体多肽。
[0274]
实例5：位置355、380和342、435和388的替代性取代
[0275]
设计
[0276]
在位置355(图5a)、位置380和432(图5b)、位置435(图5c)以及位置388(图5d)测试了用于优化本发明多肽的替代性取代。在expi293f细胞培养物上清液中评估了多肽的表达和折叠。
[0277]
哺乳动物细胞中的蛋白表达
[0278]
如实例2所述合成编码多肽的dna片段。除了图5c ii和图5d中所述的多肽如实例2所述在真核expicho细胞系中产生(分别以50ml和30ml的中等规模)外，包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽如实例3所述在真核expi293f细胞中以微量规模(200μl)产生。
[0279]
培养物上清液分析
[0280]
本发明的多肽的表达、折叠和三聚体含量通过扩增发光邻近均相测定法(alphalisa，图5a、图5b、图5c i)根据制造商的说明(珀金埃尔默)来评估。这种溶液中和结合中的平衡测定法基于供体和受体珠粒两者与多肽的成功结合。当紧密靠近时，680nm激光辐照供体珠粒会产生单线态氧流，触发附近受体珠粒中的化学事件，从而导致615nm的化学发光发射。通过向细胞培养物上清液中同时添加镍供体珠粒(抗his标签)和抗flag标签受体珠粒，经由表达-alphalisa装置测量表达水平。这种表达-alphalisa装置识别c-末端flag-接头-his标签，而不论多肽的折叠。通过向细胞培养物上清液中同时添加镍供体珠粒、人igg cr9114(2nm)或ct149(1nm)和抗人igg受体珠粒，在结合-alphalisa中评估多肽的正确折叠。只有当多肽正确折叠并允许流感病毒ha特异性igg结合时，才能获得信号。
[0281]
三聚体-alphalisa装置用于测定培养物上清液中存在的三聚体多肽的含量。它依
赖于特异性结合到单体ha的人igg，诸如ct149或cr9114。如果将不同标记的igg ct149或cr9114的1:1混合物添加到ha中，则只有当存在允许结合至少两种抗体的多聚体而不是允许仅结合单一抗体的单体时，才能检测到alphalisa信号。在生物素化的和dig标记的ct149或cr9114 igg(各0.5nm，1:1比例)存在下，通过向培养物上清液中同时添加链霉亲和素供体珠粒和抗dig igg受体珠粒进行三聚体-alphalisa。
[0282]
对于所有alphalisa装置，均以10μg/ml的浓度添加检测珠粒。根据制造商的说明，在不同稀释度下测试培养物上清液以避免钩状效应。在室温下在暗处孵育2小时后，使用ensight
tm
多模式酶标仪(珀金埃尔默)进行读数。将所有数据归一化至设定为100％的其相应的参考构建体。
[0283]
还使用octet平台根据制造商的说明(佛特比奥)通过生物层干涉测定法评估细胞培养物上清液中表达的多肽的水平。简言之，使用抗his(his2)生物传感器(佛特比奥)通过评估明确的参考批次的纯化同源多肽的稀释系列的结合移位来建立标准曲线。随后，测量预先稀释(在动力学缓冲液中，佛特比奥)的含有本发明多肽的细胞培养物上清液的结合移位，并且使用已建立的标准曲线来计算多肽的浓度(图5c ii，图5d)。如实例4所述，通过hplc(图5c ii)和uhplc(图5d，10μl进样体积)中的分析型sec进一步表征培养收获物中本发明多肽的含量。纯化所选的多肽ufv171004和ufv171197后，通过elisa评价单克隆抗体cr9114和ct149的结合。最后，通过dsf测定这些纯化多肽的热稳定性(两种方法均如实例2，图5c ii所述)。
[0284]
结果与结论
[0285]
与在位置355处具有野生型组氨酸的构建体(ufv161333)相比，在多肽ufv161739中的位置355处引入色氨酸(w)导致抗体cr9114和ct149的表达和结合的强烈增加。与仅具有单一突变355w的构建体相比，在位置482处同时引入355w和异亮氨酸(i)(ufv161800)进一步增加了表达和抗体结合。在位置355和482i处同时引入苯丙氨酸(f)被很好地接受，但与在位置355和482处具有相应野生型残基的对照构建体相比，导致表达和抗体结合的增加较小(图5a)。
[0286]
评估了位置380和432的多个氨基酸残基及其组合。总之，所测试的氨基酸取代被很好地接受；对表达水平、三聚体含量和抗体结合的影响极小(图5b)。与参考相比，在多肽(ufv171004)中的位置380和432处同时引入异亮氨酸导致了最高的三聚体产量(215％)。
[0287]
在位置435处，四种不同的氨基酸取代(k、n、q、r)显示出被很好地接受。在位置435处包含野生型组氨酸的相应多肽和参考多肽ufv170611在单克隆抗体cr9114和ct149的表达、三聚体含量和结合方面显示出相当的alphalisa水平(图5c)。对具有取代435n(ufv171004)和435r(ufv171197)的多肽的进一步表征证实了mab cr9114和ct149的类似表达水平(octet)、sec图谱和结合强度(elisa)。然而，与在位置435处具有精氨酸(r)取代的多肽相比，在该位置处具有天冬酰胺(n)的多肽展示出高约4℃的热稳定性(图5c ii)。
