一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法

1.本发明属于发酵领域，具体涉及到一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法。


背景技术：

2.种曲是指发酵大曲前的菌种，一般工业中种曲都是按照：试管菌种
→
三角瓶种曲
→
菌种机扩大种曲的流程制备。
3.种曲的质量与制备好大曲的质量高度相关，甚至质量差的种曲会造成制备大曲失败，这无疑对企业而言是一种巨大的损失。
4.目前，判定种曲质量优劣的方法并不能较好地指导并预测大曲的长势情况，这样不稳定的种曲，最终长出大曲的情况差异也很大，包括有制曲失败型、营养缺陷型。
5.因此，本领域亟需一种判定种曲质量的方法，以用来精准预判制备高产蛋白酶的大曲。


技术实现要素：

6.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
7.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
8.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法，包括，
10.种子细胞液制备：称取种曲，加入无菌水，充分振摇后，吸取1ml于9ml无菌水试管中，充分振摇，得种子细胞液；
11.孢子发育载片制备：移液管取种子细胞液滴于盖玻片上，制得孢子发育载片；
12.观察小室制备培养：将培养皿内加入无菌水，孢子发育载片通过两根导管支撑，盖好培养皿，恒温培养；
13.优质种曲孢子出芽判定：恒温培养后显微观察计算孢子出芽率及完全出芽孢子率；
14.孢子形态固定载片制备：取种子细胞液1滴于载玻片上，将盖玻片轻轻由一边压向另一边，使盖玻片与载玻片完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余液滴，静置1min，取三个清晰明亮含有10-15个孢子的视野，显微观察计算孢子异变率；
15.其中，用于稳定、高产蛋白酶活的大曲的种曲：孢子出芽率≥95％，完全出芽孢子率≥50％，孢子异变率≤10％。
16.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述种子细胞液制备，其中，种
曲与无菌水的质量体积比为1g：50ml。
17.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述种曲中菌种包括米曲霉沪酿3.042，由天津科技大学菌种保藏中心提供。
18.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述孢子发育载片制备，包括，
19.用1ml移液管取1小滴种子细胞液滴于盖玻片上，立刻用玻璃棒涂匀；
20.快速用玻璃棒蘸取培养基与种子细胞液混匀涂匀成薄薄的一层小圆圈，小圆圈直径为盖玻片边长的0.8倍，整个过程在15s内完成。
21.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述培养基包括pca培养基，配比为：胰蛋白胨5g、酵母膏粉2.5g、葡萄糖1g、琼脂15g、ph 7.0
±
0.2。
22.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述恒温培养，其中，温度设置为36℃，培养时间为3.5h。
23.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述完全出芽孢子率，其计算方法为：
24.完全出芽孢子率＝完全出芽孢子
÷
视野内全部孢子
×
100％；其中，
25.完全出芽孢子为芽苗的长度≥孢子直径
×
2。
26.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述孢子异变率为形态、颜色异常的孢子占视野内全部孢子的数量百分比。
27.作为本发明所述的制备方法一种优选方案，其中：所述优质种曲孢子出芽判定，其中，用160倍普通光学显微镜观察；所述计算孢子异变率，其中，用1600倍油镜普通光学显微镜观察。
28.本发明有益效果：
29.(1)本发明提出一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法，通过提高培养温度、缩短发芽时间并结合观察孢子形态来判定种曲的孢子质量，改善并增加了判定手段，使判定结果更贴近大曲的现实生长情况，大大节约了工业上原料成本浪费情况。
30.(2)本发明提供一种高产蛋白酶、酶活稳定制曲的酱油种曲评判方法，以改进完善传统孢子发芽率观察的方式，结合观察孢子显微形态，对酱油种曲进行质量分级，用以指导大曲制备，提高大曲中蛋白酶活性，最终提升酱油产品质量，操作简单，通俗易懂，可大大节约与化验员的交接的时间成本；本发明判定出的优质种曲在用于大曲生产后，可明显提高其蛋白酶活性，且制曲成功率也大幅提升。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
