一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法与流程

1.本发明涉及基因组测序技术领域，具体而言，涉及一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法。


背景技术：

2.线粒体是细胞中提供能量代谢的重要细胞器，在生物体能量转换和新陈代谢中处于核心地位。人类体细胞中线粒体dna(脱氧核糖核酸)的突变会引起氧化磷酸化和能量供应异常，进而引起150余种人类疾病的发生，例如心血管疾病、耳聋、神经退行性疾病及衰老等。
3.线粒体dna的突变包括大片段的插入/缺失，小片段的插入/缺失，点突变等。突变可以发生在编码区，也可以发生在非编码区。目前需要快速捕获线粒体并进行高通量测序的技术不多，或者技术较为复杂。
4.现有专利cn106399553b提供的高通量测序方法通过73对引物分成4个子集分别扩增，该方法需要特定的核酸外切酶消化单链dna，引物二聚体，再通过连接酶连接构建测序文库，操作复杂，且需要平均300mbp的数据量才能达到较高的测序深度和序列覆盖度，测序成本大。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法以精简操作步骤，满足较少数据量条件下也能获得更高的测序深度，降低测序成本。甚至对于低质量的ffpe样品也能满足高通量测序需求。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种线粒体全基因组测序的引物集，其包括：至少两个引物子集，引物集包括如seq id no.1-202所示的101对引物。
9.发明人设计合成了多重扩增的引物，该多重扩增引物设计原则如下：
10.(1)引物退火温度tm值范围58-64摄氏度；
11.(2)扩增产物长度分布在140-260bp之内；
12.(3)引物之间不会形成二聚体；
13.(4)覆盖线粒体序列全长。
14.通过设计上述101对引物，可以实现人线粒体全长的覆盖，覆盖率达99.8％以上。意味着在极少的数据量下，即可获得更高的测序深度，降低测序成本。
15.上述扩增引物可以降低模板使用量，可以稳定检测低至10ng的样品，甚至低质量的ffpe样品也可以。另外，本发明提供的引物集，产生的扩增产物长度较小(扩增产物仅为300bp左右)，可以兼容主流的illumina测序平台的pe150以上测序读长，方便测序。
16.上述设置至少两个引物子集可以保证扩增产物的片段不会参差不齐，片段长度差
异性过大导致扩增效率下降。同时也避免引物间隔太近，导致扩增产物长度差别太大，并进一步形成非特异性扩增。引物子集也可根据需要进行设置多个，只要满足相同引物子集内的各引物对之间没有重叠即可。例如设置2-10个子集。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，上述引物集包括2个、3个或4个引物子集。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，上述引物集包括如seq id no.1-102所示的第一引物子集和如seq id no.103-202所示的第二引物子集。
19.发明人发现，当引物子集为两个时，既能减少扩增的次数，两个子集相较于3个或4个子集等方式扩增次数分别减少了1次或2次，还能满足较高的人线粒体全长覆盖度。
20.在其他实施方式中，当引物集为4个引物子集时，可选择的从上述第一引物子集中拆分出两个引物子集，从第二引物子集中拆分出两个引物子集，从而以4个引物子集进行pcr扩增，扩增结束后混匀扩增产物，其效果也是可以预期的。
21.此外，引物集也可以是3个、6个等数目的引物子集，并不限于上述列举的情形。
22.在本发明应用较佳的实施方式中，在同一引物子集内的任意两个引物对的扩增产物互不重叠；这样设置以防止同一子集内序列重叠导致重叠部分的扩增产物过长，影响整体扩增反应的扩增效率。
23.在一种可选的实施方式中，用某一引物子集产生的任一个扩增产物与其他子集的一个或多个扩增产物存在重叠区。
24.例如当存在两个引物子集时，任一个扩增产物与其他子集的1个或2个扩增产物存在重叠区。
25.本发明还提供了一种pcr扩增体系，其包括上述的引物集。
26.上述pcr扩增体系可以是一种包括引物集的扩增试剂。
27.在本发明应用较佳的实施方式中，上述pcr扩增体系还包括缓冲体系，引物集位于缓冲体系中。缓冲体系包括：缓冲液、扩增酶、dntp、冻干保护剂等。
28.在一种可选的实施方式中，每一个引物子集对应一个缓冲体系。
29.本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的引物集。