[0288]
通过分析型sec评估在位置388处具有氨基酸取代的多肽的表达水平(octet)和三聚体含量，该位置在a-螺旋(m、v、i、l、f、y、w、h、k和r)的顶部。表达水平从475mg/l的甲硫氨酸取代(ufv180088)到表达水平为192mg/l的不太有利的精氨酸取代排序。sec图谱全部显示了三聚体多肽，表明位置388处的所评估残基全部被接受并且不影响整体结构(图5d)。与参考多肽(ufv180088)相比，分别由于c-末端标签、flag-接头-his-标签和c-标签长度的差
异，在位置388处具有氨基酸取代的多肽都以更短的保留时间洗脱。
[0289]
总之，在本发明多肽的不同优化区域中的单一替代性氨基酸取代是可能的并且被很好地接受；表达水平、三聚体含量和蛋白折叠仅受到极小的影响。
[0290]
实例6：ha1头部缺失的定义
[0291]
设计
[0292]
本发明的茎部多肽优选地包含从位置47直到并且包括位置306处的氨基酸的头部区域的缺失(在图1中示意性示出)。在本实例中，探索了替代性缺失和缺失后产生的源自ha1端部之间的头部结构域的接头(在图6中示意性示出)。首先，评估了ha1向上链的替代性缺失位置(表3)。参考设计(ufv161908，具有从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的缺失，被gpgs接头替换)中存在的ha1端部用灰色表示。
[0293]
表3.头部缺失后ha1端部之间的连接
[0294][0295]
*参考
[0296]
其次，将ha1向上链的替代性缺失位置与ha1向下链的替代性缺失位置组合(表4)。
[0297]
表4.头部缺失后ha1之间的替代性连接
[0298][0299]
[0300]
*参考，**半胱氨酸至甘氨酸点突变
[0301]
第三，探索了使用包含来自去除的头部结构域的氨基酸序列的同源接头来连接ha1端部(表5)。
[0302]
表5.源自去除的头部结构域的残基链的替代性连接
[0303][0304]
*参考，**用作表1和表2的构建体的参考构建体的连接
[0305]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0306]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽。如实例5所述，通过alphalisa评估多肽的表达、三聚体含量和折叠(cr9114或ct149的mab结合)。将所有数据归一化至设定为100％的其相应的参考构建体ufv161908(图6a)、ufv160653(图6b)和ufv160321(图6c)。
[0307]
结果与结论
[0308]
改变ha1向上链中的头部结构域缺失位置对表达水平、三聚体产量和蛋白折叠(即抗体结合)仅具有极小的影响(图6a)。相反，在ha1的向上链和向下链中均包含替代性缺失位置的多肽的表达显示出高达约50％的表达水平降低和高达约70％的抗体ct149结合降低(图6b)。这表明在所测试的位置范围内，特别是ha1向下链缺失的位置，影响多肽的表达和折叠。
[0309]
在去除头部结构域后直接连接其余ha1端部(即，n-末端ha1片段和c-末端ha1片段)的替代性方法是经由同源连接序列进行的连接。如表5所示，为此，将ha1向上链(残基45)借助源自相应h3 ha头部结构域的短序列与ha1向下链(残基307)连接。这产生了与参考
相比表达水平从33％至223％变化的多肽(图6c)。类似地，抗体ct149的结合显示出大的范围，观察到与参考相比在57％至350％范围内的值。表达良好的多肽也主要展示出高抗体结合。
[0310]
总之，通过缺失ha头部结构域产生三聚的且正确折叠的茎部多肽不依赖于一个确切的缺失位置。直接连接ha1端部，成功地产生了ha1的向上链和向下链中缺失位置的变化。替代性地，也可以通过引入源自头部结构域的同源氨基酸接头来连接ha1端部，并且可以选择具有不同序列组成和长度(至少2至5个氨基酸)的许多肽，以在头部结构域去除后重新连接ha1端部。
[0311]
实例7：优化本发明多肽中的b-环
[0312]
设计
[0313]
在缺失ha1头部结构域后，ha茎部多肽的b-环(图1b和图1c，包含氨基酸385-404)变得暴露出来。为了部分地保护该区域不受免疫系统的影响并进一步稳定该环，引入了糖基化基序和脯氨酸残基(图7)。通过突变e401n和e403t在位置401-403处引入糖基化基序(nxt)，用于位置401处的n-连接的糖基化，并在位置398-400处通过突变s398n(产生nxs基序)或在位置392-394处通过突变s392n和q394t或在位置393-395处通过突变h393n和i395t(均产生nxt基序)与n-连接的糖基化基序相结合进行测试。可降低b-环序列的螺旋倾向的脯氨酸取代通过在385与406之间的任何位置的单点突变以及通过在392与396或398一起的双点突变而引入。
