极端嗜盐曲霉C6-like锌指蛋白编码基因及其应用的制作方法

极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因及其在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。


背景技术：

2.土壤盐碱化是一种渐变性地质环境问题，主要是由干旱气候、地形地貌以及人类对水土资源的不合理利用引起。据报道，全球有9.5亿公顷盐碱土地，我国盐碱地约1亿公顷，其中盐碱耕地达920万公顷，每年直接造成的经济损失超过千亿美元。土壤盐碱化引起植物生理干旱、影响营养物吸收，危害作物生长及产量。利用基因工程技术提高植物的耐盐性是生态修复盐碱化土壤的重要途径。
3.目前，利用基因工程方法提高植物耐盐性的研究取得了一定的进展，通过抗性基因转化在一定程度上提高了植物耐盐性。如翟红红分别用ahcmo-ahbadh双基因、ahcmo和ahbadh单基因分别构建转基因烟草。对转基因植株进行nacl处理，结果表明转基因植株长势优于野生型植株，转基因植株的根长、侧根数和鲜重均比野生型植株有所提高。
4.锌指蛋白是一类含有通过结合zn
2
稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的蛋白质，该蛋白在基因的表达调控，细胞分化调节以及植物抗逆性胁迫响应等多个方面均发挥着重要的作用。目前，关于此类研究主要是从较低盐度下生长的植物中获取具有耐受能力的锌指蛋白表达基因，如teng等从结缕草中分离出的c2h2型锌指蛋白zjzfn1在拟南芥中过表达，虽然与野生型相比，转基因拟南芥的种子萌发率提高，绿色子叶的百分比增加，植株的耐盐胁迫能力增强，但是由于是从较低盐度下生长的植物中提取的基因，其对耐盐胁迫能力的提高是有限的。
5.油菜是我国重要的油料作物，是食用植物油的主要来源。目前我国食用油脂供给严重不足。如何获得新型耐盐转基因油菜植株，开发利用盐碱土地资源，对于提高油菜产量具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因及其应用，通过将极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因转入植物中，能提高植物耐盐胁迫能力。
7.本发明是通过以下技术方案来实现：
8.一种极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.一种所述的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.一种含所述的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因的表达载体。
11.优选的，所述表达载体由c6-like锌指蛋白编码基因与载体pbwa(v)hs连接得到。
12.一种含所述表达载体的细胞。
13.一种含所述的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因的宿主菌。
14.优选的，所述宿主菌为农杆菌。
15.所述的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因在提高植物耐盐性中的应用。
16.优选的，所述应用包括以下步骤：
17.1)构建含极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因的表达载体；
18.2)将所构建的表达载体转化到植物或植物细胞中；
19.3)培育步骤2)所得植物或植物细胞，筛选得到耐盐性提高的转基因植物。
20.优选的，所述的植物为油菜。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
22.本发明以极端嗜盐曲霉(aspergillus montevidensis zyd4)为材料，提取、扩增得到一种极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因，将该编码基因转入植物中。因为本发明是从高盐状态下生长的极端微生物中获取的耐盐基因，其转基因植物更加能适应高盐状态的环境。本发明研究表明，在nacl模拟盐胁迫下，过表达极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因的植物在长度、重量及种子干重上明显优于野生型植物，耐盐能力明显增强，表明本发明提供的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因在提高植物耐盐碱方面的具有重要作用，为植物抗逆改良提供了重要基因资源，在利用基因工程植株生态修复盐碱土地方面具有重要意义。
附图说明
23.图1为基于cdna序列构建的系统发育树；
24.图2为基于氨基酸序列构建的系统发育树；
