产生血清素的细菌的制作方法

1.本发明一般性涉及产生乳酸的细菌，并且特别是涉及筛选这样的产生乳酸的细菌用于产生血清素，以及这样的产生乳酸的细菌在治疗血清素缺乏和在治疗与血清素缺乏相关的病症和疾病中的用途。


背景技术：

2.已经充分确立，宿主与肠微生物之间的相互作用是宿主健康和幸福的基础。肠微生物群产生代谢物，其为宿主提供营养，但也可以涉及免疫应答和宿主免疫系统的调节和发育。
3.乳杆菌和其它产生乳酸的细菌(例如双歧杆菌)通常用作各种类型的食品(例如酸奶)中的益生菌。这样的产生乳酸的细菌通过它们自身在肠生态系统内的定居，例如通过形成生物膜、通过竞争可利用的营养物和/或通过产生降低肠ph的特定物质，例如过氧化氢、细菌素和/或有机酸(包括乳酸和乙酸)，可以防止有害微生物的生长和定居。
4.血清素或5-羟色胺(5-ht)是由芳族氨基酸色氨酸合成的生物胺，其具有几种生理功能，包括在行为、血小板活化和凝血、肠转运、肠神经系统(ens)成熟、发育、稳态和活性、肠免疫系统活性、能量代谢(禁食适应、脂肪组织的褐变和脂解、肝葡萄糖产生、胰岛素分泌)、肠-脑轴活性和骨代谢和稳态方面的生理功能。在人类中，血清素主要存在于胃肠(gi)道、血小板和中枢神经系统(cns)中。在哺乳动物细胞中，血清素的产生通过限速酶色氨酸羟化酶(tph)实现，其产生5-羟色氨酸(5-htp)。5-htp是血清素的直接前体，并通过芳族l-氨基酸脱羧酶(aadc)转化成血清素。tph有两种同种型；tph1主要在外周组织中表达，而tph2主要在脑(cns)和ens神经元中表达。tph1是负责大部分内源性血清素产生的酶，并且该酶由胃肠道中高度特化的内分泌细胞(称为肠嗜铬(ec)细胞)表达。已经清楚地证明，肠微生物群涉及通过代谢信号传导至ec细胞来调节内源性宿主血清素产生。来自肠微生物群的代谢物(例如短链脂肪酸和次级胆汁酸)已经显示在小鼠ec细胞中诱导tph1的表达，并且相应地，内源性产生的血清素的水平直接由这些细菌调节。因此，与具有常规微生物群的常规定居的对照动物相比，在不存在微生物定居的情况下饲养的小鼠中(例如在无菌(gf)小鼠中)血清的血清素水平显著降低。
5.当身体没有足够的血清素时，发生血清素缺乏，这可能由于若干原因而发生。肠内或其余体内局部的血清素缺乏可能引起病理状况，包括抑郁、焦虑、强迫症、肠易激综合征、心血管疾病、骨质疏松、胃肠运动异常、血小板聚集异常、血小板活化异常和免疫应答异常。因此，血清素缺乏存在健康风险。已经开发了各种药物来治疗血清素缺乏，例如选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)和单胺氧化酶(mao)抑制剂。然而，这些药物通常或多或少伴随严重的副作用，例如腹泻、便秘、失眠、头晕和口干。此外，这些药物不适合每个人，并且例如孕妇，当母乳喂养时，当人年龄小于18岁时，当人患有糖尿病、癫痫或肾病时不应服用ssri。此外，ssri和mao抑制剂两者都可能与其它药物(例如止痛药、其它抗抑郁药以及感冒和过敏性药物)相互作用，并且可能因此引起严重的有害反应。mao抑制剂还可以与许多食物和饮
料相互作用，引起危险的高血压。这些特征使得已知的血清素缺乏药物不适合于大的患者群，并因此非常需要提供血清素缺乏或血清素缺乏相关的病症的替代性有效治疗，而没有或几乎没有副作用。
6.总之，需要可以增加患有血清素缺乏的患者中的血清素水平并且可以用于治疗血清素缺乏和与血清素缺乏相关的疾病或病症的安全方法。


技术实现要素：

7.一般的目的是筛选用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的产生乳酸的细菌菌株。
8.特别的目的是筛选能够在胃肠道内、在肠的更氧合的生态位(niche)中(例如靠近粘膜)局部产生血清素的产生乳酸的细菌菌株。
9.这些和其它目的通过本文公开的实施方案来满足。
10.本发明在独立权利要求中限定。本发明的其它实施方案在从属权利要求中限定。
11.实施方案的一方面涉及用于选择用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的细菌菌株的方法。所述方法包括在需氧条件下在包含色氨酸的培养基中培养产生乳酸的细菌菌株的细菌。所述方法还包括检测在所述培养基或其样品中由所述产生乳酸的细菌菌株的所述细菌产生的任何血清素。所述方法进一步包括如果在所述培养基或其样品中检测到血清素，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
12.实施方案的另一方面涉及用于选择用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的细菌菌株的方法。所述方法包括用产生乳酸的细菌菌株的细菌喂养无菌tph1-/-受试者。所述方法还包括检测在从所述无菌tph1-/-受试者获取的身体样品中由所述产生乳酸的细菌菌株的所述细菌产生的任何血清素。所述方法进一步包括如果在所述身体样品中检测到血清素，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
13.实施方案的另一方面涉及产生乳酸的细菌菌株，其能够在需氧条件下产生并细胞外释放血清素，用于治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病。
14.实施方案的其它方面涉及粘膜乳杆菌(lactobacillus mucosae) dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293、粘膜乳杆菌dsm 33661、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri) dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum) dsm 33295和植物乳杆菌dsm 33662及其作为药物和用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的用途。
15.根据实施方案选择的产生乳酸的细菌菌株可以在哺乳动物的胃肠系统中产生血清素。特别地，根据本发明选择的产生乳酸的细菌菌株能够在肠的更氧合的生态位的条件下产生血清素，例如靠近肠的上皮内衬，在那里表达血清素受体和/或血清素转运蛋白(sert)，并且也在那里定位肠内分泌细胞，例如肠嗜铬细胞。这种微生物产生的血清素是生物活性的，并且在胃肠道内局部起作用，但也可能在胃肠道系统的外周起作用。因此，由肠细菌菌株产生的血清素可以用于治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾
病。
附图说明
16.结合附图，通过参考以下描述，可以最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：图1。产生乳酸的细菌菌株的血清素产生的评估。(a)在色氨酸修饰的脱羧酶(dect)肉汤中，在厌氧和需氧条件下培养罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)和嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)细菌菌株之后，在它们的培养基(肉汤)中测量血清素的水平。发现所有测试的罗伊氏乳杆菌细菌菌株在厌氧条件下产生血清素，并且发现它们在需氧条件下产生甚至更多的血清素，而在体外任何相应的条件下，细菌菌株植物乳杆菌36e、干酪乳杆菌(l. casei) lmg 6904和嗜酸乳杆菌(l. acidophilus) atcc 4356都没有观察到血清素产生。计算每个细菌菌株的需氧和厌氧血清素产生之间的比率。与在厌氧条件下相比，所有研究的罗伊氏乳杆菌细菌菌株在体外需氧条件下是更好的血清素生产者。(b)在血液样品中测量血清的血清素浓度，所述血液样品从无菌(gf) tph1-/-小鼠的腔静脉获得，和从已用罗伊氏乳杆菌dsm 17938、罗伊氏乳杆菌dsm 27131或干酪乳杆菌lmg 6904中的任一种喂养(接种)的gf tph1-/-小鼠(n=3-6/组)获得。图中的数据以箱形图呈现，并且每个点代表一只小鼠，显示最大值、最小值、中值和四分位数间距。该图显示在用罗伊氏乳杆菌细菌菌株接种后，在gf tph1-/-小鼠中非常低的血清素水平在这些小鼠中恢复。然而，在从接种干酪乳杆菌lmg 6904的小鼠获得的血清样品中没有观察到血清素水平的增加，指示该细菌菌株在体内不产生血清素。在通过student’s t检验(如果数据是正态分布的)或mann-whitney检验评价统计学显著性之前，分析每组的正态。当比较多于两组时，如果数据是正态分布的，则使用单向anova接着post hoc tukey’s多重比较检验分析数据，否则进行kruskal-wallis检验接着post hoc dunn’s多重比较。显著性水平设定在*p《0.05。
17.图2。细菌产生的血清素在胃肠道内具有局部作用，并且对于肠神经系统(ens)成熟和近端结肠内的隐窝神经支配是关键的。该图说明结肠纵向肌肉肠肌丛(lmmp)中血清素阳性区域(a，d)；结肠隐窝的pgp9.5阳性区域(b，e)；和结肠隐窝中tuj1阳性区域(c，f)。(a-c)图中的gf指示tph1-/-无菌动物；conv-d 3d和conv-d 14d指示分别接种tph1 / 小鼠盲肠3或14天的tph1-/-无菌动物；conv-r指示具有正常微生物群的tph1-/-动物；和dect定居的14 d指示接种小鼠盲肠内容物的tph1-/-无菌动物，所述小鼠盲肠内容物在接种前在dect中已培养48小时(n=3-6/组)。d-f中的结果代表在接种罗伊氏乳杆菌dsm 27131或干酪乳杆菌lmg 6904后14天从gf tph1-/-小鼠获得的数据(n=3-6/组)。(a)数据显示，与gf tph1-/-小鼠的ens中的血清素的水平相比，接种小鼠盲肠微生物群增加近端结肠的肠神经元中血清素的水平。3天后ens中的血清素水平恢复到几乎与conv-r小鼠中相同的水平。(b，c)数据还显示胃肠道中小鼠盲肠微生物群的存在增加成熟肠神经元的良好建立的标志物(pgp9.5和tuj1)。d中的数据显示，在接种单一益生菌细菌菌株罗伊氏乳杆菌dsm 27131后，血清素水平在近端结肠的肠神经元中也增加，而干酪乳杆菌lmg 6904对肠神经元血清素水平没有作用。此外，接种罗伊氏乳杆菌dsm 27131增加肠神经元的成熟度，如对于标志物pgp9.5和tuj1所观察到的(e，f)，而干酪乳杆菌lmg 6904对这两种肠神经元成熟度的标志
物没有作用。数据以箱形图呈现，显示最大值、最小值、中值和四分位数间距。每个点代表单只小鼠。在通过student’s t检验(如果数据是正态分布的)或mann-whitney检验评价统计学显著性之前，分析每组的正态。当比较多于两组时，如果数据是正态分布的，则使用单向anova接着post hoc tukey’s多重比较检验分析数据，否则进行kruskal-wallis检验接着post hoc dunn’s多重比较。显著性水平设定在*p《0.05；**p《0.01。
18.图3。从人供体分离的细菌菌株的血清素产生。在从两个人供体获得的总共199种分离株中，发现24种分离株(如图中所示)在体外厌氧和/或需氧条件下产生血清素。发现来自供体#1的总共六种分离株和来自供体#2的一种分离株在体外厌氧条件下在dect肉汤中产生超过1 nm的血清素，而来自供体#1的所有六种分离株#1和来自供体#2的15种分离株在需氧条件下产生超过1 nm血清素。有趣的是，与在厌氧条件下相比，发现这些菌株中的大多数在需氧条件下产生几乎两倍的血清素。测序分析将产生血清素的分离株鉴定为粘膜乳杆菌(n=13)、植物乳杆菌(n=6)和肠球菌(enterococcus) (n=1)的菌株。四种分离株不能被鉴定，但是这些分离株与埃希氏杆菌属(escherichia)、志贺氏菌属(shigella)或brenneria细菌菌株紧密比对。