[0314]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0315]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞系中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽。如实例5所述，通过alphalisa评估多肽的表达、三聚体含量和折叠(mab cr9114、ct149(如由wu等人(2015)所述)和sd15013(包含seq id no:39的氨基酸序列)的结合)(在2nm浓度的sd15013存在下，使用抗his受体珠粒和链霉亲和素供体珠粒评估sd15013结合)。如实例2所述，在收获当天通过分析型sec分析细胞培养物上清液。
[0316]
将所有数据归一化至设定为100％的其相应的参考构建体ufv161686(图8a)、ufv161333(图7b和c)和ufv171187(图7d)。
[0317]
结果与结论
[0318]
通过将位置401、402和403处的残基分别突变成n、a和t而将单个糖基化基序引入b-环，用于位置401处的n-连接的糖基化，导致多肽表达水平增加两倍。类似地，观察到抗体cr9114和ct149的结合大幅提高，分别为5和7倍，单结构域sd15013为10倍(图7a)。
[0319]
将脯氨酸引入b-环不影响多肽的表达水平；相对于参考构建体，值从94％变化到128％(图7b)。相反，在位置386、387、388和389处添加脯氨酸残基对于抗体结合是有害的。cr9114、ct149和sd15013的最小结合表明当在b-环的n-末端引入脯氨酸时，多肽的折叠受到负面影响。在位置390至405中的任一个位置引入单个脯氨酸或者在位置392和396或位置392和398引入两个脯氨酸导致cr9114结合增加约40％，而ct149结合保持相对类似或减少(与参考相比为约65％)。在这些构建体中，sd15013展示出最大分布，与参考相比，相对结合范围为约50％至约150％。两个脯氨酸的引入被很好地接受，并且通常发现cr9114、ct149和sd15013的结合是单个脯氨酸引入的抗体结合值的平均值。观察到sd15013与ufv161708结
合的异常，其展示出147％结合，而对于位置392和396处的单一突变，观察到结合降低(相对于参考，为64％和75％)。
[0320]
将第二糖基化基序引入b-环被很好地接受(图7c)；与参考相比，在位置393(ufv161715)或398(ufv161721)处具有另外基序的两种多肽显示出相对相似的表达水平，cr9114结合增加(约145％)，ct149结合未受影响(约90％)和sd15013结合小幅降低(约60％)。
[0321]
脯氨酸残基和/或第二糖基化基序(在位置392-395处)的同时引入导致所表达的多肽比在位置401-403处含有单个糖基化基序且不含脯氨酸的参考低约2倍(图7d)。抗体结合(cr9114和ct149)几乎不受影响，而观察到sd15013的下降(相对于参考为约48％-88％)。因为n398和n401由于其接近度而同时糖基化是不可能的，所以在n393或n392处的另外的聚糖是优选的。
[0322]
含有具有一个n-连接的聚糖基序(ufv180208)或两个n-连接的聚糖基序和两个脯氨酸(ufv180217)的本发明多肽的expi-293细胞培养物上清液的sec-mals分析显示对应于相应三聚体多肽的清晰峰(图7e)。
[0323]
以稳定化脯氨酸残基和另外的n-连接的糖基化基序的形式的b-环突变被很好地接受。尽管观察到了表达和抗体结合的差异(最值得注意的是sd15013结合)，但是脯氨酸(在b-环的n-末端区域(位置392-389)中除外)和第二n-连接的糖基化基序的引入是可能的，而不影响蛋白折叠和三聚化。
[0324]
实例8：在本发明多肽的位置38处的n-连接的糖基化基序
[0325]
设计
[0326]
为了评价靠近cr9114表位(位置38)的保守糖基化基序对表达和折叠的影响，将含有用于n-连接的糖基化的野生型基序38-nat-40的多肽(ufv170282)与其中该基序通过点突变t40i而敲除的多肽(ufv170278)进行比较。
[0327]
哺乳动物细胞中的蛋白表达，培养物上清液分析、纯化和表征
[0328]
如实例2所述，合成、表达并纯化编码本发明多肽的dna片段。使用固定化mab ct149和含有本发明多肽的25倍稀释的细胞培养物上清液，通过生物层干涉测定法使用octet平台如实例2所述，评估培养物上清液中所表达的多肽的水平。如实例2所述，通过elisa(ec
50
)评估抗体与纯化多肽的结合强度。
[0329]
结果与结论
[0330]