30.在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括用于扩增的试剂，包括缓冲剂、扩增酶、氯化镁等。
31.在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的引物集包括如seq id no.1-102所示的第一引物子集和如seq id no.103-202所示的第二引物子集。
32.第一引物子集中seq id no.1-100所示的引物的浓度为c1，seq id no.101-102所示的引物的浓度为c2，第二引物子集中seq id no.103-104所示的引物的浓度为c3，seq id no.105-200所示的引物的浓度为c4，seq id no.201-202所示的引物的浓度为c5。
33.例如c1、c2、c3、c4、c5的摩尔浓度分别为10um、20um、20um、10um和20um。
34.上述摩尔比为本发明优化后的摩尔比混合比例，在上述混合比例下可以更进一步提高各引物子集的扩增效率。
35.如上述引物集、pcr扩增体系或试剂盒在人线粒体全基因组高通量测序中的应用。
36.本发明还提供了一种人线粒体全基因组高通量测序的方法,方法包括步骤：
37.利用上述引物集，对待测的基因组dna样品进行pcr扩增，从而获得不同引物子集的扩增产物的混合物，进行测序分析，且的方法是非疾病的诊断和非疾病的治疗性方法。
38.相比cn106399553a专利，本发明提供的测序方法不需要酶切，连接建库，而是通过一次pcr扩增即可获得高通量测序文库。操作更简便，最快4小时即可完成文库构建，另外，样品dna以及试剂消耗也更少，成本更低。
39.在一种可选的实施方式中，将不同引物子集的扩增产物进行等摩尔量混合，经过第二轮扩增加上接头、index序列后上机测序分析。
40.待测的样本包括不限于：血液、ffpe样品、毛发和唾液。
41.ffpe样品是指：福尔马林固定、石蜡包埋的样本，是医学领域常见的生物材料。
42.本发明具有以下有益效果：
43.本发明提供了一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法。通过101对引物，可以实现人线粒体全长的覆盖，覆盖率达99.8％以上。意味着在极少的数据量下，即可获得更高的测序深度，降低测序成本。上述扩增引物可以降低模板使用量，甚至对于低质量的ffpe样品也能满足高通量测序需求。另外，本发明提供的引物集，产生的扩增产物长度较小(扩增产物仅为300bp左右)，可以兼容主流的illumina测序平台的pe150以上测序读长，方便测序。
附图说明
44.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
45.图1为本发明提供的高通量测序的方法的整体流程图；
46.图2为pcr多重扩增引物集设计示意图；
47.图3为实施例1中第一轮pcr的电泳图；
48.图4为实施例1中第二轮pcr的电泳图；
49.图5为实施例2中第一轮pcr的电泳图；
50.图6为实施例2中第二轮pcr的电泳图。
具体实施方式
51.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
52.pcr多重扩增引物集的设计示意图参照图2所示，101对引物均布于16000bp的人线粒体基因组全长上。根据引物编号奇数、偶数规则将101对引物分成a，b两组引物池。从而避免引物间隔太近，导致扩增产物长度差别太大，并进一步形成非特异性扩增。
53.a组即对应第一引物子集(奇数集，图2所示1,3,5,7
……
101)，b组即对应第二引物子集(偶数集，图2所示2,4,6,8
……
100)。
54.而多重扩增引物设计原则为：
55.(1)引物退火温度tm值范围58-64摄氏度；
56.(2)扩增产物长度分布在140-260bp之内；
57.(3)引物之间不会形成二聚体；
58.(4)覆盖线粒体序列全长。
59.第一引物子集中seq id no.1-100所示的引物的浓度为c1，seq id no.101-102(对应图2所示数字101)所示的引物的浓度为c2，第二引物子集中seq id no.103-104(对应图2所示数字2)所示的引物的浓度为c3，seq id no.105-200所示的引物的浓度为c4，seq id no.201-202(对应图2所示数字100)所示的引物的浓度为c5。本实施例中，c1、c2、c3、c4、c5的摩尔浓度分别为10um、20um、20um、10um和20um。
60.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