19.图4。选择的分离的人细菌菌株在体内产生功能性血清素。选择从人供体分离的两种细菌菌株(植物乳杆菌dsm 33662和粘膜乳杆菌dsm 33661，发现其在厌氧和需氧条件下均在体外产生血清素)并用于接种无菌tph1-/-小鼠。该图显示，与无菌tph1-/-小鼠中发现的水平相比，这些细菌菌株在体内增加血清素水平，既在肠腔内局部增加(a)，也在体循环(血清样品)中增加(b)。此外，两种菌株都增加近端结肠的ens中的血清素阳性区域(c)。因此，这些细菌菌株能够在体内增加肠腔(盲肠)中局部的血清素水平，并且这种局部产生的血清素是生物活性的，并且可以被转运到体循环(血清)中和近端结肠的肠神经系统的神经元中。数据以箱形图呈现，显示最大值、最小值、中值和四分位数间距。每个点代表单只小鼠。
20.图5是说明根据实施方案的用于选择细菌菌株的方法的流程图。
21.图6是说明根据实施方案的在图5中所示方法的另外任选步骤的流程图。
22.图7是说明根据实施方案的在图5中所示方法的另外任选步骤的流程图。
23.图8是说明根据另一个实施方案的用于选择细菌菌株的方法的流程图。
24.图9。在需氧条件下生长不好的两种罗伊氏乳杆菌菌株(菌株a和菌株b)在培养期间受到氧的攻击，以进化为新的、更耐氧的菌株。通过该方法鉴定了分别源自菌株a和菌株b的两种新菌株(罗伊氏乳杆菌dsm 33632和dsm 33634)。通过测量培养24小时时的光密度(od)来定量细菌菌株的生长，并且与菌株(a)相比，两种新菌株在需氧条件下都具有显著改进的od。这种改进的生长稳定长达100代(b，c)。新的、更耐氧的细菌菌株受到另外数轮氧胁迫的进一步攻击，以进一步进化成另外的、甚至更耐氧的菌株，并且还伴随另外的冷冻干燥步骤和加速的储存胁迫。这些另外的胁迫步骤导致鉴定和选择两种另外的新细菌菌株(源自dsm 33632的罗伊氏乳杆菌dsm 33633和源自dsm 33634的罗伊氏乳杆菌dsm 33635)。与dsm 33632和dsm 33634相比，这两种新菌株在需氧条件下显示略微改进的生长特性，以及与菌株a和菌株b相比，在需氧条件下显示显著改进的生长性质(d)。
25.图10说明产生血清素的乳酸细菌菌株罗伊氏乳杆菌dsm 27131、dsm 32465、dsm 33632、dsm 33633、dsm 33634、dsm 33635和dsm 33509、粘膜乳杆菌dsm 33291、dsm 33292、
dsm 33293、和dsm 33661和植物乳杆菌dsm 33662的粘液粘附能力。能够在体外需氧条件下产生血清素并且能够在体内有助于全身血清素库的罗伊氏乳杆菌dsm 27131也能够附着于粘液(a，b)。对于所有其它测试的罗伊氏乳杆菌、粘膜乳杆菌和植物乳杆菌菌株，也观察到粘液粘附(a，b)。结果指示这些产生血清素的细菌菌株也能够附着于肠粘膜。
具体实施方式
26.tph1是胃肠道中负责内源性血清素产生的酶。尽管如此，当在小鼠模型中tph1基因缺失(即，导致tph1-/-动物)时，一些血清素保留，指示一部分血清素不是通过内源性tph1介导的机制产生的。本发明的发明人在此惊奇地发现，当tph1-/-小鼠再衍生为无菌的(即，缺乏胃肠微生物群的动物)时，它们几乎完全耗尽血清素。下一个惊奇的发现是，无菌tph1-/-小鼠接种野生型小鼠盲肠微生物群或接种产生血清素的乳杆菌属细菌菌株足以恢复肠中的血清素水平。这些新发现表明，正常胃肠道内的细菌不仅能够影响内源性(宿主)血清素产生，如先前已知的，而且令人惊讶地，它们也能够在胃肠道内局部地自身产生血清素。然后，发明人发现乳酸细菌的某些菌株能够在体外厌氧和需氧条件下均产生血清素。此外，对于某些菌株，与在厌氧条件下产生血清素相比，在需氧条件下的血清素产生大大改进。因此，本发明基于以下发现：某些细菌菌株(特别是某些产生乳酸的细菌菌株，其通常是厌氧的)能够在需氧条件下产生血清素。因此，目的是筛选和选择能够在需氧条件下产生并细胞外释放血清素的细菌。能够在需氧条件下产生并细胞外释放血清素的这些细菌特别适于在受试者的胃肠道内局部产生并释放血清素，例如在靠近肠的粘膜/上皮内衬的肠的更氧合的生态位中。在肠的这些更氧合的生态位处，定位肠内分泌细胞(例如肠嗜铬细胞)，并且表达血清素受体和/或血清素转运蛋白(sert)。任何选定的细菌菌株优选能够粘附于粘液，或至少存在于或接近粘膜，在那里它们暴露于相对高的氧分压，这是胃肠道的氧合生态位的特征。
27.这样的细菌的筛选可以通过在需氧条件下或在厌氧和需氧条件下培养产生乳酸的细菌菌株并选择被鉴定为仅在需氧条件下能够产生血清素或在厌氧和需氧条件下都能够产生血清素的细菌而在体外进行。当给予受试者时，选择的细菌然后可以用于在受试者的胃肠道内局部产生血清素，以增加患有血清素缺乏或患有与血清素缺乏相关的疾病或病症的受试者的血清素的水平。
28.也可以使用喂养产生乳酸的细菌菌株的无菌(gf) tph1-/-哺乳动物受试者体内进行这样的细菌的筛选。然后可以在从gf tph1-/-受试者获取的身体样品中评估或分析gf tph1-/-受试者的胃肠道中乳酸细菌菌株的血清素产生，以确定乳酸细菌菌株在治疗血清素缺乏或与血清素缺乏相关的疾病或病症中是否有效。
29.此外，微生物产生的血清素是生物活性的，并且不仅在胃肠道内局部起作用，而且可以穿过胃肠道的上皮内衬转运到体循环中，在那里它能够在胃肠道系统的外周起作用，即具有全身作用。为了使细菌产生的血清素到达体循环，优选血清素的产生靠近肠粘膜和肠上皮发生，与肠腔中的氧水平相比，在靠近肠粘膜和肠上皮处氧水平通常更高。因此，在特定实施方案中，根据实施方案选择的产生血清素的细菌优选还能够粘附于胃肠道的更氧合的生态位中的粘液，或至少存在于粘膜处或靠近粘膜，和/或也可能定居胃肠道的粘膜，确保细菌与胃肠道的上皮细胞之间的紧密接近。
30.此外，如果靠近胃肠道的上皮细胞产生血清素，则由产生乳酸的细菌菌株产生的血清素能够对胃肠道本身起局部作用，例如影响肠神经系统(ens)的成熟和在其内的通讯。ens由神经胶质细胞和神经细胞组成，它们包埋在胃肠道的内衬，并且该神经系统负责例如胃肠系统的运动控制和胃肠酶的分泌。此外，该神经系统通过许多神经递质通讯，其与中枢神经系统中的通讯类似，包括通过乙酰胆碱、多巴胺和血清素。
31.因此，在胃肠道中产生血清素的产生乳酸的细菌菌株可以用于治疗胃肠道内局部的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的病症和疾病，而且当血清素通过胃肠道内衬转运到体循环中并进一步进入外周组织时，还可以用于治疗身体的其它部分中的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的病症和疾病。
32.产生乳酸的细菌菌株(也称为乳酸细菌菌株)是革兰氏阳性、低gc、耐酸、通常不形成孢子、不呼吸和棒状或球形细菌，其能够产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。产生乳酸的细菌厌氧生长，但与大多数厌氧菌不同，它们能够在氧存在下生长为耐氧或相对耐氧的厌氧菌。产生乳酸的细菌通常被认为是安全的(gras)，并且包括乳杆菌目(lactobacillales)下的属，其包括乳杆菌属、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、乳球菌属(lactococcus)和链球菌属(streptococcus)，以及气球菌属(aerococcus)、肉杆菌属(carnobacterium)、肠球菌属、酒球菌属(oenococcus)、四联球菌属(tetragenococcus)、漫游球菌属(vagococcus)和魏斯氏菌属(weissella)，以及双歧杆菌目(bifidobacteriales)下的双歧杆菌属(bifidobacterium)。
33.在过去的几十年中，新的分析工具已经使科学家能够发现许多新的细菌物种，并且认识到历史上在乳杆菌属下分组的物种彼此有很大不同。为了保持益生菌组的准确和有组织的，因此将乳杆菌属分成25个不同的属。结果是，最近许多益生菌被赋予了新的属名称。因此，罗伊氏乳杆菌的替代性属名称是limosilactobacillus reuteri，粘膜乳杆菌的替代性属名称是limosilactobacillus mucosae、植物乳杆菌的替代性属名称是lactiplantibacillus plantarum，以及干酪乳杆菌的替代性属名称是lacticaseibacillus casei。
34.图5是说明用于选择用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的细菌菌株的方法的流程图。该方法开始于步骤s1，其包括在需氧条件下在包含色氨酸的培养基中培养产生乳酸的细菌菌株的细菌。下一个步骤s2包括检测在培养基或其样品中由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生的任何血清素。该方法还包括，在步骤s3中，如果在培养基或其样品中检测到血清素，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
35.因此，选择这样的细菌是因为它们能够在肠的更氧合的生态位条件下产生血清素，例如，靠近胃肠道粘膜和肠的上皮内衬，在那里表达血清素受体和/或血清素转运蛋白(sert)，并且也在那里定位特定的肠内分泌细胞，例如肠嗜铬细胞。
36.如在图5中所示的选择方法包括在包含色氨酸的培养基中培养和测试产生乳酸的细菌菌株。色氨酸是血清素产生中的起始材料。更详细地，色氨酸羟化酶(tph) (ec 1.14.16.4)由色氨酸合成5-羟色氨酸(5-htp)，其中tph有两种同种型tph1和tph2。5-htp进而被芳族l-氨基酸脱羧酶(aadc) (ec 4.1.1.28)转化成血清素(5-ht)。因此，在其中培养待测试的一种或多种产生乳酸的细菌菌株的细菌的培养基包含色氨酸作为起始材料，用于
由一种或多种产生乳酸的细菌菌株的任何血清素产生。
37.根据本发明，在需氧条件下将产生乳酸的细菌菌株的细菌接种在包含色氨酸的培养基中。因此，选择的产生乳酸的细菌菌株应该至少在需氧条件下能够产生血清素。氧分压的差异在将芳族l-氨基酸(例如色氨酸)的细菌代谢转变为不同的代谢物方面对细菌代谢具有显著的影响。这意味着当在不同的氧分压(即需氧条件相对于厌氧条件)下培养时，给定的产生乳酸的细菌菌株从色氨酸产生不同的代谢物。换句话说，在需氧条件下能够产生血清素的产生乳酸的细菌不一定在厌氧条件下产生血清素，并且相反地，在厌氧条件下能够产生血清素的产生乳酸的细菌不一定在需氧条件下产生血清素。
38.与小肠(由十二指肠、空肠和回肠组成)和大肠(由盲肠、直肠和肛管组成的结肠)的内部部分相比，肠和胃中的氧分压通常在靠近肠粘膜处较高。这意味着存在于肠上皮处的氧对应于梯度，其中在靠近粘膜具有较高的氧浓度，而朝向腔侧具有较低的氧浓度。因此，图5中的步骤s1在需氧条件(即在氧的存在下，以模拟需氧条件)或靠近肠粘膜的氧合生态位下进行。根据在图5中所示的方法选择的产生乳酸的细菌菌株优选也能够粘附于和/或定居于肠粘膜或胃肠道的上皮内衬，或至少存在于或靠近肠粘膜，在那里它们暴露于相对高的氧分压，如结合图7进一步讨论的。这意味着为了在受试者的胃肠系统中体内产生血清素，并且为了使微生物产生的血清素被受试者从胃肠道有效吸收到体循环中，在如在图5中所示的方法中选择的产生乳酸的细菌菌株应当能够在模拟肠粘膜或靠近肠粘膜条件的需氧条件下产生血清素。