在去除位置38处的n-连接的糖基化基序后(ufv170278)，相对于存在基序的多肽(ufv170282)，表达水平降低了约50％，然而，这两种多肽仍然是表达良好的多肽，其值高于每升培养物上清液255mg。如通过elisa所测定的，两种多肽之间的抗体结合强度没有显著差异，如通过cr9114和ct149的约1nm的ec
50
值所证实的(图8a和图8b)。
[0331]
总之，去除位置38处的n-连接的糖基化基序虽然观察到表达水平的降低，但被很好地接受，并且似乎对多肽的折叠没有影响。
[0332]
实例9：ha1-ha2之间的分子内二硫桥的替代性位置
[0333]
设计
[0334]
本发明的三聚体茎部多肽的原聚体优选地通过引入的二硫桥来稳定，该二硫桥将ha1向下链(位置310)共价连接到ha2链(位置422)的c-螺旋。通过在相应半胱氨酸的精确位
置(位置311/422和308/418)进行小的移位来评估该原聚体内二硫桥的替代性选项。除了310/422二硫桥之外，还评价了第二对半胱氨酸以连接ha1(位置26)与ha
2 c-螺旋的c-末端部分(位置433)。
[0335]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0336]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。除了实验规模是培养物以中等规模(30ml)而不是微量规模(200μl)生长外，如实例2所述在expi-293细胞中表达多肽。分别使用2.5nm和1.25nm的cr9114和ct149浓度，如实例5所述通过alphalisa评估本发明多肽的表达水平和折叠(mab cr9114和ct149的结合)。
[0337]
结果与结论
[0338]
将半胱氨酸从残基310重新定位到311或308(与将半胱氨酸重新定位在位置422至418相结合)被很好地接受，并且仅轻微地影响多肽的表达水平和折叠，如通过抗体结合所证实(图9a)。如未受影响的表达水平所示，在310-422二硫桥以下的区域引入第二二硫桥原则上是可能的，然而，cr9114和ct149结合的显著降低(分别为参考的2％和48％)表明对所需保守茎部表位的折叠有负面影响(图9b)。
[0339]
实例10：原聚体间二硫桥的替代性位置
[0340]
设计
[0341]
ha茎部多肽中的原聚体优选地通过三聚体ha蛋白顶部中的原聚体间二硫桥共价连接(图4a)。引入两个半胱氨酸残基，一个在b-环(位置398)中并且一个在c-螺旋(位置408)中，这两个半胱氨酸残基都与三聚体内的相邻原聚体中的空间上接近的半胱氨酸配对；即，原聚体1的半胱氨酸398与原聚体2的半胱氨酸408形成二硫键，原聚体2的半胱氨酸398与原聚体3的半胱氨酸408形成二硫键，以及原聚体3的半胱氨酸398与原聚体1的半胱氨酸408形成二硫键。通过对半胱氨酸点突变的精确位置进行小的向上或向下移位来探索该原聚体间二硫键的替代性选项(图10)。
[0342]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0343]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞系中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽。如实例5所述，通过alphalisa评估本发明多肽的表达、三聚体含量和折叠(mab cr9114或ct149的结合)。
[0344]
结果与结论
[0345]
与不含这些半胱氨酸的多肽相比，具有引入的原聚体间二硫化物的多肽的表达低约1.8倍。然而，三聚化中的差异是显著的(图10)。具有原聚体间二硫化物的多肽以相同水平表达，并且均展示出类似高水平的三聚体以及抗体cr9114和ct149的结合亲和力。这证明了原聚体间二硫桥对于保守茎部表位的三聚化和正确折叠相当重要。此外，可以很好地接受原聚体间二硫桥定位的小的改变。
[0346]
实例11：c-末端的替代性截短
[0347]
设计
[0348]
流感病毒血凝素(ha)是位于病毒颗粒表面的膜蛋白，该蛋白的c-末端部分嵌入病毒膜中。对于本发明多肽的可溶性形式，胞外结构域可以在天然接头序列(位置500-513)内的不同位置截短，该天然接头序列将胞外结构域的c-末端α螺旋与跨膜(tm)和胞质结构域
连接。
[0349]
评价了替代性c-末端截短位置(表6)。
[0350]
表6.本发明多肽的替代性c-末端截短，源自a/香港/1/68的ha胞外结构域。
[0351][0352]
细胞培养物上清液分析
[0353]
编码表6中所列多肽的dna片段如实例3所述合成，并如实例4所述在悬浮expi-293细胞培养物中表达。
[0354]
如实例4a所述，通过分析型sec使用hplc分析收获的细胞培养物上清液中三聚体多肽的水平。如实例6所述，使用octet平台(佛特比奥)通过生物层干涉测定法在细胞培养物上清液中评估本发明的表达多肽的正确折叠。简言之，评估在动力学缓冲液(佛特比奥)中稀释五倍的上清液对加载到链霉亲和素生物传感器(佛特比奥)上的生物素化人单克隆抗体cr9114或ct149(10μg/ml)的结合。在缔合步骤的最初100秒内进行曲线拟合以计算k
