一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物

1.本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物。


背景技术：

2.粗毛纤孔菌(inonotus hispidus)属于担子菌门的纤孔菌属大型食药用真菌，它是唯一符合我国古籍中关于“桑黄”描述的菌种。“桑黄”的药用价值在我国中医典籍中早有记载，从东汉时期的《神农本草经》至明代李时珍所著的《本草纲目》。它不仅清热解毒，还能活血化瘀，同时对人体补虚益气的方面也有良好功效，可治经闭、血崩、血淋、气虚血虚等症。近些年，国内外研究分别发现野生或人工栽培粗毛纤孔菌其具有抗衰老、提高免疫力、抗病毒、降血脂、活血化瘀等广泛的生物活性，具有极高的医疗应用前景。但野生粗毛纤孔菌随着采集而逐渐减少，导致粗毛纤孔菌资源短缺，价格高昂；而人工栽培粗毛纤孔菌获得子实体的方法用时长，且对资源的消耗较大，所以液态发酵技术受到更多的关注。目前液体发酵的菌株是由野生菌株鉴定分离，不同的菌株存在较大的遗传差异，对培养基的选择和利用各有不同，导致发酵代谢产物种类、含量和活性差异巨大。因此，筛选高活力的粗毛纤孔菌菌株并对发酵条件进行优化调控对于其液体发酵工程非常关键。
3.粗毛纤孔菌属于丝状真菌，在液体发酵生产过程中，常采用琼脂块作为菌种接种。这种情况下，菌丝会呈现紧密的团块状并不断增大，在团块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成团块内部菌丝体发生自溶现象。此外，菌丝易于依附着摇瓶的玻璃内壁向上攀附生长，导致其生长过程中对营养物质的利用有限且仅有少量活性产物分泌到液体培养液中。菌丝球团聚和贴壁生长的问题也发生在这株粗毛纤孔菌发酵培养阶段，这导致发酵周期长、产物代谢产量低、活性不高，因此需要对发酵条件和接种方式进行优化调控。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术存在的不足，旨在提供一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物。
5.一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法，包括以下步骤：
6.平板培养：将活化后的粗毛纤孔菌菌种接种至琼脂平板培养基(pda)中培养；
7.培养基配制：碳源培养基配方：碳源5～20g/l，酵母浸粉5～20g/l，磷酸二氢钾0.5～5g/l，硫酸镁0.1～2g/l，氮源培养基配方：麦芽糖5～20g/l，氮源5～20g/l，磷酸二氢钾0.5～5g/l，硫酸镁0.1～3g/l；
8.菌丝分散：平板培养得到的琼脂块作为菌种，接种到上述碳源培养基和/或氮源培养基中，培养至菌丝球生成，对含有上述菌丝球的液体培养进行高速剪切破碎，最终得到含有分散菌丝的菌悬液；
9.菌丝接种与液体发酵培养：根据吸光值调整破碎后菌悬液的浓度，再将菌悬液接
种至上述培养基，并向其中加入麦麸得到接种后的培养液，进行液体发酵培养。
10.所述粗毛纤孔菌选自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为cgmcc3.15188。
11.优选的，所述活化后的粗毛纤孔菌菌种通过以下方法得到：将麦芽汁培养基，与冻干菌粉混合，使冻干菌体溶解成悬浮状，然后将菌体悬液移植于固体培养基，挑选出生长茁壮的菌落，接种到新的固体培养基中培养，从而得到生长良好的菌种。其中固体培养基组成包括葡萄糖5～15g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母浸粉1～10g/l,琼脂10～30g/l。
12.所述麦芽汁培养基的用量满足将冻干菌粉溶解即可。
13.优选的，平板培养步骤中，所述培养的条件为在22～28℃下避光培养8～10d。