39.本文所用的与厌氧培养条件有关的术语“厌氧菌”和“厌氧的”包括特征在于无氧(o2)条件的这样的培养条件，即培养管的溶解的氧和顶部空间具有0%或0 ppm o2，至少接近0%或0 ppm o2。作为说明性实例，厌氧培养可以包括在密闭的培养容器(例如气密的血清瓶或hungate管)中的培养基中培养产生乳酸的细菌。在加入产生乳酸的细菌之前，培养基可以任选地脱气。除此之外或作为另外一种选择，在封闭容器之前或之后，可以用例如n2吹扫培养容器，或备选地地煮沸15-20分钟并在氮气流下冷却以去除存在于培养基中的任何溶解的氧或密闭的培养容器中的任何密闭的气体体积。
40.相应地，本文所用的与需氧培养条件有关的术语“需氧菌”和“需氧的”包括特征在于在培养管的顶部空间中存在游离氧(o2)的这样的培养条件，对应于100%饱和度或8.87 ppm溶解的氧。生长培养基中溶解的氧的初始量可以在任何可检测的水平范围内，例如从2.41 ppm (对应于29.3%饱和度)，优选从4.8 ppm(对应于64%饱和度)，并且优选至多9 ppm(对应于约103%饱和度)的溶解的氧。大气中的氧水平为约21%。作为说明性实例，需氧培养可以包括在开放的培养容器中的培养基中培养产生乳酸的细菌。或者，如果将氧气加入到密闭的培养容器中，则可以在密闭的培养容器中培养产生乳酸的细菌。
41.图5中的步骤s1可以在预定的时间段期间进行。例如，产生乳酸的细菌菌株的细菌可以在培养基中需氧孵育和培养至少1小时，至少多个小时，即至少两个小时，例如2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。产生乳酸的细菌菌株的细菌也可以培养更长的时间段，作为说明性的而非限制性的实例，例如24小时、36小时、48小时或60小时。
42.在实施方案中，图5中的步骤s2包括从培养基中取样品并检测在样品中由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生的任何血清素。在实施方案中，培养基的样品是无细胞的样品。在
这样的实施方案中，首先去除样品中存在的任何细胞，特别是细菌细胞，例如通过使样品经受一次或多次离心，例如10,000
×
g，离心1-4分钟，例如2分钟，以将样品分离成含细胞的沉淀和可包含血清素的上清液。然后图5中的步骤s2还包括检测在上清液中由产生乳酸的细菌菌株产生的任何血清素。除此之外或作为另外一种选择，培养基样品可以通过一个或多个过滤器过滤，所述过滤器被配置成捕获细菌，但同时允许培养基样品中的血清素通过一个或多个过滤器。在这样的实施方案中，血清素的检测可以在滤液中进行。
43.可以使用任何已知的血清素测量测定或技术在培养基、样品或上清液中测量血清素。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(elisa)或质谱法(ms)测定来测量血清素。
44.如果血清素的测量导致从特定的产生乳酸的细菌菌株的培养基、样品或上清液中鉴定血清素，这证实了产生乳酸的细菌菌株能够产生并细胞外释放血清素，并且在图5的步骤s3中，将选择测试的产生乳酸的细菌菌株，其在产生血清素方面是有效的，并从而在治疗受试者的与血清素缺乏相关的疾病方面也是有效的。
45.因此，在步骤s2中，通过检测培养基中血清素的存在，其也包括检测培养基样品或培养基的加工的样品中血清素的存在，例如培养基样品离心后的上清液或培养基样品过滤后的滤液，产生乳酸的细菌菌株的细菌不仅能够产生血清素，而且能够细胞外释放血清素到培养基中。血清素的这样的细胞外释放对于使用产生乳酸的细菌菌株来治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病是重要的，因为细菌产生的血清素需要局部地在胃肠道中到达受试者和/或被上皮吸收以到达体循环。
46.在实施方案中，除了色氨酸之外，培养基还包含碳源。培养基中可以包括可以由待测试的一种或多种产生乳酸的细菌菌株利用的任何碳源，包括但不限于葡萄糖。培养基优选还包含含氮化合物源，例如氨基酸；锰；硫酸盐；维生素和生长因子，例如以酵母提取物和/或牛肉提取物的形式。可以用于图5的方法的培养基实例是新的色氨酸修饰的脱羧酶(dect)肉汤，其设计用于促进色氨酸脱羧和微生物产生血清素。这样的dect肉汤或培养基包含色氨酸、葡萄糖、牛肉提取物和酵母提取物。
47.在实施方案中，培养基包含至少0.4 g/ 100 ml色氨酸，优选至少0.5 g/100 ml，例如至少0.6 g/100 ml，至少0.7 g/100 ml，并且更优选至少0.8 g/100 ml，例如至少0.9 g/100 ml或约1 g色氨酸/100 ml培养基。
48.目前优选的培养基(上述dect肉汤)优选包含色氨酸1 g/100 ml、葡萄糖 0.05 g/100 ml、牛肉提取物 0.5 g/100 ml和酵母提取物 0.1 g/100 ml。
49.在实施方案中，所述方法包括如在图6中所示的另外的步骤。在这样的实施方案中，该方法开始于图5中的步骤s10或从图5中的步骤s2继续。步骤s10包括在厌氧条件下在包含色氨酸的培养基中培养产生乳酸的细菌菌株的细菌。然后，该方法继续到步骤s11，其包括当在厌氧条件下培养时，检测在培养基或其样品中由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生的任何血清素。步骤s10优选以与前面结合图5中的步骤s1所描述的相似的方式进行，包括培养时间、培养基等，但区别在于在图5中的步骤s1中，在需氧条件下培养产生乳酸的菌株的细菌，而在图6中的步骤s10中，在厌氧条件下培养产生乳酸的菌株的细菌。相应地，在图6中的步骤s11中检测血清素可以以与结合在图5中的步骤s2讨论的相同的方式进行。
50.该实施方案优选还包含如在图6中所示的步骤s12。该步骤s12包括计算当在需氧条件下培养时在培养基或其样品中检测到的血清素的浓度(见图5中步骤s2)与当在厌氧条
件下培养时在培养基或其样品中检测到的血清素的浓度(见图6中步骤s11)之间的比率或商。然后，该方法继续到任选的步骤s13，其将计算的比率或商与阈值(例如1.0)进行比较。如果比率或商等于或大于阈值(优选大于)阈值，例如等于或大于1.0 (优选大于1.0)，则该方法继续到图5中的步骤s3。因此，在该实施方案中，步骤s3包括如果比率等于或大于1.0(优选大于1.0)则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
51.在特定实施方案中，在任选的步骤s13中与比率或商比较的阈值是1.5，优选2.0，例如2.5，并且更优选3.0，例如3.5或甚至更高，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或甚至10.0。在一些实施方案中，阈值可以甚至更高，例如15、20、25、30、40或50或甚至更高。
52.与当在厌氧条件下培养时相比，当在需氧条件下培养时，某些产生乳酸的细菌菌株的细菌是显著更有效的血清素生产者。在一些产生乳酸的细菌菌株中，在培养基或其样品中检测到的血清素的量非常低，并且可能甚至低于用于检测血清素的测定的检测极限，即，使用特定测定可以准确检测。因此，这样的产生乳酸的细菌菌株将具有非常高的比率或商。在任选的实施方案中，如在图6中所示的方法因此包括另外的任选的步骤(在图6中未显示)，即确定当在厌氧条件下培养时在步骤s11中在培养基或其样品中检测到的血清素的浓度是否低于阈值，例如在步骤s11中用于检测培养基或其样品中的血清素并确定检测的血清素浓度的测定的检测限。在该任选的实施方案中，只有当在厌氧条件下培养时在步骤s11中在培养基中检测到的浓度等于或高于该阈值时，才在步骤s12中计算比率或商。
53.如果产生乳酸的细菌菌株当在需氧条件下培养时能够产生和释放血清素，但当在厌氧条件下培养时不能，则根据在图6中所示的实施方案，如果在上清液中血清素的浓度为至少0.4 nm，优选至少0.5 nm，例如至少0.75 nm或至少1 nm，优选至少2 nm，更优选至少3 nm，例如至少4 nm，或至少5 nm或至少6 nm或至少7 nm，如下文进一步所述，在步骤s3中仍可以将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
54.从而，本发明的这个实施方案选择在需氧条件下是特别良好的血清素生产者的乳酸细菌菌株，即，与在厌氧条件下相比，在需氧条件下产生至少同样多(优选更多)的血清素。大多数产生乳酸的细菌菌株是厌氧的，其中一些可以在厌氧条件下产生血清素。然而，本发明选择不仅可以在需氧条件下存活和生长而且可以在这样的需氧条件下产生并细胞外释放血清素的乳酸细菌菌株。此外，与厌氧条件相比，根据如在图6中所示的实施方案选择的乳酸细菌菌株事实上在需氧条件下产生至少同样多(如果不是更多)的血清素。当存在于受试者的胃肠系统或胃肠道的生态位中时(其中氧水平比胃肠道的其它部分相对更高)，这样的乳酸细菌菌株可以产生和分泌生物学有效量的血清素，并因此特别适用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病。
55.在实施方案中，图5中的步骤s2包括测量在培养基或其样品中由产生乳酸的细菌菌株产生和释放的血清素的浓度。在该实施方案中，步骤s3包括，如果在培养基或其样品中血清素的浓度至少等于或高于限定的阈值，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏中有效的。
56.对于给定的产生乳酸的细菌菌株，在培养基或其样品中测量的血清素的浓度至少
部分地依赖于用于分析血清素的测定或技术，例如elisa相对于ms。因此，如上所述的阈值的值取决于用于测量培养基中血清素浓度的特定测定。
57.在特定实施方案中，在需氧条件下，在包含色氨酸的培养基(优选dect培养基)中将产生乳酸的细菌菌株的细菌培养24小时，随后取培养基样品，并使培养基样品经受至少一次离心，以获得上清液和沉淀。在这样的情况下，使用常规的质谱法测定在上清液中测量由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生的血清素的浓度。在该特定实施方案中，步骤s3包括如果在上清液中血清素的浓度为至少0.4 nm，优选至少0.5 nm，例如至少0.75 nm或至少1 nm，优选至少2 nm，更优选至少3 nm，例如至少4 nm，或至少5 nm，或至少6 nm，或至少7 nm，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
58.在实施方案中，该方法包括如在图7中所示的另外的步骤s15。该方法开始于该步骤s15，或从图5中的步骤s2继续，或实际上从图6中的步骤s13继续。步骤s15包括确定产生乳酸的细菌菌株的细菌是否能够附着于肠粘液和/或能够粘附于胃肠粘膜。在该实施方案中，图5中的步骤s3包括如果在培养基或其样品中检测到血清素并且产生乳酸的细菌菌株的细菌能够附着于肠粘液和/或能够粘附于胃肠粘膜，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
59.该实施方案也可以与如在图6中所示的实施方案组合，即，基于比率与阈值的比较并且基于产生乳酸的细菌菌株的细菌是否能够附着于肠粘液和/或能够粘附于胃肠粘膜来进行选择。
60.其主要结构组分为粘蛋白(高分子量、高度糖基化的蛋白质家族)的粘液由哺乳动物和鸟类以及两栖动物、鱼、八目鳗、蜗牛和蛞蝓的粘膜产生。因此，由于能够附着于肠粘液，产生乳酸的细菌菌株的细菌可以附着于胃肠道的粘膜。
61.例如，如在实施例6中公开的，可以研究产生乳酸的细菌菌株的细菌附着于胃肠道粘膜的能力。简言之，提取胃肠粘膜并将其铺板于表面上。然后将产生乳酸的细菌菌株的细菌加入到铺板的粘液中，并使其粘附于粘液。然后通过一次或多次洗涤去除未结合的细菌。然后，粘附细菌的量可以直接在粘液上定量，或者间接地如下定量：首先释放粘附细菌，例如通过酶处理，例如胰蛋白酶处理，然后定量释放的细菌。