on
值，并在1:1模型中拟合曲线。包括mock样品作为阴性对照。
[0355]
结果与结论
[0356]
在残基501与513之间的c-末端截短被很好地接受，对三聚体和表达水平以及抗体结合的影响很小。截短的多肽在sec分析中展示出相当的三聚体峰模式(图11a)，在octet分析中展示出cr9114和ct149结合的良好或改善的k
on
(图11b)。到达胞外结构域的c-末端螺旋的截短(在ufv171280中的位置499之后)导致三聚体表达和抗体结合水平的明显下降，如sec和octet分析所示。
[0357]
实例12：在本发明多肽的a-螺旋中的替代性突变
[0358]
设计
[0359]
本发明的多肽的a-螺旋的c-末端部分的定位和折叠对于保守茎部表位的正确表达是关键性的。为了找到最佳构象，将a-螺旋的三个残基(378、379和381)突变成源自组1 ha(h1 a/布里斯班/59/07)或组2 ha(h3 a/香港/1/1968)的该位置的残基。此外，评估了推定的a-螺旋稳定突变g379a。
[0360]
哺乳动物细胞中的蛋白表达，培养物上清液分析、纯化和表征
[0361]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞系中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽。如实例5所述，通过alphalisa评估多肽的表达、三聚体含量和折叠(通过2.5nm mab cr9114或
ct149的折叠)。另外，如实例4所述在expi-cho细胞中以中等规模(50ml)表达多肽，并如实例5所述通过生物层干涉测定法测定表达水平，且如实例3所述借助高效液相色谱法(hplc)通过sec-mals分析粗细胞培养物上清液。如实例4所述，用两步方案通过亲和色谱法和尺寸排阻色谱法纯化多肽。均如实例2所述，通过elisa(cr9114和ct149抗体结合的ec
50
值)评估纯化多肽的抗原性，并通过dsf测定50％多肽解折叠时的温度。
[0362]
结果与结论
[0363]
逐渐增加位置378、379和381处h1衍生残基的量影响了多肽的表达水平。含有所有三个h1样残基的多肽ufv161448是表达最低的多肽(84％)，而在位置379和381处含有h1样残基的ufv161451是表达最高的多肽(163％)。含有推定的a-螺旋稳定突变379a的多肽(ufv161459和ufv161458)表达最差(分别为42％和75％)。在alphalisa中评估多肽的正确折叠。cr9114和ct149结合的相对信号均显示大的范围。多肽ufv161453(379n)展示出对cr9114和ct149的最小结合，分别为61％和24％。含有向h1的所有突变(378t、379n和381v)的多肽ufv161448展示出对cr9114和ct149的最高结合，分别为1706％和841％(图12a)。
[0364]
在更稳定的三聚体茎部多肽ufv171004和(ufv171116)中进一步研究了a-螺旋突变的作用，这些多肽尤其包含h355w突变和替代性原聚体间二硫桥(在397/408)。在三个独立的中等规模expicho生产中，ufv171004(其在a-螺旋中在位置378、379和381处包含h1残基)以略高于多肽ufv171116(其在这些位置包含h3残基)的水平表达。
[0365]
类似地，在培养物上清液的sec-mals分析中观察到极小差异；对于两种构建体而言，对应于三聚体级分的峰(保留时间约8分钟)在形状和高度上重叠。抗体cr9114和ct149的结合(作为正确蛋白折叠的量度)通过elisa测定，并且指示强结合(ec
50
《0.01nm)。通过dsf测定的温度稳定性表明两种多肽之间存在显著差异。而50％的多肽ufv171116在66.2℃下未折叠，多肽ufv171004展示出68.0℃的tm
50
值(图12b)。
[0366]
总之，在基于h3的茎部多肽的a-螺旋中引入h1残基导致更加热稳定的并且展示出cr9114和ct149结合增加的多肽。在尤其包含稳定突变h355w的构建体ufv171004和ufv171116中，抗体结合的差异不太显著。
[0367]
实例13：引入向h7的表面突变
[0368]
设计
[0369]
如前述实例所述，本发明的三聚体茎部多肽基于来自h3甲型流感病毒/香港/1/1968的ha。尽管组2h3和h7血凝素的茎部具有高度保守性，但保守茎部表位区域中的一些表面残基是不同的。在本实例中，位于多肽表面的所选残基从h3残基(如存在于参考ufv172561和ufv172562中)逐步突变成相应的h7残基。这些残基包括β2/β3环中的位置(残基25和27)、a-螺旋中的残基(残基367)和多肽下部的残基(残基475、476和479)。