14.优选的，培养基配制步骤中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉中的至少一种，所述氮源为酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粉饼、尿素中的至少一种。
15.优选的，培养基配制步骤中，碳源培养基配方：碳源10～15g/l，酵母浸粉10～15g/l，磷酸二氢钾0.5～3g/l，硫酸镁0.1～1g/l；氮源培养基配方：麦芽糖5～15g/l，氮源5～15g/l，磷酸二氢钾0.5～3g/l，硫酸镁0.1～1g/l。
16.优选地，培养基配制完成后，进行高压灭菌，冷却至常温备用。
17.优选的，菌丝分散步骤中，所述琼脂块是于平板培养中菌落近边缘打孔，得到带有菌丝的琼脂块；
18.优选的，菌丝分散步骤中，培养的温度为25～35℃。
19.优选的，菌丝分散步骤中，所述高速剪切时所使用的高速剪切机工作强度为5～6；高速剪切机工作时间为60～120s。
20.优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述调整后的菌悬液吸光值为0.3～0.5，更优选为0.35～0.5；若吸光值过大测需要稀释原始菌悬液后再进行接种。
21.优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述的菌悬液接种量为0.5～1％。
22.优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所用麦麸经过粉碎过筛，最终的粒径为30～50目。优选地，所用麦麸经过三次的水洗烘干处理以除去可溶性物质。
23.优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，培养液中麦麸的添加量为6～10g/l，更优选为8～10g/l。
24.优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述液体发酵培养是将得到的接种后的培养液在培养8-15d。
25.微生物细胞中的碳元素含量相当高，一般能达到菌体干重的50％左右，是菌体生长主要原材料之一，同时也是微生物代谢的主要能量来源。微生物对碳源的利用与其自身具有的酶系与代谢过程息息相关。葡萄糖虽广泛应用于发酵生产中,但葡萄糖作为速效碳源可能会抑制产物的形成，而像乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等缓慢利用的碳源可能会更适合产物的生产。与碳源类似，氮源在微生物的生长过程中也起到构成细胞结构和提供细胞生长所需要能量的作用，主要有有机氮源和无机氮源，两者在发酵过程中的性质具有较大的差异。无机氮源属于速效氮源成分较为单一，易被菌体吸收。有机氮源成分复杂，营养丰富，含有蛋白质，肽类，游离氨基酸等，常见的有机氮源有牛肉粉、蛋白胨、酵母粉等。有机氮源要被微生物分泌的蛋白酶水解后方能被吸收，进一步开始分解代谢。因此选择合适的碳源和氮源对菌丝体的生长和代谢产物积累尤为重要。
26.丝状真菌的液体菌种制备通常先将菌种活化，再转至平板培养，待菌落长好后用
打孔器于培养菌落近边缘打孔，挑取琼脂块进行液体培养。而琼脂块作为接种种子时生长点极少，致使菌丝不断围绕琼脂块向外生长，形成较大的致密菌丝球。在球块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成球块内部菌丝体发生自溶现象。此外，琼脂块之间存在一定的生长差异，难于准确控制接种量与菌种状态。为提高液体菌种生长点、便于接种以及准确控制接种量，采用物理破碎的方法可以获得大量微小的菌丝进行接种。
27.麦麸富含粗蛋白、糖分(麦芽糖、淀粉等)和维生素，因此麦麸浸汁常作为一种有机氮源添加在微生物培养基中，例如一种富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基以麸皮作为氮源。而在实验中发现麦麸在发酵过程中对菌丝起到一定的分散作用，可以减少菌丝的团聚，更易形成小型均一的菌丝球，增大菌丝与液体培养基的接触面积。同时由于麦麸的纤维结构，菌丝可以依附在麸皮颗粒上生长，充分利用液体培养基中的营养成分，而不是大量贴附在摇瓶壁上。而麦麸本身是由粗纤维构成，结构疏松，表面存在大量褶皱和蜂窝状小孔。因此，添加麦麸有利于菌丝球的分散生长，增加发酵液中代谢产物的产量。
