一种偶发分枝杆菌的快速鉴定试剂盒及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种偶发分枝杆菌的快速鉴定试剂盒及其应用。


背景技术：

2.偶发分枝杆菌为非典型分枝杆菌中的快速生长型分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria，rgm)，目前已知rgm中包含75种致病菌，其中偶发分枝杆菌为最常见的rgm之一。此菌广泛存在于自然界(如水源、土壤)中，人类感染多见于医源性器械污染至创口的感染如注射、手术等。
3.偶发分枝杆菌的传统诊断方法主要依靠病原菌的培养，但耗时较长，需要3-5天，不利于疾病的早诊断、早治疗。基于pcr的分子鉴定方法因其高灵敏性及快速诊断的优势为分枝杆菌的诊断提供了新的技术手段。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是建立一种采用实时荧光定量pcr技术检测偶发分枝杆菌的方法。
5.第一方面，本发明保护用于鉴定或辅助鉴定偶发分枝杆菌的引物组。
6.本发明保护的用于鉴定或辅助鉴定偶发分枝杆菌的引物组由引物1、引物2和探针组成；
7.所述引物1为如下a1)或a2)：
8.a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；
9.a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；
10.所述引物2为如下a3)或a4)：
11.a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；
12.a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；
13.所述探针为如下a5)或a6)：
14.a5)序列表中序列3所示的单链dna分子；
15.a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子。
16.上述引物组中，所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为5:5:4。
17.第二方面，本发明保护上述引物组在如下b1)-b8)中任一种中的应用：
18.b1)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为偶发分枝杆菌的产品；
19.b2)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为偶发分枝杆菌；
20.b3)制备诊断或辅助诊断待测者是否感染偶发分枝杆菌的产品；
21.b4)诊断或辅助诊断待测者是否感染偶发分枝杆菌；
22.b5)制备检测或辅助检测待测样品是否含有偶发分枝杆菌的产品；
23.b6)检测或辅助检测待测样品是否含有偶发分枝杆菌；
24.b7)制备鉴别或辅助鉴别偶发分枝杆菌与其它分枝杆菌的产品；
25.b8)鉴别或辅助鉴别偶发分枝杆菌与其它分枝杆菌。
26.第三方面，本发明保护含有上述引物组的试剂盒；
27.所述试剂盒的功能为如下c1)-c4)中任一种：
28.c1)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为偶发分枝杆菌；
29.c2)诊断或辅助诊断待测者是否感染偶发分枝杆菌；
30.c3)检测或辅助检测待测样品是否含有偶发分枝杆菌；
31.c4)鉴别或辅助鉴别偶发分枝杆菌与其它分枝杆菌。
32.进一步的，所述试剂盒还可包括用于鉴定偶发分枝杆菌的其他试剂。在本发明中，所述用于鉴定偶发分枝杆菌的其他试剂可为taqman gene expression master mix。
33.更进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照(如ddh2o)和阳性对照(如偶发分枝杆菌标准菌株(19709
tm
)的基因组dna)。
34.第四方面，本发明保护上述试剂盒的制备方法，所述制备方法为如下d1)或d2)：
35.d1)将上述引物组中的各条引物分别单独包装；
36.d2)将上述引物组中的各条引物按比例混合在一起。
37.进一步的，所述d2)中，所述引物组中的所述引物1、所述引物2和所述探针按照摩尔比为5:5:4的比例混合在一起。
38.第五方面，本发明保护一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为偶发分枝杆菌的方法。
39.本发明保护的鉴定或辅助鉴定待测菌是否为偶发分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测菌的核酸，以待测菌核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量pcr；反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测菌是否为偶发分枝杆菌：若待测菌有s型扩增曲线且ct值＜35，则待测菌为或候选为偶发分枝杆菌；否则待测菌不为或候选不为偶发分枝杆菌。