[0370]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0371]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞系中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽。如实例5所述，通过alphalisa评估本发明多肽的表达、三聚体含量和折叠(通过mab cr9114和ct149的结合)。将所有alphalisa数据归一化至设定为100％的其相应的参考构建体ufv172561和ufv172562。第一参考构建体包括在位置379和381处的h1残基的突变，第二参考包括在位置379和381处的野生型h3残基。另外，如实例2所述，在收获当天通过分析型sec
分析培养物上清液。
[0372]
结果与结论
[0373]
在β2/β3环、a-螺旋(包括位置379和381处的h1样残基)和茎部的下部引入h7样残基导致表达和三聚体产量的轻微降低和与三聚体茎部多肽的抗体结合的相对小的变化(
±
20％)，如通过alphalisa所测定。类似地，对粗细胞培养物上清液的sec分析指示包含向h7的表面突变的多肽的表达水平降低(图13a)。
[0374]
在包含位置379和381处的h3样残基的骨架变体中引入表面突变后，观察到类似的效果(图13b)。
[0375]
总之，可以将本发明的h3 ha衍生的茎部多肽的表面向h7修饰，尤其是在a-螺旋的上部存在h1样残基的情况下。
[0376]
实例14：组2微型ha方法的一般应用
[0377]
设计
[0378]
产生本发明的三聚体茎部多肽所必需的设计元件在h3 ha骨架(a/香港/1/1968)中表达，并且还转移到两个替代性h3骨架中；即，a/威斯康辛/67/2005和a/新加坡/infimh/16/0019/2016。逐步引入设计元件；组i多肽包含最小的一组突变，组ii包含另外的部分b-环稳定化突变，并且组iii包含所有另外的b-环稳定化突变。
[0379]
哺乳动物细胞中的蛋白表达和培养物上清液分析
[0380]
如实例2所述合成编码本发明多肽的dna片段。如实例3所述，在真核expi293f细胞系中以微量规模(200μl)产生包括用于筛选目的的c-末端flag-接头-his标签的多肽，并在收获当天通过分析型sec分析粗细胞培养物上清液。
[0381]
结果与结论
[0382]
如在sec-mals分析中观察到的，组i设计元件的转移产生了所有3个骨架的三聚体茎部多肽，然而，三聚体峰对于a/威斯康辛/67/2005衍生的多肽是最明显的，并且对于a/香港/1/1968衍生的多肽是最不明显的(图14a)。b-环(组ii和组iii)中的另外稳定化突变导致显著增加的多肽表达水平和三聚体含量(图14b)。总之，结果证实了将本发明的多肽的修饰转移到其他组2骨架上产生了可溶性三聚体微型ha。
[0383]
实例15：腺病毒驱动的正确折叠的三聚体组2微型ha在人肺成纤维细胞的细胞膜上的体外表达。
[0384]
在本实例中，评价了腺病毒26(ad26.flu.004)驱动的三聚体ufv180480(具有天然跨膜结构域的ufv18088)在人肺成纤维细胞(mrc-5)的细胞表面上的表达和折叠。mrc-5细胞在培养基中转导(5,000vp/细胞)。两天后，将细胞在裂解缓冲液中裂解以通过western印迹分析评估三聚体ufv180480的表达，或通过胰蛋白酶消化收获细胞以使用流式细胞术评估正确折叠的ufv180480的细胞表面表达。在两种情况下，都包括缺乏编码ufv180480的转基因的ad26.空作为阴性对照。
[0385]
将来自ad26.flu.004转导细胞的蛋白裂解物以及用作阳性对照的蛋白ufv180088进行处理以在还原条件下(确保三聚体组2微型ha蛋白完全解折叠)或在非还原条件下(确保微型ha蛋白的三聚体性质)进行sds-page，并将蛋白转移至硝酸纤维素印迹。通过用组2微型ha构象特异性生物素化抗体cr9114探测印迹来测试表达，并使用hrp-缀合的链霉亲和素显现表达。
[0386]
为了通过流式细胞术测试ufv180480的细胞膜相关表达，将ad26.flu.004-转导的细胞胰蛋白酶化并重悬于流式细胞术缓冲液中。将非透化细胞用cr9114探测，并且在充分洗涤后，用pe-缀合的抗人抗体探测以显现ufv180480。
[0387]
结果与结论
[0388]
使用流式细胞仪分析法，我们分析了ufv180480的细胞表面表达。与ad26.空转导的细胞(图16a)相比，大部分ad26.flu.004-转导的mrc-5细胞(约96.3％)在细胞表面上显示出高水平的ufv180480(图16b)。
[0389]