28.本发明使用所述培养基进行粗毛纤孔菌的液态发酵，在相同培养条件下，碳源和氮源优化后胞外多糖和黄酮类物质的产量分别提升3.08倍与1.24倍；改进接种方法之后，菌丝体、胞外多糖和黄酮类物质的产量又分别提升了1.38、1.16倍与1.52倍。而添加了麦麸之后，菌丝体、胞外多糖和黄酮类物质的产量分别提升了1.23、1.23倍与1.13倍，该培养基制作简单，操作方便，生产加工成本低，生物量和多糖等活性产物产量高，便于规模化、商业化培养。
29.说明书附图
30.图1为实施例和对比例所得黄酮组分的自由基清除活性。
31.图2为实施例和对比例所得胞外多糖组分的抑制肿瘤细胞(hela)增殖活性。
32.图3为实施例和对比例所得胞外多糖的抑制肿瘤细胞(hepg2)增殖活性。
具体实施方式
33.本发明提供了一种粗毛纤孔菌培养发酵方法，下面以实施例来描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。
34.粗毛纤孔菌菌株(inonotus hispitus)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为cgmcc3.15188；麦麸购自石家庄绿湾农副产品有限公司，货号：202202250002，外观呈颗粒状，使用前进行预处理：取适量麦麸，蒸馏水浸泡一段时间，减压抽滤得到滤渣，重复三次后将滤渣放入烘箱60℃烘干，将完全干燥的麦麸放入粉碎机粉碎后过筛收集备用；高速剪切乳化机的型号为艾卡t10basic。
35.本发明中的所有原料，除有特殊说明的以外，均来自市售，且未做进一步处理，实验仪器也由市售可得。
36.以下实施例和对比例的性能测试方法：
37.1、菌丝体得率
38.发酵结束后，减压抽滤得到菌丝体。蒸馏水洗涤三次后，随机选取10个菌丝球(不
足10个的选取所有)量取直径，后放入烘箱60℃烘干称重。
39.2、多糖得率
40.取5ml发酵液，加入四倍体积无水乙醇过夜醇沉。6000r/min，离心30min后弃去上清液。用2ml蒸馏水溶解沉淀。采用苯酚-硫酸法测总糖含量，吸取2.0ml溶解液，再移入1ml的5％苯酚溶液摇晃均匀，最后加入5ml浓硫酸摇晃均匀，至水浴中冷却15min，于490nm处测定吸光度，根据标准曲线回归方程(y＝13.726x 0.0116,r2＝0.9941)得到总多糖含量。
41.3、总黄酮含量
42.取粗毛纤孔菌发酵液1ml，加入3ml 95％乙醇，在4℃条件下沉淀24h后，5000r/min，离心15min，弃去沉淀，收集上清液并取上清液1ml于试管中，各管加入0.3ml 5％亚硝酸钠(现配现用)溶液后摇匀，静置6min后加入0.3ml 10％硝酸铝溶液，摇匀后静置6min再加入4.0ml 4％氢氧化钠，各管加入42％乙醇溶液使总体积为10ml，静置30min后于510nm处测吸光度。以没食子酸为标准品，根据标准曲线回归方程(y＝1.1321x,r2＝0.9999)得到样品中总黄酮含量，结果以没食子酸当量表示，单位为mg/ml。
43.4、总多酚含量
44.取样品0.5ml于试管中，加蒸馏水至总体积5.5ml，摇匀后加入0.5ml folin-ciocalteu显色剂，摇匀后暗反应10min后再加入4.0ml 7.5％碳酸钠溶液，摇匀后暗反应1h，于765nm处测吸光度。以芦丁为标准品，根据标准曲线回归方程(y＝10.674x,r2＝0.9997)得到样品中总多酚含量，结果以芦丁当量表示，单位为mg/ml。
45.5、自由基清除活性
46.于96孔板依次加不同样品溶液20μl和150μmol/l dpph工作液180μl。空白对照和阳性对照分别为蒸馏水和0.4mg/ml的vc。振荡混匀，517nm处测定吸光度值。vc梯度浓度为12.5、25、50、100、200、400μg/ml计算对dpph清除率，公式如下：dpph清除率(％)＝(a