62.在实施方案中，产生乳酸的细菌菌株的粘液粘附至少与罗伊氏乳杆菌dsm 27131的粘液粘附能力一样好，如在实施例6中所示的。在这样的实施方案中，图7中的步骤s15包括确定产生乳酸的细菌菌株的细菌的粘液粘附能力是否等于或高于罗伊氏乳杆菌dsm 27131的细菌的粘液粘附能力。在该实施方案中，图5中的步骤s3包括如果在培养基或其样品中检测到血清素，以及如果产生乳酸的细菌菌株的细菌的粘液粘附能力等于或高于罗伊氏乳杆菌dsm 27131的细菌的粘液粘附能力，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
63.上述方法及其实施方案是用于鉴定和选择在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的产生乳酸的细菌的体外方法。
64.然而，本发明不限于此。图8是说明作为体内方法进行的用于选择用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的细菌菌株的方法的流程图。该方法包括在步骤s20中用产生乳酸的细菌菌株的细菌喂养(即接种)无菌(gr) tph1-/-受试者。下一步骤s21包括
检测在从gf tph1-/-受试者获取的身体样品中由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生的任何血清素。该方法进一步包括在步骤s22中，如果在身体样品中检测到血清素，则将所述产生乳酸的细菌菌株选择为在治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病中有效的。
65.因此，在该方法中，就无菌测试受试者而言，测试受试者缺乏tph1酶的产生，即是tph1敲除受试者。gf tph1-/-受试者是非人gf tph1-/-动物受试者，并且优选选自小鼠、大鼠、豚鼠、猪、猫、狗、绵羊、马、非人灵长类动物、猴或鸟，并且更优选小鼠或大鼠。gf tph1-/-小鼠可以如在实施例1中所公开的来获得。
66.将在图8中所示的方法中待测试的产生乳酸的细菌菌株的细菌例如以包含细菌的溶解的粉末、胶囊或片剂或包含细菌的溶液的形式喂养(即接种，例如管饲)给gf tph1-/-受试者。
67.从gf tph1-/-受试者取身体样品，并在步骤s21中分析任何血清素的存在。受试者是无菌的，即缺乏或缺少胃肠微生物群，并且另外缺乏tph1 (其是负责大部分内源性血清素产生的酶)。因此，在步骤s21中在身体样品中检测到的任何血清素是由在步骤s20中喂养给受试者的产生乳酸的细菌菌株的细菌或从接种的细菌获得的细菌而产生的。
68.身体样品可以是从gf tph1-/-受试者获取的任何样品，并且如果受试者不是tph1-/-，即相同物种的非gf tph1 / 受试者，则其通常含有血清素。例如，样品可以是胃肠样品、从受试者获取的组织样品(例如从胃肠组织)或体液样品(例如血液样品、血浆样品或血清样品)。在特定实施方案中，身体样品是体液样品，优选血液样品、血浆样品或血清样品。在这样的体液样品中检测到的血清素不仅指示产生乳酸的细菌菌株的细菌能够在gf tph1-/-受试者的胃肠系统中产生并细胞外产生血清素，而且还指示细菌产生的血清素被吸收并转运到gf tph1-/-受试者的体循环(即血液系统)中。
69.在实施方案中，产生乳酸的细菌菌株是乳杆菌属细菌菌株。在特定实施方案中，乳杆菌属细菌菌株选自罗伊氏乳杆菌细菌菌株、粘膜乳杆菌细菌菌株和植物乳杆菌细菌菌株。
70.在实施方案中，当给予受试者时，根据本发明选择的产生乳酸的细菌菌株(例如在图5-8中的任何一个所示)不仅能够产生并细胞外释放血清素，而且能够诱导内源性血清素产生。
71.在另一个实施方案中，当给予受试者时，根据本发明选择的产生乳酸的细菌菌株(例如在图5-8中的任何一个所示)能够产生并细胞外释放血清素，但不能诱导内源性血清素产生。
72.本发明的另一方面涉及产生乳酸的细菌菌株，其能够在需氧条件下产生并在细胞外释放血清素，用于治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病。
73.在实施方案中，产生乳酸的细菌菌株还能够在厌氧条件下产生并细胞外释放血清素，但是在需氧条件下由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生并细胞外产生的血清素的量与在厌氧条件下由产生乳酸的细菌菌株的细菌产生并细胞外产生的血清素的量之间的比率等于或大于1，优选大于1。
74.在实施方案中，产生乳酸的细菌菌株进一步能够附着于肠粘液和/或能够粘附于胃肠粘膜。
33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635、罗伊氏乳杆菌atcc pta 5289和罗伊氏乳杆菌dsm 32465。
88.在另一个特定实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 32846、罗伊氏乳杆菌dsm 32848、罗伊氏乳杆菌dsm 32849、罗伊氏乳杆菌dsm 27131、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635、罗伊氏乳杆菌dsm 17938和罗伊氏乳杆菌dsm 32465。
89.在进一步的实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 32846、罗伊氏乳杆菌dsm 32848、罗伊氏乳杆菌dsm 32849、罗伊氏乳杆菌dsm 27131、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635、罗伊氏乳杆菌atcc pta 6475和罗伊氏乳杆菌dsm 32465。
90.罗伊氏乳杆菌dsm 27131根据布达佩斯条约于2013年4月18日保藏在leibniz institut dsmz-德国微生物菌种保藏中心(inhoffenstr. 7b, d-38124 braunschweig, germany)。
91.罗伊氏乳杆菌dsm 32846、dsm 32848和dsm 32849根据布达佩斯条约于2018年7月4日保藏在leibniz institut dsmz-德国微生物菌种保藏中心(inhoffenstr. 7b, d-38124 braunschweig, germany)。
92.罗伊氏乳杆菌dsm 33509根据布达佩斯条约于2020年4月23日保藏在leibniz institut dsmz-德国微生物菌种保藏中心(inhoffenstr. 7b, d-38124 braunschweig, germany)。
93.罗伊氏乳杆菌dsm 32465根据布达佩斯条约于2017年3月21日保藏在leibniz institute dsmz-德国微生物菌种保藏中心(inhoffenstr. 7b, d-38124 braunschweig, germany)。
94.罗伊氏乳杆菌atcc pta 5289根据布达佩斯条约于2003年6月25日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 university blvd., manassas, va 20110-2209, u.s.)。
95.罗伊氏乳杆菌dsm 33632、dsm 33633、dsm 33634和dsm 33635根据布达佩斯条约于2020年9月9日保藏在leibniz institut dsmz-德国微生物菌种保藏中心(inhoffenstr. 7b, d-38124 braunschweig, germany)。
96.罗伊氏乳杆菌dsm 17938根据布达佩斯条约于2006年1月30日保藏在dsmz-德国微生物菌种保藏中心(mascheroder weg 1b, d-38124 braunschweig, germany)。
97.罗伊氏乳杆菌atcc pta 6475根据布达佩斯条约于2004年12月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 university blvd., manassas, va 20110-2209, u.s.)。
98.在特定实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 32846、罗伊氏乳杆菌dsm 32848、罗伊氏乳杆菌dsm 32849、罗伊氏乳杆菌dsm 27131、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635和罗伊氏乳杆菌dsm 32465。
99.在另一个特定实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635和罗伊氏乳杆菌dsm 33509。
100.在其它特定实施方案中，罗伊氏乳杆菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏
germany)。
110.在特定实施方案中，乳酸细菌菌株选自罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634、罗伊氏乳杆菌dsm 33635和罗伊氏乳杆菌dsm 33509、粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293、粘膜乳杆菌dsm 33661、植物乳杆菌dsm 33295和植物乳杆菌dsm 33662。
111.也可以使用来自两种或更多种产生乳酸的细菌菌株的细菌的组合，例如选自上述提出的粘膜乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌株。
112.在实施方案中，产生乳酸的细菌菌株优选是益生菌细菌菌株。
113.在实施方案中，当与血清素缺乏相关的疾病选自ibs、焦虑、抑郁情绪、创伤后应激障碍、ibd和胃肠动力障碍时，产生乳酸的细菌菌株不是罗伊氏乳杆菌dsm 17938。在另一个实施方案中，产生乳酸的细菌菌株不是罗伊氏乳杆菌dsm 17938。
114.在实施方案中，当与血清素缺乏相关的疾病选自骨质疏松、骨质减少、骨丢失、抑郁情绪、ibs和ibd时，产生乳酸的细菌菌株不是罗伊氏乳杆菌atcc pta 6475。在另一个实施方案中，产生乳酸的细菌菌株不是罗伊氏乳杆菌atcc pta 6475。
115.本发明的进一步的实施方案涉及粘膜乳杆菌菌株dsm 33291，例如冻干或其它干燥形式的粘膜乳杆菌菌株dsm 33291、用作药物的粘膜乳杆菌菌株dsm 33291、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的粘膜乳杆菌菌株dsm 33291以及粘膜乳杆菌菌株dsm 33291用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
116.本发明的另外的实施方案涉及粘膜乳杆菌菌株dsm 33292，例如冻干或其它干燥形式的粘膜乳杆菌菌株dsm 33292、用作药物的粘膜乳杆菌菌株dsm 33292、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的粘膜乳杆菌菌株dsm 33292以及粘膜乳杆菌菌株dsm 33292用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