40.第六方面，本发明保护一种诊断或辅助诊断待测者是否感染偶发分枝杆菌的方法。
41.本发明保护的诊断或辅助诊断待测者是否感染偶发分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测者的核酸，以待测者核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量pcr；反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测者是否感染偶发分枝杆菌：若待测者有s型扩增曲线且ct值＜35，则待测者感染或候选感染偶发分枝杆菌；否则待测者未感染或候选未感染偶发分枝杆菌。
42.第七方面，本发明保护一种检测或辅助检测待测样品是否含有偶发分枝杆菌的方法。
43.本发明保护的检测或辅助检测待测样品是否含有偶发分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量pcr；反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测样品是否含有偶发分枝杆菌：若待测样品有s型扩增曲线且ct值＜35，则待测样品含有或候选含有偶发分枝杆菌；否则待测样品不含有或候选不含有偶发分枝杆菌。
44.第八方面，本发明保护一种鉴别或辅助鉴别偶发分枝杆菌与其它分枝杆菌的方法。
45.本发明保护的鉴别或辅助鉴别偶发分枝杆菌与其它分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测菌的核酸，以待测菌核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量pcr；反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测菌为偶发分枝杆菌还是其它分枝杆菌：若待测菌有s型扩增曲线且ct值＜35，则待测菌为或候选为偶发分枝杆菌；否则待测菌为或候选为其它分枝杆菌。
46.上述任一所述方法还包括如下步骤：在阴性对照无扩增曲线或ct值＞35且阳性对照有s型扩增曲线且ct值＜35的前提下进行结果判定。
47.上述任一所述方法中，所述引物1和所述引物2在实时荧光定量pcr体系中的终浓度均具体可为7.5μm，所述探针在实时荧光定量pcr体系中的终浓度具体可为6μm。
48.所述实时荧光定量pcr体系具体可由15μl taqman gene expression master mix、0.75μl引物1、0.75μl引物2、0.6μl探针、2μl模板和10.9μl ddh2o组成。
49.所述实时荧光定量pcr反应程序具体可为50℃2min，95℃10min，40个循环(95℃15s、60℃1min)。
50.上述任一所述方法中，所述核酸为基因组dna。
51.上述任一所述应用或试剂盒或方法中，所述其它分枝杆菌可为如下分枝杆菌中的至少一种：海分枝杆菌mycobacterium marinum、龟分枝杆菌mycobacterium chelonei、结核分枝杆菌mycobacterium tuberculosis、嗜血分枝杆菌mycobacterium haemophilum。
52.为解决上述技术问题，本发明进行了如下实验过程：以偶发分枝杆菌特异性基因its为目的基因，设计其特异性引物和探针。然后以偶发分枝杆菌标准菌株为阳性对照，选取经明确诊断的2例偶发分枝杆菌、100例海分枝杆菌、1例龟分枝杆菌、1例结核分枝杆菌和2例嗜血分枝杆菌感染患者的皮肤组织样本的培养菌落为实验组，同时设置空白对照组，通过荧光定量pcr技术对上述样本进行检测。结果显示：实验组中2例偶发分枝杆菌感染患者培养菌落均为阳性，准确度达100％；其余菌落以及空白对照均为阴性，特异度达100％。本发明成功建立了采用实时荧光定量pcr技术检测偶发分枝杆菌的方法，为偶发分枝杆菌感染患者的尽早诊断与治疗提供了有效的技术手段。
具体实施方式
53.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
54.下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
55.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
56.以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
57.下述实施例中的偶发分枝杆菌标准菌株是atcc的产品，编号为19709
tm
。
58.实施例1、用于快速鉴定偶发分枝杆菌的引物组及其鉴定方法
59.一、用于快速鉴定偶发分枝杆菌的引物组及其鉴定方法