32.图1为本发明中实施例2达标种曲的显微观察图，其中，a为孢子出芽图，b为孢子异变图。
33.图2为本发明中实施例3未达标种曲显微观察图，其中，a为孢子出芽图，b为孢子异变图。
34.图3为本发明中实施例4未达标种曲显微观察图，其中，a为孢子出芽图，b为孢子异变图。
具体实施方式
35.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
36.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
37.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
38.实施例1：
39.(1)种子细胞液制备：称1g种曲，放入盛有50ml无菌水及5粒玻璃珠的三角瓶中，充分振摇5min，移液管吸取1ml于9ml无菌水试管中，充分振摇2min即可。
40.(2)孢子发育载片制备：用一支1ml移液管取1小滴种子细胞液滴于盖玻片上后立刻用玻璃棒涂匀，快速用玻璃棒蘸取培养基与种子细胞液混匀涂匀成薄薄的一层小圆圈，小圆圈直径为盖玻片边长的0.8倍，整个过程在15s内完成。
41.(3)观察小室制备培养：培养皿内放入2ml无菌水，导管两根支撑第(2)步制备好的孢子发育载片。盖好培养皿盖于恒温培养箱培养。温度设置为36℃，培养时间为3.5h。
42.(4)种曲孢子出芽判定：取三个清晰明亮含有大量孢子的视野，显微观察计算孢子出芽率及完全出芽孢子率，表1统计计算了7批不同批次的新鲜种曲的出芽情况。
43.(5)孢子形态固定载片制备：取步骤(1)中的种子细胞液1滴于载玻片上，将盖玻片轻轻由一边压向另一边，使盖玻片与载玻片完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余液滴，静置1min即可。
44.(6)种曲孢子异变率判定：取三个清晰明亮含有10-15个孢子的视野，显微观察计算孢子异变率，具体数据统计在表1。
45.(7)生产大曲实际应用：将7个不同批次的种曲分别按照0.3％的比例接种于灭菌的大曲培养基(豆粕：麸皮6：4、水分为原料质量的110％)，拌匀后30℃堆积培养，盖上湿纱布。大约14-16h，大曲结块变白，一次翻曲后平铺继续30℃培养，大约6-8h后再次结块变白，二次翻曲以避免过热烧曲，继续培养，直至变成黄绿色制备成功。(见表1)。
46.表1
47.[0048][0049]
其中，a～g批次为不同的批次样品，均为酱油鲜种曲，采用完全相同工艺制备。
[0050]
可以看出，稳定制备高产蛋白酶活酱油大曲的种曲需要满足标准为：孢子出芽率≥95％，完全孢子出芽率≥50％，孢子异变率≤10％，达到以上指标的种曲制备的酱油大曲中性蛋白酶活可以达到1800左右。
[0051]
实施例2：
[0052]
(1)种子细胞液制备：称1g种曲，放入盛有50ml无菌水及5粒玻璃珠的三角瓶中，充分振摇5min，移液管吸取1ml于9ml无菌水试管中，充分振摇2min即可。
[0053]
(2)孢子发育载片制备：用一支1ml移液管取1小滴种子细胞液滴于盖玻片上后立刻用玻璃棒涂匀，快速用玻璃棒蘸取培养基与种子细胞液混匀涂匀成薄薄的一层小圆圈，小圆圈直径为盖玻片边长的0.8倍，整个过程在15s内完成。
[0054]
(3)观察小室制备培养：培养皿内放入2ml无菌水，导管两根支撑第(2)步制备好的孢子发育载片。盖好培养皿盖于恒温培养箱培养。温度设置为36℃，培养时间为3.5h。
[0055]
(4)种曲孢子出芽判定：取三个清晰明亮含有大量孢子的视野，显微观察计算孢子出芽率及完全出芽孢子率，统计计算该样品的孢子出芽率、完全孢子出芽率分别为97.8％、74.9％，满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子出芽见图1a)
[0056]
(5)孢子的形态固定载片制备：取步骤(1)中的种子细胞液1滴于载玻片上，将盖玻片轻轻由一边压向另一边，使盖玻片与载玻片完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余液滴，静置1min即可。
[0057]
(6)种曲孢子异变率判定：取三个清晰明亮含有10-15个孢子的视野，显微观察计算孢子异变率为5.8％，满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子异变见图1b)
[0058]