25.图3为c6-like锌指蛋白编码基因pcr反应扩电泳照片；其中m为dl6000dna marker，c6-like为c6-like锌指蛋白编码基因pcr产物；
26.图4为转基因油菜成熟植株图；
27.图5为不同盐浓度下转基因油菜植株株高分析图；
28.图6为不同盐浓度下转基因油菜植株生物量分析图；
29.图7为转基因油菜种子干物质重量分析图。
具体实施方式
30.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
31.本发明以极端嗜盐曲霉(aspergillus montevidensis zyd4)为材料，提取rna，利用rt-pcr扩增基因片段，目的cdna片段长度为1896bp，如seq id no.1所示，编码631个氨基酸，如seq id no.2所示。
32.由在线生物学软件分析得知，极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因对应目标蛋白质的长度应为631，分子量为73kda，预测等电点为6.45。
33.将其cdna序列与genbank数据库数据进行比较分析显示，该基因序列依次同a.glaucus cbs 516.65、a.sclerotioniger cbs 115572、a.ibericus cbs 121593、
a.steynii ibt 23096菌株c6锌指蛋白基因的同源性在87.6％～71.72％之间。下载同源性较高的序列数据构建发育树的图，结果参照图1。其中目标菌株a.montevidensis zyd4的c6-like锌指蛋白编码基因与a.glaucus cbs 516.65形成一个独立分支，具有较高的同源性，步长值达96％。
34.极端嗜盐曲霉c6锌指蛋白基因对应氨基酸序列与genbank数据库数据比对结果显示，该基因的氨基酸序列同a.ruber cbs135680、a.glaucus cbs 516.65、a.wentii dto 134e9、a.phoenicis atcc 13157等菌株c6锌指蛋白氨基酸序列同源性较高。下载同源性较高的序列数据构建发育树的图，结果参照图2。目标菌株a.montevidensis zyd4的c6-like锌指蛋白编码基因与a.ruber cbs 135680和a.glaucus cbs 516.65亲缘关系最接近，形成的步长值88％的独立分支，而三者共同构成一个较大分支，步长值达到100％。
35.本发明将获得的极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因与表达载体pbwa(v)hs连接构建得到原核表达载体pbwa(v)hs-c6-like，转入大肠杆菌中，经过筛选验证，再转化过表达载体到农杆菌gv3101中，后侵染油菜外植体获得转基因油菜植株。
36.本发明对过表达c6-like锌指蛋白编码基因的油菜在不同盐浓度(0mm、60mm、120mm、240mm)进行栽培试验，通过对油菜植株长度(根 茎)、重量及种子干重进行测定，结果表明，极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因过表达可显著提高油菜在盐碱土壤的耐盐性，分别如图5-7所示。
37.实施例1极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因过表达载体pbwa(v)hs-c6-like的构建
38.1.扩增目的片段
39.(1)扩增极端嗜盐曲霉c6-like锌指蛋白编码基因引物序列：
40.c6-f1：
[0041]5’‑
atatacacacatttacaatgcttattaagaacagacgtctaca-3’[0042]
c6-r1：
[0043]5’‑
ggcgaagaagtccaaagctttatccaggcatgcatgagttat-3’[0044]
将合成的引物稀释成终浓度为10μmol/l的储藏液。
[0045]
(2)模板cdna交由公司进行合成，扩增体系如下：
[0046]
cdna1ulpremix taq
tm
12.5ulc6-f11ulc6-r11ulh2o9.5ul
[0047]
将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入pcr仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始pcr扩增。
[0048]
(3)pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳，待凝胶成像后，结果参照图3，扩增产物大约在1900bp处出现条带，其中m为dna标准分子量(m为dna标准分子量：6000，4000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，100bp)。将含有目的cdna片段的凝胶切割收集，并借助dna凝胶回收试剂盒回收纯化待用。