60.本发明以偶发分枝杆菌特异性基因its为目的基因，通过primer express software for real-time pcr version 3.0软件设计其特异性引物和探针，具体序列如表
1所示。序列1所示的单链dna分子、序列2所示的单链dna分子和序列3所示的单链dna分子组成本发明的用于快速鉴定偶发分枝杆菌的引物组。
61.表1、特异性引物和探针
[0062][0063]
二、快速鉴定偶发分枝杆菌的qpcr方法
[0064]
1、实验器材
[0065]
(1)仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、4度冰箱、-20度冰箱、-80度冰箱、微量移液器、干式恒温金属浴、离心机、纯水仪、美国abi steponeplus荧光定量pcr等。
[0066]
(2)试剂：dna提取液、引物和探针(invitrogen)、taqman gene expression master mix(thermo fisher，applied biosystems，00826956)。
[0067]
(3)耗材：枪头、1.5ml ep管、八连管等。
[0068]
2、实验方法
[0069]
(1)生物安全柜紫外灯照射30分钟后，从二氧化碳培养箱中取出培养的待测菌菌落，置于生物安全柜中。分别用接种环刮取菌落少许，置于1.5ml ep管中。
[0070]
(2)向含有菌落的1.5ml ep管中加入80μl dna提取液，涡旋振荡10s，然后10000r/min离心10s，使菌落和dna提取液处于ep管底。
[0071]
(3)置于干式恒温金属浴中，100℃，10min，提取菌落dna。
[0072]
(4)将ep管从干式恒温金属浴中取出，10000r/min离心30s，上清液中即含有菌落的核酸。然后置于-80度冰箱中储存，备用。
[0073]
(5)按照表2的配方配制pcr体系(30μl)，引物f、引物r和probe在pcr体系中的终浓度分别为7.5μm、7.5μm、6μm。同时设置阴性对照和阳性对照，阴性对照：ddh2o，阳性对照：偶发分枝杆菌标准菌株(19709
tm
)。
[0074]
表2、反应体系
[0075]
组分1
×
(μl)taqman gene expression master mix15f0.75r0.75probe0.6ddh2o10.9dna模板2
[0076]
(6)采用美国abi steponeplus荧光定量pcr仪进行检测，反应程序为50℃2min，95℃10min，40个循环(95℃15s、60℃1min)。
[0077]
3、结果判定
[0078]
阴阳性对照合格(阴性对照无扩增曲线或ct值＞35，阳性对照有s型扩增曲线且ct值＜35)的前提下，若待测菌有s型扩增曲线且ct值＜35，则待测菌为偶发分枝杆菌，否则待
测菌不为偶发分枝杆菌。
[0079]
实施例2、灵敏度测试
[0080]
一、实验材料
[0081]
将偶发分枝杆菌标准菌株(19709
tm
)的基因组dna溶液进行连续倍比稀释，分别得到浓度依次为103.4ng/l、103.4
×
10-1
ng/l、103.4
×
10-2
ng/l、103.4
×
10-3
ng/l、103.4
×
10-4
ng/l、103.4
×
10-5
ng/l、103.4
×
10-6
ng/l、103.4
×
10-7
ng/l、103.4
×
10-8
ng/l、103.4
×
10-9
ng/l、103.4
×
10-10
ng/l的偶发分枝杆菌dna溶液。
[0082]
二、实验方法与结果
[0083]
分别以不同浓度的偶发分枝杆菌dna溶液为模板，采用实施例1步骤二中的方法进行荧光定量pcr和结果判定。
[0084]
结果表明：本发明检测方法的灵敏度可达103.4
×
10-9
ng/l。
[0085]
实施例3、特异性测试
[0086]
一、实验材料
[0087]
实验材料：感染分枝杆菌患者的皮肤组织样本的培养菌落。分枝杆菌患者具体如下：2例偶发分枝杆菌mycobacterium fortuitum感染患者、100例海分枝杆菌mycobacterium marinum感染患者、1例龟分枝杆菌mycobacterium chelonei感染患者、1例结核分枝杆菌mycobacterium tuberculosis感染患者和2例嗜血分枝杆菌mycobacterium haemophilum感染患者，所有患者均经临床确诊且知情同意。
[0088]
二、实验方法与结果
[0089]
分别从步骤一中的实验材料提取基因组dna，并以提取的dna溶液作为模板，采用实施例1步骤二中的方法进行荧光定量pcr和结果判定。同时以ddh2o为空白对照。
[0090]
结果表明：2例偶发分枝杆菌菌落检测结果均为阳性，准确度达100％，其余菌落以及空白对照均为阴性，特异度达100％。
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。