0-a1)/a0×
100式中，a0—空白对照的吸光度值；a1—样品的吸光度值。
47.6、抑制肿瘤细胞增殖活性
48.采用cck8比色分析法进行细胞毒性分析。取对数生长期的人宫颈癌细胞hela和人肝癌细胞hepg2细胞，0.25％胰酶消化1-2min，终止消化后分别制成细胞悬液，细胞密度为5
×
104cells/ml。在96孔细胞培养板中加入含细胞的培养液100μl，空白对照组加入等量的不含细胞的培养液，以上各组分别做3个平行的复孔，置于co2培养箱培养。细胞密度大于80％时，小心弃去原有培养液，加100μl浓度为0.1mg/ml的多糖样品，继续培养12h。而后缓慢吸出液体，每孔各加10μl cck-8，继续培养4h。酶标仪450nm处测定各孔od值，计算细胞存活率，公式如下：细胞抑制率(％)＝[od(0加药)
–
od(加药)]/[od(0加药)
–
od(空白)
×
100。
[0049]
实施例1以20g/l麦芽糖为碳源的发酵培养
[0050]
用无菌吸管吸取0.3ml适宜的麦芽汁培养基，滴入装有冻干菌粉的安瓿管内轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浮状。取约0.2ml菌体悬液移植于固体培养基，其中固体培养基组成包括葡萄糖10g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，琼脂20g/l。挑选生长茁壮的菌落，将其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤3次，从而得到生长良好的菌落并保存在斜面中，将活化后的菌种自斜面上用接种环接种至琼脂平板培养基(pda)培养中，27℃避光培养8-10d；按酵母浸粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l的比例制作碳源基础培养基，加入20g/l的麦芽糖作为碳源。将配置好的培养液倒入250ml锥形瓶中，每瓶150ml培养
基，高压灭菌锅121℃灭菌20min后冷却至常温备用。在超净工作台中，用直径为0.5cm的打孔器于菌落近边缘打孔，得到带有菌丝的琼脂块。随机挑取琼脂块作为菌种，接种到150ml液体培养基中，接种后的250ml摇瓶放在摇床中于30℃、120r/min条件下培养14天。发酵结束后按性能测试方法检测。发酵结束后，将得到的发酵液经过减压过滤，得到菌丝体和滤液，再向滤液中加入一定量无水乙醇，充分搅拌后静止沉淀一段时间，然后采用离心分离，得到的沉淀为代谢产物——胞外多糖，所得的离心液经过浓缩干燥，得到代谢产物——黄酮类物质；分别检测所分离的滤液中黄酮类物质的自由基清除活性与胞外多糖的抑制肿瘤细胞增殖活性。
[0051]
实施例2以10g/l麦芽糖为碳源的发酵培养
[0052]
在碳源基础培养基种加入10g/l的麦芽糖作为碳源。其他操作都与实施例1一致。
[0053]
实施例3以20g/l酵母浸粉为氮源的发酵培养
[0054]
按麦芽糖10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l的比例制作氮源基础培养基，加入20g/l的酵母浸粉作为氮源。其他操作都与实施例1一致。
[0055]
实施例4以10g/l酵母浸粉为氮源的发酵培养
[0056]
在氮源基础培养基种加入10g/l的酵母浸粉作为氮源。其他操作都与实施例3一致。
[0057]
实施例5
[0058]
取实例4的摇瓶在30℃、120r/min条件下摇床培养至菌丝球大量生成。将高速剪切机的剪切头提前放入高压灭菌锅灭菌，再组装到高速剪切机，并用酒精消毒后放入超净工作台紫外灭菌，对含有上述菌丝球的液体培养进行高速剪切破碎，5级高速剪切破碎60s，最终得到含有大量微小分散菌丝的菌悬液。取菌悬液稀释十倍，以空白培养液为对照在410nm处测定的吸光值为0.480。用无菌枪头吸取0.5ml的菌悬液，接种至装有150ml液体培养基的摇瓶(规格250ml)中，在30℃、120r/min条件下摇床培养10天。发酵结束后的测定与实例1一致。