61.实施例1
62.本实施例提供了针对人血液样本的线粒体全基因高通量测序方法。整体流程图参照图1所示。
63.(1)随机选取人血液2份，采用ezup柱式血液基因组dna抽提试剂盒(b518253)抽提dna。
64.(2)设计并合成上述引物集(共计101对)，按照c1、c2、c3、c4、c5的摩尔浓度分别为10um、20um、20um、10um和20um混合成a，b两个引物池。引物合成纯化方式为hplc方式。
65.(3)进行第一轮多重pcr扩增：
66.pcr反应体系(a，b相同)：
[0067][0068]
pcr反应程序(a，b相同)：
[0069][0070]
使用ampure xp磁珠纯化回收第一轮扩增产物(长度范围300bp左右)，并等摩尔量混合。
[0071]
第一轮扩增产物的电泳图参照图3所示，从左至右分别为样本mito-1,mito-2和marker。目标条带约300bp。
[0072]
(4)以上一步混合好的dna为模板进行第二轮扩增。
[0073]
第二轮扩增引物如下
[0074]
p7：caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtgactggagttccttggcacccgag。
[0075]
p5：aatgatacggcgaccaccgagatctacacxxxxxxxxacactctttccctacacgacgctcttccgatc。
[0076]
其中斜体x表示index序列，用于区分不同样品数据。可参照illumina平台使用的index序列。上述index序列是可以随机的8碱基。
[0077]
第二轮扩增体系如下：
[0078][0079]
pcr反应程序如下：
[0080][0081]
使用ampure xp磁珠纯化回收第二轮扩增产物，长度约400bp左右。第二轮扩增产物电泳检测结果参照图4所示，从左至右分别为样本mito-1,mito-2和marker。目标条带约400bp。
[0082]
回收产物经浓度、长度检测合格后，用illumina miseq仪器测序，测序模式pe300。
[0083]
测序数据及比对分析结果如下表所示：
[0084]
样品名称reads_nummapped_target_nummapped_target_ratioaverage_depthcoveragemito-132682431897297.62678.23100％mito-211844011644898.32984.39100％
[0085]
实施例1的测序数据表明，本发明提供的针对线粒体全基因高通量测序方法可以在较少的数据量下获得较高的测序深度，降低测序成本。
[0086]
实施例2
[0087]
本实施例随机选取人ffpe样品(来源于馈赠)2份，采用ezup柱式石蜡切片基因组dna抽提试剂盒(b518269)抽提dna。
[0088]
(1)利用实施例1合成的上述101对引物，按照c1、c2、c3、c4、c5的摩尔浓度分别为10um、20um、20um、10um和20um混合成a，b两个引物池。
[0089]
(2)进行第一轮多重pcr扩增：
[0090]
第一轮多重pcr扩增的反应体系如下(a，b引物池相同)：
[0091][0092]
pcr反应程序如下(a，b引物池相同)：
[0093][0094]
使用ampure xp磁珠纯化回收第一轮扩增产物(长度范围300bp左右)。第一轮扩增
产物的电泳图参照图5所示，从左至右分别为样本ffpe1,ffpe2和marker。目标条带约300bp。
[0095]
产物等摩尔量混合。
[0096]
(3)以上一步混合好的dna为模板执行第二轮扩增，第二轮扩增引物参照实施例1，扩增体系如下：
[0097][0098]
pcr反应程序如下：
[0099][0100]
使用ampure xp磁珠纯化回收第二轮扩增产物，长度约400bp左右。第二轮扩增产物的电泳图参照图6所示，从左至右分别为样本ffpe1,ffpe2和marker。目标条带约400bp。
[0101]
回收产物经浓度、长度检测合格后，用illumina miseq仪器测序，测序模式pe150。
[0102]
测序数据及比对分析结果如下表所示：
[0103][0104][0105]
实施例2的测序数据表明，本发明提供的针对线粒体全基因高通量测序方法可以降低模板使用量，可以稳定检测低质量的ffpe样品，具有良好的应用前景。由于扩增产物较小，可以兼容主流的illumina测序平台的pe150以上测序读长，方便测序。
[0106]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。