一种抗体的纯化方法与流程

一种抗体的纯化方法
发明领域：
1.本技术属于生物制品领域，具体地，本技术提供了一种抗体纯化方法。


背景技术：

2.抗体长期以来一直用于研究中，并广泛用于诊断；特别是小鼠血清igg抗体广泛应用于心血管疾病诊断、肿瘤诊断、传染病诊断等。
3.多克隆抗体纯化方法比较多，主要有硫酸铵沉淀、辛酸-硫酸铵沉淀，硫酸铵沉淀-分子筛层析，离子交换层析、疏水层析，proteina亲和层析及抗原亲和纯化。由于硫酸铵沉淀中多次涉及到离心且纯化步骤费时，在工业生产上难以放大，且得到的抗体纯度低，特异性差，而分子筛层析规模难以放大，离子交换层析特异性差，需要多步离子层析过程，步骤繁琐，得到的抗体特异性低，抗原亲和纯化需要大量的抗原，难以放大，因此都没有得到广泛的使用。proteina亲和层析对抗体的抗体亲和力高，特异性强，操作简单，但是对特定来源的igg，比如和小鼠的igg1、igg2a结合力低。相比于protein a，protein g对于大多数哺乳动物的igg有着更高的亲和力，尤其是对于igg亚基，如人igg3，小鼠igg1和鼠igg2a，纯化出的igg组份更全面。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供小鼠血清抗体的纯化方法，以解决现有技术中存在的纯化工艺步骤多，成本高、纯度低等技术问题。
5.为了实现发明的上述目的，一方面，本技术提供了一种抗体的纯化方法，包括如下步骤：
6.将待处理样品进行深层过滤和亲和层析、超滤浓缩和透析。
7.进一步地，所述亲和层析纯化包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，采用所述平衡缓冲液、冲洗层析柱至基线平稳，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；
8.进一步地，所述平衡缓冲液选自ph7.0～8.0的磷酸缓冲液，tris缓冲液，ph4.5～5.5的naac～hac缓冲液中的一种；优选地，所述磷酸缓冲液的浓度为10mm～100mm，naac～hac缓冲液的浓度为50-100mm，tris缓冲液的浓度为10mm～100mm。
9.进一步地，所述平衡缓冲液选自缓冲液a～缓冲液c中一种：
10.缓冲液a：ph7.0-8.0,含50～150mm的nacl的10～100mm磷酸缓冲液；
11.缓冲液b：ph7.0-8.0，含50～150mm的nacl的10～100mmtris缓冲液；
12.缓冲液c:ph4.5～5.5,含50～150mm的nacl的50～100mm naac～hac缓冲液。
13.进一步地，所述洗脱缓冲液选自ph2.5～3.5的甘氨酸缓冲液，ph3.0～4.0柠檬酸钠缓冲液中的至少一种；优选地，所述甘氨酸缓冲液的浓度为50mm～1000mm，柠檬酸缓冲液的浓度为20mm～100mm。
14.进一步地，所述洗脱缓冲液选自缓冲液d～缓冲液e中一种：
15.缓冲液d：ph2.5～3.5、50mm～1000mm甘氨酸缓冲液；
16.缓冲液e：ph3.0～3.5、20mm～100mm柠檬酸钠缓冲液；
17.进一步地，调节所述洗脱的线性流速使目的蛋白的保留时间为5～10min。
18.进一步地，所述洗脱液的用量为5～8cv；优选地，所述亲和层析的填料为protein g。
19.进一步地，采用ph调节剂调节所述目标抗体洗脱液的ph到7.2～7.6；优选地，所述ph调节剂为tris缓冲液，缓冲液的浓度为0.5m～1m，缓冲液的ph为8.0～9.0。
20.进一步地，所述深层过滤中，采用平衡缓冲液将深层过滤器中的料液置换出。
21.进一步地，所述超滤浓缩和透析中使用膜包超滤透析，膜包的材质为pes或再生纤维素；优选地，膜包的分子量为30kd。
22.另一方面，本技术还提供了上述方法在诊断试剂、生物原材料，生物大分子制备中的应用。
23.本技术中所述待处理样品包括但不限于血液、血浆、血清。
24.本技术的方法可用于纯化天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；优选igg抗体。
25.本技术的深层过滤器和超滤膜可以选用各种市售产品，只要其过滤大小、分子量等指标符合本技术的要求即可。
26.深层过滤器主要以纤维素纤维加硅藻土等助滤剂做过滤介质。纤维素组成了滤芯中的网状结构，纤维之间的空隙用于捕捉料液中的颗粒，随着过滤的进行，颗粒堆积在表面形成滤饼，会提高过滤的效率。同时随着滤饼越来越厚，也会降低过滤的速度。在纤维中加入硅藻土，可以提高在形成滤饼后的过滤速度。深层过滤介质的第三个组分是树脂，它有2方面的作用，一是粘结纤维，二是提供过滤介质表面的正电荷。这些正电荷可以吸附带负电、比过滤孔径小很多的细胞碎片等杂质。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
27.(1)本发明的抗体纯化的方法，通过采用深层过滤工艺、配合亲和层析纯化和切向流透析，可显著去除宿主蛋白、dna、以及多聚体等杂质。达到与现有技术中亲和层析 深层过滤 阴离子交换 阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高样品产率。
28.(2)采用本发明的抗体纯化方法，可使样品sds-page纯度达到99％以上，符合最终的质量要求。
附图说明
29.图1.实施例1不同条件制备的小鼠igg样品sds-page检测结果；