[0059]
实施例6
[0060]
同实施例5，区别在于，将高速剪切机的工作强度调整到6，其他操作都与实施例5一致。
[0061]
实施例7
[0062]
同实施例5，区别在于，将高速剪切机的工作时间延长到到120s，其他操作都与实施例5一致。
[0063]
实施例8
[0064]
同实施例5，区别在于，将稀释后的菌悬液吸光值调整为0.341，其他操作都与实施例5一致。
[0065]
实施例9
[0066]
同实施例5，区别在于，用无菌枪头吸取1.0ml的菌悬液，其他操作都与实施例5一致。
[0067]
实施例10以麦麸(10g/l，30目)为辅料的发酵培养
[0068]
称取适量麦麸，蒸馏水浸泡一段时间，减压抽滤得到滤渣，重复三次后将滤渣放入烘箱60℃烘干，将完全干燥的麦麸放入粉碎机粉碎后过筛收集30目的备用。按麦芽糖10g/
l，酵母浸粉10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.5g/l制作辅料基础培养基，加入10g/l麦麸(粒径：30目)作为辅料。其他操作都与实施例1一致。
[0069]
实施例11以麦麸(8g/l，50目)为辅料的发酵培养
[0070]
在辅料基础培养基中加入8g/l麦麸(粒径：50目)作为辅料。其他操作都与实施例5一致。
[0071]
对比例1以葡萄糖为碳源的发酵培养
[0072]
同实施例1，区别在于，将麦芽糖替换为葡萄糖，其他操作都与实施例1一致。
[0073]
对比例2以蔗糖为碳源的发酵培养
[0074]
同实施例1，区别在于，将麦芽糖替换为蔗糖，其他操作都与实施例1一致。
[0075]
对比例3以乳糖为碳源的发酵培养
[0076]
同实施例1，区别在于，将麦芽糖替换乳糖，其他操作都与实施例1一致。
[0077]
对比例4以可溶性淀粉为碳源的发酵培养
[0078]
同实施例1，区别在于，将麦芽糖替换为可溶性淀粉，其他操作都与实施例1一致。
[0079]
对比例5以蛋白胨为氮源的发酵培养
[0080]
同实施例3，区别在于，将酵母浸粉替换为蛋白胨，其他操作都与实施例3一致。
[0081]
对比例6以牛肉膏为氮源的发酵培养
[0082]
同实施例3，区别在于，将酵母浸粉替换为牛肉膏，其他操作都与实施例3一致。
[0083]
对比例7以豆粉饼为氮源的发酵培养
[0084]
同实施例3，区别在于，将酵母浸粉替换为豆粉饼，其他操作都与实施例3一致。
[0085]
对比例8以尿素为氮源的发酵培养
[0086]
同实施例3，区别在于，将酵母浸粉替换为尿素，其他操作都与实施例3一致。
[0087]
对比例9利用最佳碳源与氮源，不添加麦麸的发酵培养
[0088]
同实施例4，区别在于发酵培养时间缩短到10d。
[0089]
表1发酵液中的菌丝体平均直径与质量以及活性成分含量
[0090][0091][0092]
由实验例1-4与前八个对比例可知，促使粗毛纤孔菌发酵产生胞外多糖的最佳碳氮源分别为麦芽糖和酵母粉。这是由于不同的营养素在菌丝体内的代谢途径不同，所能产生的胞外活性产物也不同。相比于其他碳氮源，针对此菌种麦芽糖与酵母粉更能促进生物大分子等活性产物的胞内合成与胞外分泌。而发酵所使用的菌种形态对菌丝生长以及产物的分泌也至关重要。从表中可知，实例5-9采用高速剪切破碎得到的菌丝作为菌种，相比琼脂块，这种接种方式便于控制接种量，增加了菌丝生长位点，从而加快菌丝的生长以及对培养液的利用，大大缩短发酵时间。此外，添加了一定量的麦麸能够进一步提升胞外多糖的得率与代谢产物生成，主要是由于麦麸的粗纤维结构，菌丝可以依附其生长而减少相互缠绕。麦麸通过减小菌丝聚集体的直径达到增大与发酵液接触面积的效果，从而使其产生更多的活性产物。因此，对于粗毛纤孔菌，液态培养基碳氮源的优化、接种方式的改进和麦麸的添
加可以显著提升活性代谢产物的产量，有助于实现菌种的大规模培养与产物提取，进一步围绕粗毛纤孔菌开发出抗氧化以及抑制肿瘤细胞增殖的药用产品。
[0093]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。