[0049]
2.c6-like目的片段和载体pbwa(v)hs的双酶切
[0050]
(1)用限制性内切酶bsai和eco31i进行双酶切。
[0051]
载体pbwa(v)hs酶切体系如下：
[0052]
载体6ulbuffer2ulbsai1uleco31i1ulh2o10ul
[0053]
c6-like目的片段酶切体系如下：
[0054][0055][0056]
于37℃酶切约1h。
[0057]
(2)将载体酶切物和目的片段酶切产物分别用pcr纯化试剂盒纯化。
[0058]
3.过表达载体pbwa(v)hs-c6-like的重组构建
[0059]
体系如下：
[0060][0061]
于pcr仪中37℃孵育30min，置于冰浴中冷却。
[0062]
4.转化
[0063]
(1)将感受态细胞dh5α置于冰上待其自然解冻后，取10μl过表达载体pbwa(v)hs-c6-like加入感受态细胞中于冰上放置15min。
[0064]
(2)之后于42℃水浴中热激45s，热激转化，然后迅速置于冰上(4℃)放置5min。
[0065]
(3)加入300μl不含抗生素的lb液体培养基，于37℃、180rpm振荡培养1h。
[0066]
(4)将活化培养处理后的感受态细胞，接种于含卡那霉素(30μg/ml)的lb固体培养
基平板上，将培养皿倒置于37℃环境中培养12h，得到过表达载体pbwa(v)hs-c6-like-osgfp。
[0067]
实施例2过表达载体pbwa(v)hs-c6-like-osgfp转化至农杆菌(1)使用的农杆菌菌株为gv3101。采用的是液氮冻融法将构建好的过表达载体pbwa(v)hs-c6-like-osgfp转入农杆菌。
[0068]
具体操作如下：
[0069]
1)取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上融化。
[0070]
2)每100μl感受态加入0.01-1μg质粒dna(过表达载体pbwa(v)hs-c6-like-osgfp)，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。
[0071]
3)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2～3h。
[0072]
4)6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养48h。
[0073]
5)pcr检测阳性克隆，4℃保存备用。
[0074]
实施例3农杆菌侵染油菜
[0075]
1.制备油菜外植体
[0076]
挑选油菜种子进行消毒，将消毒后的油菜种子接种于ms培养基上，生长7d获得油菜无菌苗，待幼苗下胚轴长到瓶口时，用镊子取出无菌苗，切除子叶柄及子叶尖，下胚轴切成1到2cm的小段段作为外植体，放置于预培培养基上。
[0077]
2.浸染
[0078]
将pcr检测的阳性克隆农杆菌，摇菌至od
600
0.8时，将预培养2-3d的油菜外植体置于农杆菌悬浮液中侵染10min，将侵染后的油菜外植体放于滤纸板上晾干，置于共培培养基上，共培2d，再将外植体转入延筛培养基上，培养7d。
[0079]
3.愈伤的诱导及筛选
[0080]
挑选有效愈伤组织转移至含有潮霉素的筛选培养基，筛选15d左右，共筛选2到3次。
[0081]
4.分化及生根
[0082]
将生长旺盛的阳性愈伤组织转移到分化培养基上，待其分化出幼苗，将分化出来的幼苗转移到生根培养上生根7-10d，获得阳性植株。
[0083]
5.检测
[0084]
将已经长根的幼苗进行标号，各取0.5cm2的油菜叶片，磨样，吸取磨样液作为dna模板进行pcr扩增，跑琼脂糖凝胶电泳，判断阳性幼苗以及阳性率。对阳性幼苗持续培养，得到含c6-like锌指蛋白编码基因的转基因植株，参照图4所示，植株生长状态良好，根部分支多，茎干粗壮，叶片肥大。
[0085]
实施例3转基因油菜耐盐胁迫功能的研究
[0086]
将转基因油菜与野生型油菜分别栽培在盐浓度为0mm、60mm、120mm、240mmnacl的土壤中并于20℃光照(18000lx)培养60d，再对每个植株分别进行株高及重量测定，最终收集油菜种子并测定种子的干物质含量。
[0087]
以土壤不同盐胁迫下对油菜株高绘制柱形图，结果如图5所示，转基因油菜在不同盐浓度下植株高度均高于野生型油菜，且在含240mm的高盐浓度下转基因植株生长优势明
显。
[0088]
以土壤不同盐胁迫下对油菜植株鲜重绘制柱形图，结果如图6所示，在不同盐浓度下，转基因油菜生长状况保持稳定，而野生型油菜在高盐浓度下植株重量明显下降。
[0089]
以土壤不同盐胁迫下对油菜种子干物质含量绘制柱形图，结果如图7所示，可以看出，转基因油菜的种子质量明显优于野生型油菜。