30.图2.实施例2-4制备的小鼠igg样品sds-page检测结果；
31.图3.不同厂家亲和层析填料纯化小鼠igg样品的sds-page检测结果，bgl:博格隆，lx：蓝晓，hy：汇研，qc：千纯，td：天地人和，nw：纳微；
32.图4.不同厂家小鼠igg样品sds-page检测结果；a：本公司小鼠igg，b：金斯瑞小鼠igg，c：原谷小鼠igg，d：sigma小鼠igg。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例详述本发明，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。
34.实施例1
35.条件a:
36.(1)用6cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph5.0的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein a(赛分科技)，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用0.1m甘氨酸ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
37.条件b:
38.(1)采用2cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph5.0平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
39.(2)用6cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph5.0的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein a，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用0.1m甘氨酸ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
40.(3)将(2)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包10min，将冲洗液合并到透析液中。
41.条件c:
42.(1)采用2cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph5.0平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
43.(2)用6cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph5.0的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein a，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用0.1m甘氨酸ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
44.(3)将(2)中得到的层析洗脱液，用1m tris ph9.0进行中和，调节样品ph到7.2～7.6。
45.(4)将(3)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包10min，将冲洗液合并到透析液中。
46.实施例2
47.(1)采用2cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
48.(2)用6cv的100mm naac～hac，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein g，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用0.1m甘氨酸ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫
外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
49.(3)将(2)中得到的层析洗脱液，用1m tris ph9.0进行中和，调节样品ph到7.2～7.6。
50.(4)将(3)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包10min，将冲洗液合并到透析液中。
51.实施例3
52.(1)采用2cv的20mm tris，150mm nacl ph7.4平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
53.(2)用6cv的20mm tris，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein g，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用0.1m甘氨酸ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