117.本发明的实施方案进一步涉及粘膜乳杆菌菌株dsm 33293，例如冻干或其它干燥形式的粘膜乳杆菌菌株dsm 33293、用作药物的粘膜乳杆菌菌株dsm 33293和用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的粘膜乳杆菌菌株dsm 33293以及粘膜乳杆菌菌株dsm 33293用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
118.本发明的实施方案还涉及粘膜乳杆菌菌株dsm 33661，例如冻干或其它干燥形式的粘膜乳杆菌菌株dsm 33661、用作药物的粘膜乳杆菌菌株dsm 33661和用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的粘膜乳杆菌菌株dsm 33661以及粘膜乳杆菌菌株dsm 33661用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
119.本发明的进一步的实施方案涉及植物乳杆菌菌株dsm 33295，例如冻干或其它干燥形式的植物乳杆菌菌株dsm 33295、用作药物的植物乳杆菌菌株dsm 33295、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的植物乳杆菌菌株dsm 33295以及植物乳杆菌菌株dsm 33295用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
120.本发明的实施方案进一步涉及植物乳杆菌菌株dsm 33662，例如冻干或其它干燥形式的植物乳杆菌菌株dsm 33662、用作药物的植物乳杆菌菌株dsm 33662、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的植物乳杆菌菌株dsm 33662以及植物乳杆菌菌株dsm 33662用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
121.本发明的另外的实施方案涉及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33509，例如冻干或其它干
燥形式的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33509、用作药物的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33509、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33509以及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33509用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
122.本发明的实施方案涉及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33632，例如冻干或其它干燥形式的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33632、用作药物的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33632、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33632以及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33632用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
123.本发明的实施方案还涉及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33633，例如冻干或其它干燥形式的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33633、用作药物的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33633、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33633以及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33633用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
124.本发明的进一步的实施方案涉及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33634，例如冻干或其它干燥形式的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33634、用作药物的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33634、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33634以及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33634用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
125.本发明的另外的实施方案涉及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33635，例如冻干或其它干燥形式的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33635、用作药物的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33635、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33635以及罗伊氏乳杆菌菌株dsm 33635用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
126.因此，本发明涉及选自例如冻干或其它干燥形式的粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293、粘膜乳杆菌dsm 33661、植物乳杆菌dsm 33295、植物乳杆菌dsm 33662、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634和罗伊氏乳杆菌dsm 33635的产生乳酸的细菌菌株。本发明还涉及选自上述组的产生乳酸的细菌，其用作药物、用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病，以及其用于制造用于治疗血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的药物的用途。
127.本发明的一方面涉及在需氧条件下产生并细胞外释放血清素的细菌菌株。在实施方案中，细菌菌株选自粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293、粘膜乳杆菌dsm 33661、植物乳杆菌dsm 33295、植物乳杆菌dsm 33662、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634和罗伊氏乳杆菌dsm 33635。
128.在特定实施方案中，细菌菌株是选自粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293和粘膜乳杆菌dsm 33661的粘膜乳杆菌菌株。
129.在另一个特定实施方案中，细菌菌株是选自植物乳杆菌dsm 33295和植物乳杆菌
dsm 33662的植物乳杆菌菌株。
130.在其它特定实施方案中，细菌菌株是选自罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634和罗伊氏乳杆菌dsm 33635的罗伊氏乳杆菌菌株。
131.本发明的另一方面涉及在需氧条件下产生并细胞外释放血清素并能够附着于粘液的细菌菌株。在实施方案中，细菌菌株选自粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293、粘膜乳杆菌dsm 33661、植物乳杆菌dsm 33662、罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634和罗伊氏乳杆菌dsm 33635。
132.在特定实施方案中，细菌菌株是选自粘膜乳杆菌dsm 33291、粘膜乳杆菌dsm 33292、粘膜乳杆菌dsm 33293和粘膜乳杆菌dsm 33661的粘膜乳杆菌菌株。
133.在另一个特定实施方案中，细菌菌株是植物乳杆菌dsm 33662。
134.在其它特定实施方案中，细菌菌株是选自罗伊氏乳杆菌dsm 33509、罗伊氏乳杆菌dsm 33632、罗伊氏乳杆菌dsm 33633、罗伊氏乳杆菌dsm 33634和罗伊氏乳杆菌dsm 33635的罗伊氏乳杆菌菌株。
135.产生乳酸的细菌菌株的优选的给药方式是口服。其它给药方式包括鼻、眼内、局部或一些其它形式的局部给药至皮肤、直肠、鼻、眼、阴道或牙龈。
136.根据待治疗的与血清素缺乏相关的疾病、给药方式、受试者和相关的制剂，可以容易地选择如本文定义的产生乳酸的细菌菌株的适当剂量。例如，选择剂量和给药方案，使得根据本发明给予受试者的产生乳酸的细菌可以导致期望的治疗作用、预防作用或健康益处。因此，优选的剂量是治疗或预防有效剂量，其适合于所治疗的哺乳动物类型和血清素缺乏。例如，可以使用104至10
11
，例如105至109、或106至108、或108至10
10
个总菌落形成单位(cfu)的细菌的日剂量。优选的日剂量为约108总cfu，例如，107至109或108至10
9 cfu。
137.优选地，以纯的、分离的、干燥的、冻干的或冷冻干燥的形式给予产生乳酸的细菌菌株。产生乳酸的细菌还可以以冷冻或活性制剂(例如，在发酵食品中)给药。因此，优选以冻干或冷冻干燥形式产生或制备产生乳酸的细菌菌株。
138.优选地，冻干形式的产生乳酸的细菌菌株可以包含在组合物中，除了产生乳酸的细菌菌株之外，所述组合物还包含至少一种赋形剂和/或其它活性剂。这样的赋形剂的非限制性但说明性实例包括填充剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、着色剂、崩解剂、矫味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和媒介物。
139.可以包含在组合物中的其它活性剂包括用于治疗血清素缺乏疾病或病症的任何上述实例的这样的活性剂。
140.本发明的相关方面定义了预防、抑制或治疗受试者的血清素缺乏和/或与血清素缺乏相关的疾病的方法。该方法包括给予受试者能够在需氧条件下产生并细胞外释放血清素的产生乳酸的细菌菌株的细菌。
141.可以使用任何上述给药途径。产生乳酸的细菌菌株可以有利地以如上所述的组合物的形式给药。
142.待用产生乳酸的细菌菌株或组合物治疗的受试者是哺乳动物或鸟类，并优选是人。然而，产生乳酸的细菌菌株或组合物也可以或替代性地用于兽医目的。在这样的情况
下，作为说明性而非限制性的实例，受试者可以例如选自猫、狗、绵羊、山羊、牛、马。
实施例