对mrc-5中的ufv180480表达的流式细胞术分析未能区分单体或三聚体ufv180480的表达。因此，进行了western印迹分析。基于分子量并通过与三聚体ufv180088比较，证实了ad26.flu.004驱动三聚体ufv180480在mrc-5细胞中表达(图16c)。基于单体ufv180480的氨基酸序列，估计分子量为34.4kda，其产生约103.2kda大小的三聚体ufv180480。来自ad26.flu.004转导细胞(5,000vp/细胞)而不是来自ad26.空转导细胞的切割物显示出103.2kda左右的条带，并且与三聚体ufv180088(预期mw为89.1kda)相比运行得略高(比较图16c，泳道1-3)。在约34kda处未观察到条带，表明大部分ufv180480呈其三聚体形式(图16c，泳道1)。当在还原(即完全解折叠)条件下处理时，没有样品显示出特定的条带(图16c，泳道4-6)。
[0390]
根据本发明，因此已证实ufv180480在ad26.flu.004转导后在体外表达。还证实了人细胞的细胞表面上存在三聚体蛋白。
[0391]
实例16：本发明的多肽ufv170278和ufv170282是免疫原性的并且在致死性h3n2 a/香港/1/1968原初小鼠攻击模型中诱导保护。
[0392]
在本实例中，评价了与模拟免疫(pbs)动物相比，一定剂量范围的2％(v/v)adjuplex-佐剂化ufv170278(在位置38处具有n-连接聚糖的保守基序)和ufv170282(在位置38处不具有n-连接聚糖的保守基序)的体内免疫原性和保护功效(基于随访期结束时的存活比例)。
[0393]
用一定剂量范围的用2％(v/v)adjuplex佐剂化的可溶性三聚体ufv170278或ufv170282以三周为间隔肌内免疫10只雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的组。该剂量范围由4个10倍稀释液组成，从30mcg开始直至0.03mcg。作为阴性对照，用pbs免疫18只小鼠三次。在最后一次免疫后四周，对小鼠放血以分析免疫应答，并于一天后，将小鼠用12.5
×
ld
50
小鼠适应性h3n2 a/香港/1/1968攻击病毒进行攻击，并监测(存活、体重、临床评分)3周。随访结束时的存活比例是主要结果参数。
[0394]
结果
[0395]
结果表明，ufv170278和ufv170282是免疫原性的，因为与pbs组滴度相比，所有剂量的ufv170278和ufv170282均诱导显著更高的h3 a/香港/1/1968ha茎部特异性抗体滴度(用cr9114竞争测定法测量)(p《0.001；anova，采用事后t检验，逐步测试(从最高剂量开始)和构建体的2倍邦费罗尼校正)，参见图17a。
[0396]
此外，与pbs组相比，对于所有剂量而言，adjuplex-佐剂化ufv170278和ufv170282均提供了显著的保护(p《0.001；费希尔精确检验，逐步测试(从最高剂量开始)和构建体的2倍邦费罗尼校正)，参见图17b。与pbs组相比，对于所有剂量而言，体重减轻(由曲线下面积定义)均显著降低(p《0.001；anova，相对于构建体的2倍邦费罗尼校正以及从最高剂量开始
的逐步测试)，参见图17b。
[0397]
结论
[0398]
根据本发明，因此已证实ufv170278和ufv170282是免疫原性的，并在致死性h3n2 a/香港/1/1968小鼠攻击模型中提供保护。
[0399]
实例17：本发明的多肽ufv180088、ufv180089和ufv180090在原初小鼠攻击模型中是免疫原性的
[0400]
在本实例中，评价了与模拟免疫(pbs)动物相比，一定剂量范围的2％(v/v)adjuplex-佐剂化ufv180088、ufv180089和ufv180090的体内免疫原性。
[0401]
用3mcg可溶性三聚体ufv180088、ufv180089或ufv180090以3周为间隔肌内免疫10只雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的组一次、两次或三次。最后的免疫在同一天进行。作为阴性对照，用pbs免疫18只小鼠三次。所有免疫均用2％(v/v)adjuplex佐剂化。最后一次免疫后四周，对小鼠放血以分析免疫应答。
[0402]
结果
[0403]
结果表明，ufv180088、ufv180089和ufv180090是免疫原性的，因为与pbs组滴度相比，所有构建体在两次或三次免疫后均诱导了显著更高的h3 a/香港/1/1968 ha茎部特异性抗体滴度(用cr9114竞争测定法测量)(p《0.001；wilcoxcon，用于多重比较的3倍邦费罗尼校正和从最高剂量开始的逐步测试)，参见图18a。在一次免疫后没有构建体诱导显著的茎部特异性抗体。
[0404]
与pbs组滴度相比，所有构建体在两次或三次免疫后均诱导了显著更高的h3 a/香港/1/1968和h3 a/德克萨斯/50/2012 ha特异性抗体滴度(用fl ha结合elisa测量)(p《0.01；wilcoxcon，用于多重比较的3倍邦费罗尼校正和从最高剂量开始的逐步测试)，参见图18b。此外，与pbs组滴度相比，使用ufv180088和ufv180089的一次免疫诱导了显著更高的h3 a/德克萨斯/50/2012 ha特异性抗体滴度(p《0.01)。