54.(3)将(2)中得到的层析洗脱液，用1m tris ph9.0进行中和，调节样品ph到7.2～7.6。
55.(4)将(3)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包10min，将冲洗液合并到透析液中。
56.实施例4
57.(1)采用2cv的20mm磷酸缓冲液，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
58.(2)用6cv的20mm磷酸缓冲液，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein g，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。将(1)中得到的样品进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用20mm柠檬酸钠缓冲液ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
59.(3)将(2)中得到的层析洗脱液，用1m tris ph9.0进行中和，调节样品ph到7.2～7.6。
60.(4)将(3)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包10min，将冲洗液合并到透析液中。
61.实施例1实验结果：
62.图1为不同实验条件的sds-page电泳图谱
63.表1.不同实验例样品纯度及回收率
64.样品名称样品纯度回收率
条件a50.2％63.1％条件b62.3％54.2％条件c94.0％60.8％
65.其中样品纯度计算方式为:使用莫纳公司的gelanalyzer分析软件对sds-page电泳图片进行分析，求得各条带的光密度，计算目的条带占总蛋白条带光密度的百分比即为样品纯度。
66.样品回收率为最终样品的抗体浓度乘以体积得到总抗体质量，除总样品的中抗体总质量，即为抗体的回收率。
67.实施例1，条件a、b、c可以纯化得到纯度50.2％-94.0％以上的小鼠igg，回收率在54.2％-63.1％之间。
68.实施例2-4实验结果：
69.图2为不同实验例的sds-page电泳图谱
70.表2.不同实验例样品纯度及回收率
71.样品名称样品纯度回收率实施例299.2％83.2％实施例399.3％84.3％实施例499.6％82.4％
72.其中样品纯度计算方式为:使用莫纳公司的gelanalyzer分析软件对sds-page电泳图片进行分析，求得各条带的光密度，计算目的条带占总蛋白条带光密度的百分比即为样品纯度。
73.样品回收率为最终样品的抗体浓度乘以体积得到总抗体质量，除总样品的中抗体总质量，即为抗体的回收率。
74.实施例2-4可以纯化得到纯度99％以上的小鼠igg，说明实验工艺稳健性好，不同盐浓度均能达到良好的纯化效果。特别是实施例4的方法在纯度上进一步超过其他实施例，达到了市面上少见的99.5％以上。
75.实施例5
76.(1)采用2cv的20mm磷酸缓冲液，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液冲洗深层滤器，平衡后进行上样，监控样品的浊度和过滤压力，控制压力低于3bar，浊度低于50ntu，过滤后用等体积平衡缓冲液稀释样品。
77.(2)用6cv的20mm磷酸缓冲液，150mm nacl ph7.4的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为protein g，层析柱规格为16
×
25mm，体积5ml。填料分别为蓝晓、博格隆、汇研、千纯、纳微、天地人和的rprotein g 4ff。将(1)中得到的样品分别进行上样，再用15cv的平衡液进行冲洗，最后用20mm柠檬酸钠缓冲液ph3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mau时开始收集，紫外值降低到30mau时停止收集。
78.(3)将(2)中得到的层析洗脱液，用1m tris ph9.0进行中和，调节样品ph到7.2～7.6。
79.(4)将(3)中得到的样品用于透析，透析膜包材质为再生纤维素，膜孔径为30kd，用5倍系统体积的pbs溶液循环冲洗膜包系统10～15min，然后将层析洗脱液浓缩2倍后进行透析，透析6次，控制回流端压力为2～2.5bar，透析完成后用1.5倍工作体积循环冲洗膜包
10min，将冲洗液合并到透析液中。
80.实验结果：从图3中可以看出，各个厂家间填料回收率区别很大，其中蓝晓、千纯、纳微三家的rprotein g 4ff填料的结果相当，纯度和回收率都较高。
81.实施例6
82.将本公司实施例1产品与金斯瑞、原谷、sigma的同类小鼠igg产品进行比较，将样品都稀释到1mg/ml，95℃处理5min后，跑sds-page电泳进行比较，结果如图4所示:
83.从上述结果可知，本发明的抗体纯化方法，通过采用一定的深层过滤、亲和层析、超滤透析方式，可显著去除宿主蛋白及多聚体等杂质，达到甚至超过现有厂家公司产品的质量，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品的收率和纯度。
84.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。