143.肠微生物群产生影响宿主生理的各种各样的代谢物，例如次级胆汁酸和短链脂肪酸。然而，微生物群具有巨大且相对未开发的转化芳族氨基酸的潜力。本实施例证明，由肠微生物(例如乳杆菌属)在腔中产生的血清素被吸收，并在局部和外周都具有作用。微生物产生的血清素是生物活性的，并且可以挽救肠神经系统的发育表型。本实施例还显示，可以分离出特别好的产生血清素的细菌，并针对其在需氧条件下产生血清素的能力进行选择。这样的产生血清素的细菌也已显示能够在体内产生血清素。
144.实施例1
–
血清素的体外和体内产生以及合适的细菌菌株的评估材料和方法动物8-12周龄的tph1 / (作为同窝对照)和tph1-/-(c57bl/6背景)小鼠关在气候控制室(22
±
2℃)中，经受12h光/暗循环(7:00 am-7:00 pm)，自由获取水和食物。之前描述了tph1-/-小鼠(cell 135: 825-837 (2008))。所有动物程序都得到了瑞典gothenburg动物护理和使用伦理委员会(ethics committee on animal care and use)的批准。动物从杂合育种获得并在实验前进行基因分型。实验后，从每只动物获得近端结肠、来自腔静脉的血清、来自肠腔和盲肠的材料。tph1是在外周(包括胃肠道中)涉及内源性血清素合成的限速酶。因此，tph1敲除(tph1-/-)小鼠在脑外部的内源性血清素产生方面有缺陷。通过定量聚合酶链反应(qpcr)证实tph1-/-小鼠胃肠道中tph1表达的敲除。即使在将动物再衍生为无菌(gf)后，这些敲除动物中保持一些非常低水平的血清素。这些低水平可能是通过补偿机制产生的，这在敲除动物中是常见的，例如通过肠中苯丙氨酸或酪氨酸羟化酶对色氨酸的非特异性羟基化。
145.细菌培养物，乳杆菌属对于体外实验，在厌氧条件下，即coy室内，在色氨酸修饰的脱羧酶(dect)肉汤中培养罗伊氏乳杆菌(dsm 17938、dsm 32846、dsm 32848、dsm 32849、dsm 27131和atcc pta 6475)、植物乳杆菌36e (由culture collection university of gothenburg作为“ccug 61730”获得)，干酪乳杆菌lmg 6904 (由belgian coordinated collections of microorganisms获得)和嗜酸乳杆菌atcc4356 (由美国典型培养物保藏中心获得)。在平行实验中，在环境需氧条件下，在色氨酸修饰的dect肉汤中培养罗伊氏乳杆菌菌株(dsm 17938、dsm 32846、dsm 32848、dsm 32849、dsm 27131和atcc pta 6475)。在24小时对每种培养物取样并离心样品(10,000
×
g，4℃，2分钟)。收集沉淀并保存在20%甘油(防冻剂)中，并在-80℃下冷冻直至使用。
146.色氨酸修饰的dect肉汤设计为促进色氨酸脱羧和细菌产生血清素。dect含有0.5%的牛肉提取物(bd biosciences #212303)、0.1%的酵母提取物(oxoid fisher-scientific #lp0021)、0.05%的d-葡萄糖(millipore #346351)、1%的l-色氨酸(sigma-aldrich #93659)以及(对于厌氧条件)0.05%的半胱氨酸在蒸馏水中。为了获得缺氧变型的dect，加入0.05%的半胱氨酸作为还原剂。将dect在121℃下高压灭菌30分钟，15 psi。
147.小鼠接种实验，乳杆菌属
对于这些实验，如上所述在厌氧条件下培养细菌菌株罗伊氏乳杆菌(dsm 17938、dsm 27131)和干酪乳杆菌(lmg 6904)，但在de man, rogosa and sharpe (mrs)培养基中而不是dect肉汤中。在24小时收集培养物样品，离心(4500
×
g，20分钟，4℃)，然后去除上清液。将细菌沉淀重悬于含有5 ml无菌还原缓冲液(在nahco
3 4 g/l的存在下，与na2s9h2o 0.24 g/l和半胱氨酸0.5g/l混合的还原的和无菌pbs)的hungate管中。将成年tph1-/-小鼠转移至实验隔离器中并禁食4小时。然后用200 μl含有任一细菌菌株的溶液管饲(喂食，接种)小鼠。在接种后14天，从这些动物收集近端结肠、纵向肌肉-肠肌丛(lmmp)和来自腔静脉的血清，并处理用于进一步分析。
148.通过elisa测量血清的血清素离心(5分钟；10,000
×
g；室温(rt)，20-25℃)后使用microvette
®ꢀ
500 z-gel (sarstedt)管从腔静脉收集来自血液样品的血清。根据制造商的说明书，使用elisa试剂盒adi-900-175 (enzo life sciences)评估血清样品中的血清素浓度。
149.通过质谱法(ms)-广谱ms方法在肉汤中测量色氨酸代谢物用含有d6-犬尿氨酸500 nm、d5-5-hiaa 1.25 μm和d4-血清素250 nm作为内标的500 μl甲醇/乙酸[99/1；v/v] (sigma-aldrich, stockholm, sweden)提取肉汤上清液(50 μl)。涡旋和离心后，通过使用正压歧管(biotage ab, uppsala, sweden)将上清液转移通过ostro spe 96-板(waters, milford, ma)来纯化样品。在40℃下氮气流下蒸发洗出液后，将样品在150 μl注射溶剂(甲醇:水[10:90] 0.1%盐酸(v/v))中重构。制备在甲醇/乙酸[99/1；v/v]中含有血清素、色氨酸、5-hiaa、犬尿氨酸、吲哚、色胺和5-羟色氨酸的标准曲线(sigma-aldrich, stockholm, sweden)并以与样品相同的方式处理。将样品和校准曲线样品注入配备waters beh c18柱(2.1
×
100 mm；1.7 μm粒度)的waters acquity uplc系统中。柱温保持在60℃，并且流速为0.4 ml/min。自动取样器的温度保持在10℃。流动相由具有0.1%甲酸的水(a)和具有0.1%甲酸的乙腈(b)组成。梯度洗脱从1% b的等度洗脱开始进行1分钟。然后梯度从1-15% b线性增加进行2分钟，接着15-99% b进行1分钟。在99% b等度洗脱1分钟后，梯度回到1% b并保持2分钟，总运行时间为7分钟。使用正电喷雾，使用xevo tq-xs (waters, milford, ma)检测色氨酸代谢物。在优化之后，离子源参数为：毛细管：1.00 kv，脱溶温度500℃，脱溶气体流量1000 l/h，锥体气体流量150 l/h，喷雾器气体压力7.0巴，锥体电压(v)和碰撞能量(ev)：血清素30 v和10 ev；色氨酸25 v和25 ev；5-hiaa 20 v和20 ev；犬尿氨酸20 v和18 ev；吲哚50 v和23 ev；色胺20 v和18 ev；5-羟色氨酸25 v和18 ev。选择最强的前体/产物离子跃迁。因此，所用的mrm跃迁是：血清素m/z 177.1 》 160.3；色氨酸205.2 》 118.25；5-hiaa 192.4 》 146.2；犬尿氨酸209.1 》 146.1；吲哚118.2 》 91.2；色胺161.3 》 144.3；5-羟色氨酸221.2 》 162.2；d6-犬尿氨酸215.1 》 152.1；d4-血清素181.2 》 164.2；d5-5-hiaa 197.3 》 151.2 。停留时间为24 ms。
[0150]
通过质谱法(ms) (血清素特异性灵敏的ms)测量在肉汤中的血清素用含有血清素(未标记的)作为校准物和d6-犬尿氨酸500 nm作为内标(sigma-aldrich, stockholm, sweden)的250
ꢀµ
l甲醇/乙酸[99/1；v/v] 提取肉汤上清液(50
ꢀµ
l)。涡旋和离心后，通过使用正压歧管(biotage ab, uppsala, sweden)将上清液转移通过ostro spe 96-板(waters, milford, ma)来纯化样品。在40℃下氮气流下蒸发洗出液后，将样品在150 μl注射溶剂(甲醇:水[10:90] 0.1%盐酸(v/v))中重构。制备在甲醇/乙酸
[99/1；v/v]中含有血清素的标准曲线(sigma-aldrich, stockholm, sweden)并以与样品相同的方式处理。将样品和校准曲线样品注入配备waters beh c18柱(2.1
×
100 mm；1.7 μm粒度)的waters acquity uplc系统中。柱温保持在60℃，并且流速为0.4 ml/min。自动取样器的温度保持在10℃。流动相由具有0.1%甲酸的水(a)和具有0.1%甲酸的乙腈(b)组成。梯度洗脱从1% b的等度洗脱开始进行1分钟。然后梯度从1-15% b线性增加进行2分钟，接着15-99% b进行1分钟。在99% b等度洗脱1分钟后，梯度回到1% b并保持2分钟，总运行时间为7分钟。使用正电喷雾，使用xevo tq-xs (waters, milford, ma)检测血清素。在优化之后，离子源参数为：毛细管：1.00 kv，脱溶温度500℃，脱溶气体流量1000 l/h，锥体气体流量150 l/h，喷雾器气体压力7.0巴，锥体电压(v)和碰撞能量(ev)：血清素30 v和10 ev。选择最强的前体/产物离子跃迁。因此，所用的mrm跃迁是：血清素m/z 177.1 》 160.3。停留时间为27 ms。
[0151]
结果产生乳酸的细菌菌株是人肠道中常见的居住者，并且许多产生乳酸的细菌菌株也是研究良好的益生菌细菌。因此，用针对特定色氨酸代谢物(包括血清素)优化的广谱质谱法(ms)测定来测试许多乳杆菌属菌株(包括罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌物种的菌株)的血清素产生能力，以鉴定具有在厌氧和需氧条件下产生血清素的能力的细菌菌株。使用该方法，发现所有测试的罗伊氏乳杆菌菌株在dect肉汤中厌氧培养24小时时产生血清素(图1a和表1)。令人惊讶的是，当罗伊氏乳杆菌细菌菌株在dect肉汤中需氧培养24小时，也发现它们产生血清素(图1a和表1)。重要地，并且甚至更令人惊讶地，与在厌氧条件下相比，罗伊氏乳杆菌菌株在需氧条件下产生的血清素水平显著更高，导致需氧/厌氧血清素产生的比率大于1.0 (》1.0)。相反，当在厌氧条件下培养时，其它测试的细菌菌株(即干酪乳杆菌lmg 6904、植物乳杆菌36e或嗜酸乳杆菌atcc 4356)没有发现血清素产生(表1)。
[0152]
表1-在dect中，需氧或厌氧条件(nm)，对于不同的乳杆菌属细菌菌株的血清素产生，如通过广谱ms方法测量的
还使用另一种血清素特异性和更灵敏的质谱方法测试了三种菌株(干酪乳杆菌lmg 6904、植物乳杆菌36e和嗜酸乳杆菌atcc 4356)的血清素产生。使用该方法，在厌氧条件下培养后，在从所有这些细菌菌株获得的培养基中检测到低或非常低水平的血清素(表2)。然而，在需氧条件下培养这些细菌菌株后，用这种灵敏的血清素特异性方法没有检测到血清素(表2)。
[0153]
表2-在dect中，需氧或厌氧条件(nm)，对于不同的乳杆菌属细菌菌株的血清素产生，如通过血清素特异性灵敏的ms方法测量的这些结果指示，一些但不是全部的产生乳酸的细菌菌株能够在厌氧和/或需氧条件下产生血清素。此外，一些产生乳酸的细菌菌株能够在厌氧条件下产生血清素，但在需氧条件下不能产生血清素。结果还证明，在模拟胃肠道的体内条件的体外条件下，不同的产生乳酸的细菌菌株是比其它产生乳酸的细菌菌株更好的血清素生产者。
[0154]