[0405]
与pbs组滴度相比，所有构建体在三次免疫后均诱导了显著更高的h7 a/荷兰/219/2003 ha特异性抗体滴度(用fl ha结合测定法测量)(p《0.001；wilcoxcon，用于多重比较的3倍邦费罗尼校正和从最高剂量开始的逐步测试)，参见图18b。与pbs组抗体滴度相比，用ufv180089和ufv180090的两次免疫诱导了显著更高的滴度(分别为p《0.001和p《0.01)，而在单次免疫后未检测到显著更高的滴度。
[0406]
结论
[0407]
根据本发明，因此已证实ufv180088、ufv180089和ufv180090在原初小鼠模型中是免疫原性的。所有构建体均诱导了显著的ha茎部特异性抗体滴度和结合多种系统发育不同的h3(来自不同年份分离的株系)和h7 ha蛋白的抗体。
[0408]
实例18：本发明的多肽ufv180088、ufv180089和ufv180090在原初小鼠攻击模型中诱导针对h3n2 a/香港/1/1968的致死攻击的保护作用
[0409]
在本实例中，评价了与模拟免疫(pbs)动物相比，一定剂量范围的2％(v/v)adjuplex-佐剂化ufv180088、ufv180089和ufv180090的体内保护功效(基于随访期结束时的存活比例)。
[0410]
用3mcg可溶性三聚体ufv180088、ufv180089或ufv180090以3周为间隔肌内免疫10只雌性balb/c小鼠(6-8周龄)的组一次、两次或三次。最后的免疫在同一天进行。作为阴性
对照，用pbs免疫18只小鼠三次。所有免疫均用2％(v/v)adjuplex佐剂化。在最后一次免疫后四周，将小鼠用25
×
ld
50
小鼠适应性h3n2 a/香港/1/1968攻击病毒进行攻击，并监测(存活、体重、临床评分)3周。随访结束时的存活比例是主要结果参数。
[0411]
结果
[0412]
结果表明，与pbs组相比，对于两次或三次免疫而言，ufv180088、ufv180089和ufv180090提供显著的保护(p《0.001；费希尔精确检验，相对于构建体的2倍邦费罗尼校正以及从最高剂量开始的逐步测试)，参见图19。在一次免疫后没有构建体诱导显著的保护作用。除了用ufv180089的一次免疫之外，与pbs组相比，对于所有剂量而言，体重减轻(由曲线下面积定义)均显著降低(p《0.05；anova，相对于构建体的2倍邦费罗尼校正以及从最高剂量开始的逐步测试)，参见图19。
[0413]
结论
[0414]
根据本发明，已证实ufv180088、ufv180089和ufv180090在致死性h3n2a/香港/1/1968小鼠攻击模型中提供保护。
[0415]
表7.标准氨基酸、缩写和性质
[0416]
氨基酸3-字母1-字母侧链极性侧链电荷(ph 7.4)丙氨酸alaa非极性中性精氨酸argr极性正天冬酰胺asnn极性中性天冬氨酸aspd极性负半胱氨酸cysc非极性中性谷氨酸glue极性负谷氨酰胺glnq极性中性甘氨酸glyg非极性中性组氨酸hish极性正电荷(10％)中性(90％)异亮氨酸ilei非极性中性亮氨酸leul非极性中性赖氨酸lysk极性正甲硫氨酸metm非极性中性苯丙氨酸phef非极性中性脯氨酸prop非极性中性丝氨酸sers极性中性苏氨酸thrt极性中性色氨酸trpw非极性中性酪氨酸tyry极性中性缬氨酸valv非极性中性
[0417]
参考文献
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[0435]
序列
[0436]
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[0437][0438]
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[0439][0440]
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[0443][0444]
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[0451][0452]
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[0453][0454]
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[0461][0462]
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seq id no 209:编码ufv180480(ufv180088 tm结构域)的核苷酸序列
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[0813]