(7)制备大曲并测定蛋白酶活：将该样品种曲按照0.3％的比例接种于灭菌的大曲培养基(豆粕：麸皮6：4、水分为原料质量的110％)，拌匀后30℃堆积培养，盖上湿纱布。14h后，大曲结块变白，一次翻曲后平铺继续30℃培养，6h后再次结块变白，进行二次翻曲避免过热烧曲，继续培养，直至变成黄绿色制备成功。测定其中性蛋白酶活为1924。
[0059]
实施例3：
[0060]
(1)种子细胞液制备：称1g种曲，放入盛有50ml无菌水及5粒玻璃珠的三角瓶中，充分振摇5min，移液管吸取1ml于9ml无菌水试管中，充分振摇2min即可。
[0061]
(2)孢子发育载片制备：用一支1ml移液管取1小滴种子细胞液滴于盖玻片上后立刻用玻璃棒涂匀，快速用玻璃棒蘸取培养基与种子细胞液混匀涂匀成薄薄的一层小圆圈，小圆圈直径为盖玻片边长的0.8倍，整个过程在15s内完成。
[0062]
(3)观察小室制备培养：培养皿内放入2ml无菌水，导管两根支撑第(2)步制备好的孢子发育载片。盖好培养皿盖于恒温培养箱培养。温度设置为36℃，培养时间为3.5h。
[0063]
(4)种曲孢子出芽判定：取三个清晰明亮含有大量孢子的视野，显微观察计算孢子出芽率及完全出芽孢子率，统计计算该样品的孢子出芽率、完全孢子出芽率分别为95.0％、25.7％，不满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子出芽见图2a)
[0064]
(5)孢子的形态固定载片制备：取步骤(1)中的种子细胞液1滴于载玻片上，将盖玻片轻轻由一边压向另一边，使盖玻片与载玻片完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余液滴，静置1min即可。
[0065]
(6)种曲孢子异变率判定：取三个清晰明亮含有10-15个孢子的视野，显微观察计算孢子异变率为9.1％，满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子异变见图2b)
[0066]
(7)制备大曲并测定蛋白酶活：将该样品种曲按照0.3％的比例接种于灭菌的大曲培养基(豆粕：麸皮6：4、水分为原料质量的110％)，拌匀后30℃堆积培养，盖上湿纱布。16h后，大曲结块变白，一次翻曲后平铺继续30℃培养，7h后再次结块变白，进行二次翻曲避免过热烧曲，继续培养，直至变成黄绿色制备成功。测定其中性蛋白酶活为1427。
[0067]
实施例4：
[0068]
(1)种子细胞液制备：称1g种曲，放入盛有50ml无菌水及5粒玻璃珠的三角瓶中，充分振摇5min，移液管吸取1ml于9ml无菌水试管中，充分振摇2min即可。
[0069]
(2)孢子发育载片制备：用一支1ml移液管取1小滴种子细胞液滴于盖玻片上后立刻用玻璃棒涂匀，快速用玻璃棒蘸取培养基与种子细胞液混匀涂匀成薄薄的一层小圆圈，小圆圈直径为盖玻片边长的0.8倍，整个过程在15s内完成。
[0070]
(3)观察小室制备培养：培养皿内放入2ml无菌水，导管两根支撑第(2)步制备好的孢子发育载片。盖好培养皿盖于恒温培养箱培养。温度设置为36℃，培养时间为3.5h。
[0071]
(4)种曲孢子出芽判定：取三个清晰明亮含有大量孢子的视野，显微观察计算孢子出芽率及完全出芽孢子率，统计计算该样品的孢子出芽率、完全孢子出芽率分别为70.1％、26.8％，不满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子出芽见图3a)
[0072]
(5)孢子的形态固定载片制备：取步骤(1)中的种子细胞液1滴于载玻片上，将盖玻
片轻轻由一边压向另一边，使盖玻片与载玻片完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余液滴，静置1min即可。
[0073]
(6)种曲孢子异变率判定：取三个清晰明亮含有10-15个孢子的视野，显微观察计算孢子异变率为20.3％，不满足一种高产蛋白酶、酶活稳定的酱油种曲的制备方法的判别标准，继续下面操作。(孢子异变见图3b)
[0074]
(7)制备大曲并测定蛋白酶活：将该样品种曲按照0.3％的比例接种于灭菌的大曲培养基(豆粕：麸皮6：4、水分为原料质量的110％)，拌匀后30℃堆积培养，盖上湿纱布。18h后，大曲才微微结块变白，一次翻曲后平铺继续30℃培养，10h后大曲未再结块、也未变白，再10h后出现酸败味道，曲块发粘，大曲制备失败。测定其中性蛋白酶活＜100。
[0075]
本发明提供一种高产蛋白酶、酶活稳定制曲的酱油种曲评判方法，以改进完善传统孢子发芽率观察的方式，结合观察孢子显微形态，对酱油种曲进行质量分级，用以指导大曲制备，提高大曲中蛋白酶活性，最终提升酱油产品质量，操作简单，通俗易懂，可大大节约与化验员的交接的时间成本；本发明判定出的优质种曲在用于大曲生产后，可明显提高其蛋白酶活性，且制曲成功率也大幅提升。
[0076]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。