在进一步的实验中，并研究由罗伊氏乳杆菌细菌菌株产生的血清素是否是生物活性的，并且是否可以被转运到tph1-/-gf小鼠体内的循环血清素库中并有助于循环血清素库。缺乏内源性血清素产生的这些小鼠接种罗伊氏乳杆菌dsm 17938或罗伊氏乳杆菌dsm 27131。在接种任一种罗伊氏乳杆菌菌株后，使用elisa观察到tph1-/-gf小鼠血清的血清素水平的增加(图1b)，并且与接种dsm 17938相比，dsm 27131的增加更显著。相反，当gf tph1-/-小鼠接种干酪乳杆菌lmg 6904时，其在体外不产生血清素(图1a，表1，表2)，血清的血清素水平不增加(图1b)。这些实验的结果清楚地显示，特定的乳杆菌属物种和特定的产生乳酸的细菌菌株具有在胃肠道中局部产生血清素的能力，该血清素对宿主是可生物利用的，并且可以从胃肠道转运到外周，因此，对胃肠和全身性血清素库都有贡献。
[0155]
因此，结果指示罗伊氏乳杆菌dsm 17938和罗伊氏乳杆菌dsm 27131是产生乳酸的细菌菌株的实例，其可以基于它们的需氧血清素产生、高比率的需氧/厌氧血清素产生而选择，并且它们可以用于增加体内血清素水平。这两种细菌菌株和其它产生乳酸的细菌菌株(例如表1的罗伊氏乳杆菌菌株)在需氧条件下具有相同或相似的产生血清素的能力，因此可以被认为在治疗血清素缺乏和与血清素缺乏相关的疾病中是有效的。另一方面，尽管在厌氧条件下能够产生低水平的血清素，基于在体外需氧条件下不能产生血清素，不选择或认为例如植物乳杆菌36e、干酪乳杆菌lmg 6904或嗜酸乳杆菌atcc 4356的细菌菌株在治疗血清素缺乏方面是有效的。
[0156]
实施例2-血清素的体外和体内产生和另外的合适的细菌菌株的评估由于发现实施例1中的罗伊氏乳杆菌细菌菌株在厌氧和需氧条件下都是血清素的良好生产者，评估许多另外的罗伊氏乳杆菌细菌菌株(表3)的血清素产生。
[0157]
材料和方法使用血清素特异性和灵敏的ms方法，如实施例1中所述进行所有的细菌培养和血清素测量方法。在本实施例中测试的产生乳酸的细菌菌株和血清素的检测水平列于下表3中。
[0158]
结果将另外的罗伊氏乳杆菌细菌菌株在dect中厌氧和需氧培养24小时，然后评估在各自的培养基中血清素的浓度(表3)。发现所有这些另外的罗伊氏乳杆菌细菌菌株在厌氧条件下能够产生低量的、但可检测量的血清素。进一步发现，与在厌氧条件下相比，所有这些罗伊氏乳杆菌细菌菌株在需氧条件下产生更多的血清素(表3)。因此，可以选择所有这些罗伊氏乳杆菌菌株作为根据本发明的合适的菌株，用于治疗血清素缺乏和与血清素缺乏相关的疾病。
[0159]
表3-在dect中，需氧或厌氧条件(nm)，对于另外的罗伊氏乳杆菌细菌菌株的血清素产生，如通过血清素特异性灵敏的ms方法测量的实施例3-细菌产生的血清素对ens发育具有体内作用，并且对结肠中的隐窝神经支配是关键的材料和方法细菌培养物，小鼠盲肠从常规tph1 / 小鼠收集盲肠，并在37℃下在厌氧条件下在dect中培养48小时。此时离心样品(10,000
×
g，4℃，2分钟)并收集沉淀。将沉淀保存在20%甘油(防冻剂)中并在-80℃下冷冻直至使用。
[0160]
细菌培养物，乳杆菌属对于体内实验，将罗伊氏乳杆菌dsm 27131和干酪乳杆菌lmg 6904在厌氧条件下在mrs中培养。在24小时对每种培养物取样并离心样品(10,000
×
g，4℃，2 min)。将沉淀保存在20%甘油(防冻剂)中并在-80℃下冷冻直至使用。
[0161]
小鼠接种实验，小鼠盲肠和乳杆菌属对于这些实验，使用小鼠盲肠，在dect肉汤中小鼠盲肠内容物的48小时培养物或
在mrs中罗伊氏乳杆菌dsm 27131和干酪乳杆菌lmg 6904的24小时培养物。将从小鼠盲肠和乳杆菌培养物获得的沉淀重悬于含有5 ml无菌还原缓冲液(在nahco
3 4 g/l存在下，与na2s9h2o 0.24 g/l和半胱氨酸0.5g/l混合的还原的和无菌的pbs)的hugate管中。将成年tph1-/-小鼠转移至实验隔离器并禁食4小时。用200 μl含有来自小鼠盲肠的细菌或乳杆菌的溶液管饲小鼠。在接种后14天，从这些动物收集近端结肠、lmmp、来自腔静脉的血清、结肠和盲肠的腔内容物。
[0162]
免疫组织化学将近端结肠样品在4℃下在pfa 4%中固定过夜，并在切片前在4℃下保持在70% etoh中。将组织包埋在石蜡中，并通过用leica系统的连续步骤(tissuclear 2
×
12分钟；99 % etoh 2
×
2分钟；95 % etoh 2
×
2分钟)将10μm厚的切片脱蜡。对于抗原修复，将载玻片与10 mm柠檬酸钠/0.05% tween
®ꢀ
20溶液(ph 6.0)一起孵育，在水浴(95℃)中加温20分钟，在室温下孵育20分钟，并用pbs-0.05% tween
®ꢀ
20漂洗两次。接着，将载玻片与封闭溶液(pbs/4% bsa/4%驴血清)在室温下孵育1小时；与在封闭溶液中稀释的一抗(表4)在4℃下孵育过夜；与在封闭溶液中稀释的二抗(表4)在室温下孵育1小时；和与hoechst溶液在室温下孵育5分钟。从与一抗孵育开始，每个孵育步骤后接着在pbs中的两个洗涤步骤。载玻片用封固剂(dako)封固。
[0163]
表4-用于免疫组织化学的抗体解剖后，将lmmp样品在4℃下固定在pfa 4%中过夜，并用冷pbs漂洗3次，达10分钟。接着，在4℃下将lmmp保持在nan3溶液(在pbs中稀释的nan
3 0.1%)中直到免疫染色。将lmmp样品在300 μl封闭溶液(triton x100 0.5%，bsa 4%和驴血清4%在nan
3 0.1 %溶液中)中孵育1小时。接着，将组织与在封闭溶液中稀释的一抗(表4)孵育过夜，接着用pbs洗涤3次，10分钟，并与二抗(表4)孵育1.5小时。将组织用pbs洗涤3次，10分钟，并与hoechst溶液孵育5分钟，并再次用pbs洗涤3次，10分钟。用荧光封固剂溶液封固lmmp样品。
[0164]
使用配备有20
×
/0.8 na物镜和black zen软件(carl zeiss)的zeiss激光扫描倒置显微镜lsm-700，通过共焦显微镜使免疫染色的组织成像。
[0165]
pgp9.5和tuj1是成熟肠神经元的公认标志物。因此，对于近端结肠，定量在结肠组织内的pgp9.5或tuj1的免疫阳性区域的百分比，并计数对于血清素阳性的上皮细胞的数目，并除以粘膜面积。每个组织分析2-3个图像，且每个动物分析3个组织样品。
[0166]
对于ens免疫染色，定量对于血清素阳性的荧光面积。每个组织样品分析2-3个图像。
[0167]
结果
由于血清素对于ens的正常发育和成熟是必需的，研究了微生物产生的血清素对小鼠ens发育的作用(图2a-2f)。免疫染色揭示，小鼠盲肠微生物群在gf tph1-/-小鼠中的定居增加了近端结肠的肠神经元内的血清素水平(图2a)。盲肠微生物群的存在也增加了结肠组织内成熟肠神经元的充分建立的标志物pgp9.5和tuj1(图2b和2c)，证明细菌产生的血清素在ens发育和成熟中起作用。gf tph1-/-小鼠也接种罗伊氏乳杆菌dsm 27131或干酪乳杆菌lmg 6904达14天，并评估用血清素补充ens。发现接种罗伊氏乳杆菌dsm 27131 (其先前已显示在体外以及体内需氧条件下产生血清素)增加神经元血清素水平(图2d)，并且dsm 27131还增加近端结肠中的成熟神经元标志物pgp9.5和tuj1，而不产生血清素的干酪乳杆菌lmg 6904不影响近端结肠中的神经元血清素水平或神经元成熟标志物。
[0168]
实施例4-产生血清素的人细菌菌株的分离和选择材料和方法人粪便收集从30-50岁之间的三个健康供体进行人粪便取样。志愿者是未经治疗的并且没有服用任何抗生素。根据瑞典的伦理政策和规定进行人粪便取样和样品的后续使用。
[0169]
细菌培养物-人粪便在厌氧条件下，即在coy室中，或在环境需氧条件下，将新鲜排泄的人粪便(1% (w/v)接种物)接种到dect肉汤中。在不同的时间点(0h(即接种前)，12h，24h，36h，48h，60h)对每种培养物取样，并将样品离心(10,000
×
g，4℃，2分钟)。将上清液和沉淀在-80℃下冷冻。上清液用于血清素测量，并且沉淀用于通过利用16s rrna基因分析来分析样品内的细菌群落。如上所述，也从每个时间点保存每个样品的一个甘油储备液。
[0170]
细菌血清素生产者的分离根据实施例1制备dect肉汤。lybhi培养基含有脑心浸液(bhi) 3.7% (oxoid fisher-scientific # cm1135)、l-半胱氨酸0.05% (sigma-aldrich #w326305)、d-( )-纤维二糖0.1 % (sigma-aldrich #22150)、麦芽糖0.1%和氯高铁血红素0.0006% (sigma-aldrich #51280)。为了获得缺氧变型的dect和lybhi，加入半胱氨酸0.05 %作为还原剂。将生长培养基在121℃下高压灭菌30分钟，15 psi。将从在dect肉汤中培养的人粪便中获得的36 h甘油原液在厌氧条件下铺板于lybhi (lybhi肉汤，具有2 %琼脂；nordic biolabs #214010)、dect (dect肉汤，具有2 %琼脂)和mrs (50 g的mrs粉末，得自sigma-aldrich (sigma-aldrich #69966)和1 ml的tween
®ꢀ
80 (sigma-aldrich #p8074)在1 l蒸馏水中，具有2 %琼脂)板中。铺板进行3次，意味着第二培养板从第一板中最富集的区域取样到第二板上进行铺板，并从第二板到第三板进行铺板。然后将每个分离的菌落分别在lybhi、dect和mrs中培养，以制备甘油原液并在离心(10,000
×
g，4℃，2分钟)后收获dna。进行dna收获以进行16s rrna基因测序来鉴定每个细菌菌株。通过革兰氏染色检查每种分离株的纯度。对于血清素产生动力学，将每种分离株在dect肉汤中在需氧和厌氧条件下培养24小时。此后，收集来自培养物的样品并离心(10,000
×
g，4℃，2分钟)以收获上清液并分析血清素的水平。
[0171]
总粪便基因组dna基因组的提取根据制造商的说明书，但改变细胞裂解步骤，使用nucleospin soil试剂盒(macherey-nagel, germany)从获自1.5 ml培养样品的沉淀中分离dna。将样品悬浮于加入
sx的sl2缓冲液中，然后在涡旋中伴随水平适配器以最大速度混合2分钟。通过在90℃下加热10分钟，接着使用fastprep-24仪器(mp biomedicals)以5.5 m/s的速度打珠三次达60s，使细胞裂解。将加热和打珠步骤再重复一次，并且在使用试剂盒中的柱纯化之前合并来自两次提取的上清液。使用洗脱缓冲液洗脱dna，并使用nanodrop分光光度计检查dna浓度和质量。
[0172]
分离株的16s rrna基因测序和鉴定使用设计用于双索引(appl environ microbiol 79: 5112-5120 (2013))的27f和1492r引物扩增全长16s rrna基因。在含有hotstartaq master mix 2x (qiagen)、10
ꢀµ
mol/l每种引物和250 ng基因组dna的50 μl反应物中扩增每种样品。pcr在下列条件下进行：在94℃下初始变性5分钟，接着在94℃下26个循环的变性30秒，在52℃下退火40秒和在72℃下延伸90秒，和在72℃下7分钟的最后延伸步骤。用nucleospin gel和pcr净化试剂盒(macherey-nagel)纯化样品，并使用nanodrop分光光度计定量。制备10 ng/μl在40 μl体积中的稀释液，并送去eurofins测序。获得每种分离株的正向和反向扩增序列，并比对以找到共有序列。然后使用来自ncbi的基本局部比对搜索工具对共有序列进行blast，以鉴定细菌。
[0173]
通过血清素特异性灵敏的ms方法测量在肉汤中的血清素使用如在实施例1中所述的血清素特异性和灵敏的质谱法方法定量由这些细菌菌株产生的血清素。
[0174]
结果血清素产生为了鉴定来自人肠的产生血清素的微生物，在厌氧条件下，在dect中培养来自血清素总产量最高的两个供体(即供体#1和供体#2)的粪便样品。使用lybhi/dect和mrs琼脂板总共获得199种分离株，来自供体#1的122种细菌分离株和来自供体#2的77种细菌分离株。然后通过将获得的分离株作为单一培养物在厌氧或需氧条件下生长来确定这些分离株的血清素产生水平。在199种分离株中，只有来自供体#1的6种分离株和来自供体#2的11种分离株在厌氧条件下在dect肉汤中产生可检测水平的血清素(表5；图3)。在199种分离株中，发现总共24种分离株在需氧条件下产生血清素，并且这些分离株包括在厌氧条件下也产生血清素的那些分离株。对于所有这24种分离株，与在厌氧条件下相比，在需氧条件下的血清素产生得到改进。全长16s rrna测序分析鉴定了24种分离株为粘膜乳杆菌(n=13)、植物乳杆菌(n=6)和肠球菌属(n=1) (表5)。最后，没有清楚地鉴定来自供体#2的四种分离株，但是这些分离株与埃希氏杆菌属、志贺氏菌属或brenneria细菌菌株紧密比对(表5)。尽管如此，这些结果表明乳杆菌属在厌氧和需氧条件下均在血清素产生中的重要作用，尤其是粘膜乳杆菌和植物乳杆菌细菌菌株的重要作用。
[0175]
选择属于粘膜乳杆菌或植物乳杆菌的在需氧条件下良好产生血清素的产生乳酸的细菌菌株(表5)。更详细地，基于在需氧条件下细菌菌株的血清素产生，选择细菌菌株粘膜乳杆菌h1d22g、h1m31d、h1m31g和h1m32d和植物乳杆菌h2m3e和h2m3i并保藏在dsmz (分别相应的保藏编号为dsm 33291、dsm 33292、dsm 33293、dsm 33661、dsm 33662和dsm 33295)。
[0176]
表5-分离的产生人血清素的菌株和体外血清素产生，如通过血清素特异性灵敏的
ms方法测量的
(sarstedt)管制备从腔静脉收集的来自血液样品的血清。从近端结肠或从盲肠取样胃肠道的腔内含物。称量腔内容物并快速冷冻。然后如下从腔内容物中提取血清素。将一定体积的tris-hcl 25 mm/edta 1 mm/egta 1 mm溶液加入到每个样品中(w/v为1 mg/2 μl)，用5 mm钢珠和tissuelyser (qiagen，25 hz，2分钟)均化，在4℃下孵育过夜，并在4℃下10,000
×
g离心20分钟。收集每个样品的上清液并保持在-80℃下直到分析。从细菌培养物中获得肉汤上清液以测定血清素，并且未培养的肉汤用作空白。根据制造商的说明书，使用elisa试剂盒adi-900-175 (enzo life sciences)评估来自所有样品的血清素。
[0179]
近端结肠中的血清素免疫阳性区域如在实施例3中所述分析和定量来自近端结肠区域的组织样品中的血清素免疫阳性。
[0180]
结果基于人细菌菌株在体外厌氧和需氧条件下的血清素产生来选择两种分离的人细菌菌株(粘膜乳杆菌dsm 33661和植物乳杆菌dsm 33662)。发现这些菌株在体内也产生功能性血清素(图4)。该图显示，与在相应的无菌小鼠中发现的水平相比，这两种细菌菌株在肠腔局部地(图4a)和在体循环中(血清样品，图4b)都能够增加血清素水平。此外，发现这两种人菌株都增加近端结肠的ens中血清素阳性区域(图4c)。因此，这些人细菌菌株能够在体内增加肠腔(盲肠)中局部血清素水平，并且这种局部产生的血清素是生物活性的，并且可以被转运到体循环(血清)中和近端结肠的肠神经系统的神经元中。结果指示，可以分离、鉴定和选择产生血清素的人共生细菌菌株，以增加体内血清素水平。
[0181]
实施例6-通过产生血清素的细菌菌株粘附于粘液材料和方法粘液的制备和板包被从猪小肠制备粘液。用刮铲刮取5 cm肠的内部，取出材料并收集在5 ml冰冷的pbs中。将所得悬浮液首先在11,000
×
g下离心10分钟，然后在26,000
×
g下离心15分钟以去除细胞和颗粒物质。将粘液制备物储存在-20℃下直到使用。将粘液材料在pbs (ph 6.0)中稀释至a
280
=0.1 (在280 nm处的吸光度=0.1)，并在微量滴定孔(nunc maxisorb)中于4℃下伴随缓慢搅动孵育过夜(每孔150 μl)。此后用具有0.05% tween
®ꢀ
20的pbs (ph 6.0) (pbst)洗涤孔，此后用0.2 ml具有1% tween
®ꢀ
20的pbs (ph 6.0)封闭1小时，并最后用pbst洗涤两次。
[0182]
细菌的制备用下列细菌菌株进行粘液粘附实验：罗伊氏乳杆菌dsm 27131、dsm 32465、dsm 33632、dsm 33633、dsm 33634、dsm 33635和dsm 33509；粘膜乳杆菌dsm 33291、dsm 33292、dsm 33293和dsm 33661；和植物乳杆菌dsm 33662。在-70℃下从冷冻原液接种每种乳杆菌属菌株，并在37℃下在10 ml mrs肉汤(merck)中生长16小时。在600 nm下测量od，并将样品稀释至od 0.5 (总体积为1 ml)。然后用pbst (ph 7.4)洗涤稀释的细菌溶液两次，并重悬于pbst (ph 6.0)中。最后洗涤并重悬于pbst (ph 6.0)后，将细菌稀释并铺板于mrs琼脂上以分析起始值(菌落形成单位(cfu)/ml)。将相同的细菌悬浮液用于结合实验。
[0183]
粘液结合、胰蛋白酶释放和定量将细菌悬浮液(150 μl)加入到每个孔中，并在37℃下伴随缓慢搅动孵育4小时。用
pbst (ph 6.0)洗涤孔4次，以去除未结合的细菌。洗涤后，将150 μl胰蛋白酶edta溶液(0.25%猪胰蛋白酶和1 mm edta
ꢀ•ꢀ
4na在hanks'平衡盐溶液中)加入到孔中，并在37℃下孵育30分钟。然后，将释放的细菌充分混合，连续稀释并铺板在mrs琼脂板上。将板在37℃下厌氧条件下孵育24小时，然后计数菌落(菌落形成单位(cfu))，并计算每孔的粘附细菌的数目。
[0184]
结果研究产生血清素的乳酸细菌是否也能够在体外附着于粘液，这指示它们也能够在体内附着，特别是附着于肠粘膜，并从而使得细菌产生和分泌的血清素能够被肠粘膜(特别是被肠上皮)摄取。基于细菌菌株在需氧条件下产生血清素的能力来选择测试粘附的细菌菌株。发现罗伊氏乳杆菌dsm 27131能够附着于粘液(图10a)，其能够在体外需氧条件下产生血清素，并且还能够在体内有助于全身血清素库。使用所有其它测试的罗伊氏乳杆菌菌株(dsm 32465、dsm 33632、dsm 33633、dsm 33634、dsm 33635和dsm 33509)以及使用所有其它测试的粘膜乳杆菌菌株(dsm 33291、dsm 33292、dsm 33293、dsm 33661)和植物乳杆菌菌株(dsm 33662) (图10a和10b)也观察到这种能力并且进一步增加。还发现，与它们相应的亲本菌株的粘附能力相比，每种罗伊氏乳杆菌细菌菌株dsm 33632、dsm 33633、dsm 33634、dsm 33635和dsm 33509的粘附能力得到改进(数据未显示)。这些结果指示，物种罗伊氏乳杆菌、粘膜乳杆菌和植物乳杆菌的某些乳酸细菌菌株能够附着于肠粘膜，在那里然后可以产生代谢物(例如血清素)并靠近胃肠道的肠上皮内衬分泌。
[0185]
实施例7-用于血清素缺乏的油基配制的益生菌产品的制造在该实施例中，制造用于血清素缺乏的益生菌产品。如本文所公开的，选择能够在需氧条件下产生血清素的产生乳酸的细菌菌株，例如在实施例1、2、4或6中的任何乳杆菌属细菌菌株。然后使用工业上用于生长乳杆菌属细菌菌株的标准方法，将这些菌株单独生长为纯培养物并冻干。该产品是具有单一(纯)细菌菌株的油基制剂，其被制备用于良好的稳定性和储存期限。该产生方法的独特特征是通过将油放置在真空下以去除油中的大部分水并增加制剂的稳定性来干燥油的步骤。本文所用的油是纯的可食用植物油，优选向日葵油和中链甘油三酯。
[0186]
成分的混合。
[0187]
1. 在bolz混合机/罐(alfred bolz apparatebau gmbh, wangen im allg
ä
u, germany)中将中链甘油三酯(例如，akomed r (karlshamns ab, karlshamn sweden))和向日葵油(例如，akosun (karlshamns ab, karlshamn sweden))与二氧化硅(cab-o-sil m5p, m5p, cabot)混合。
[0188]
2. 均化。将正弦泵和dispax (sine pump, arvada, colorado)连接到bolz混合机，并将混合物均化。
[0189]
3. 真空干燥。在bolz罐中在10毫巴真空下将混合物干燥12小时。
[0190]
4. 加入乳杆菌属细菌。将约20 kg干燥的油混合物移至50升不锈钢容器中。加入乳杆菌属细菌粉末(优选冷冻干燥的)；所用的乳杆菌属细菌的量将根据油中所需的量而变化，但一个实例是加入0.2 kg具有10
11 cfu/g的培养物。缓慢混合直至均匀。
[0191]
5. 混合。将含有乳杆菌属细菌的预混合物送回bolz混合机。
[0192]
6. 出料。将悬浮液排出到200升玻璃容器中并用氮气覆盖。将悬浮液保持在容器
中，直至装入喷雾瓶中，用于口服给予人，用于预防或治疗血清素缺乏。
[0193]
实施例8-用于血清素缺乏的片剂形式的益生菌产品的制造在该实施例中，能够在需氧条件下产生血清素的乳杆菌属菌株用于制造用于预防、抑制和/或治疗人的血清素缺乏的片剂。使用工业上生长乳酸杆菌的标准方法，使乳杆菌属菌株生长并冻干。
[0194]
以下步骤说明含有选择的细菌菌株的片剂的制造方法的实例，包括葡萄糖包封。应理解，可以使用赋形剂、填充剂、调味剂、胶囊包封剂、润滑剂、抗结块剂、甜味剂和本领域已知的片剂产品的其它组分，而不影响产品的功效：1. 熔化。在容器中熔化softisan
™ꢀ
154 (sasol gmbh, bad homburg, germany)并将其加热至70℃以确保晶体结构的完全破坏。然后将其冷却至52-55℃(刚好高于其硬化点)。
[0195]
2. 造粒。将乳杆菌属细菌冷冻干燥的粉末转移至diosna高剪切混合机/造粒机或等同物中。在约1分钟期间缓慢地将熔化的softisan
™ꢀ
154加入到乳杆菌属细菌粉末中。加入期间使用切碎机。
[0196]
3. 湿法筛分。造粒后立即通过使用tornado磨将颗粒通过1 mm筛网。将过筛的颗粒包装在由pvc涂布的铝箔制成的铝袋中，用热封机密封以形成小袋，与干燥剂小袋一起，并冷藏储存直至混合。将造粒的批料分成两个片剂批料。
[0197]
4. 加入包封的d-葡萄糖(g8270，》99.5%葡萄糖，sigma)，使用本领域已知的标准微囊化方法包封。糖的量取决于加入的干燥乳杆菌属细菌粉末的总cfu，标准水平可以是1g糖/108个细菌的总cfu，但这也可以变化至低至0.1g或0.01g到至多10g，甚至至多100g糖。
[0198]
5. 混合。在混合机中将所有成分混合成均匀的共混物。
[0199]
6. 压缩。将最终的共混物转移至旋转压片机的料斗中，并在kilian压缩机中压制总重765 mg的片剂。
[0200]
7. 散装包装。将片剂与分子筛干燥袋一起包装在铝袋中。在最后包装之前，将铝袋放在塑料桶中并在冷却的地方储存至少一周。使用softisan
™ꢀ
(氢化棕榈油)能够将乳杆菌属细胞包封在脂肪中并在环境上受到保护。
[0201]
如上所述，实施方案的产品可以是除片剂以外的形式，并且如本领域已知的制备基本产品的标准方法有利地用于制备本发明的产品，包括选择的乳杆菌属培养物。
[0202]
上述实施方案应理解为本发明的几个说明性示例。本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对实施方案进行各种修改、组合和改变。特别地，不同实施方案中的不同部分解决方案可以在技术上可能的情况下以其它配置组合。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。