一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法

1.本发明涉及一种提高微藻产糖的方法，属于生物环保及生物能源技术领域。


背景技术：

2.畜禽养殖是中国污染排放的重要污染源；畜禽养殖废水中有机物含量高，富含氨氮，易造成水体富营养化；为减轻畜禽养殖废水对水环境的污染，前期对养殖废水的处理主要采用物化法和生物法等不同处理技术或组合工艺，但上述技术措施存在运营投资费用高、操作复杂等问题；因此在尾水的深度处理上探索耗能低且效果好的修复技术可降低整体成本，缓解技术压力。
3.此外，能源和资源问题已经成为制约人类社会和谐发展的桎梏，寻找开发清洁代替能源是解决这些问题的有效途径之一；燃料乙醇作为清洁、可再生的能源，备受关注；燃料乙醇具有清洁、可再生的特点，并且制备燃料乙醇的原料易得；目前常用的原料有甘蔗、糖蜜、玉米、水稻、小麦；但是由于人口不断增加造成粮食相对短缺，用粮食大规模生产乙醇存在局限性。
4.微藻具有固碳减排、生长速度快、光捕获效率高、抗逆性强等优势；微藻作为高效的光合微生物，能将太阳能、h2o和co2通过光合作用转化为碳水化合物储存在细胞内；微藻细胞内含有大量的淀粉和纤维素，含量可与玉米和小麦等相媲美；另外，微藻细胞内木质素和半纤维素含量较低，而且与植物细胞中的纤维素iβ不同，微藻细胞内为iα型纤维素，其氢键较弱，更易被降解为单糖，因此微藻是作为燃料乙醇生产的优良原料。
5.值得注意的是，微藻体内糖类含量的高低，是制约利用微藻制备燃料乙醇成本高低的关键；因此，提高藻类碳水化合物含量至关重要；一些研究表明，糖类含量可以在环境压力(光照、温度、营养物质、ph、盐类)条件下增加，例如氮抑制处理后，淀粉或糖原含量得到升高；但是环境条件操作不易控制，会以减少生物量为代价。


技术实现要素：

6.本发明为解决现有微藻体内含糖量较低，导致燃料乙醇制备成本较高的问题，进而提出一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法。
7.本发明为解决上述问题采取的技术方案是：本发明的具体步骤如下：
8.步骤一、将小球藻加入已灭菌的bg-11培养基，然后放入光生物反应器中进行培养，培养至对数期，得到小球藻液；
9.步骤二、将真菌加入已灭菌的ym培养基中，放入恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；
10.步骤三、将步骤一中获得的小球藻液和步骤二中获得的真菌菌液与畜禽尾水混合，并放入光生物反应器中；
11.步骤四、分别在第0天、第2天、第5天对步骤三中的光生物反应器进行出水采集；
12.步骤五、取步骤四中采集获得样品10mg，并记录重量，装于250ml的厌氧瓶内，在厌
氧瓶中加入5ml的3％的稀硫酸于灭菌锅121℃中加热21min；反应结束后，取2ml溶液至10ml离心管中，多次投加碳酸钙粉末直到水解液不再冒出气泡，即ph为中性；9000rpm离心5分钟，上清液过滤后采用液相色谱仪检测，根据结果分析细胞中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度；
13.步骤六、步骤五中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度采用高效液相色谱仪-示差检测器分析，配备87h3色谱柱。
14.进一步的，步骤一中在光生物反应器中的培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体(，co2通气量为2～2.5％；所述微藻为蛋白核小球藻。
15.进一步的，步骤二中真菌在恒温培养摇床中的培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟；所述真菌为汉逊徳巴利酵母。
16.进一步的，步骤三中小球藻液、真菌菌液、畜禽尾水在光生物反应器中的温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
17.进一步的，步骤三中所述曝气的气体是含量为2～2.5％的co2和空气的混合气；所述人工模拟畜禽尾水主要成分为ph：6.8～8.1、cod：400mg/l、no
3-‑
n：8mg/l、nh
4 -n：80mg/l、tp：8mg/l；步骤一得到的小球藻细胞初始浓度控制在0.5g/l和步骤二得到的真菌初始接种浓度控制在0.1g/l；所述畜禽尾水为低c/n废水。
18.进一步的，步骤四中光生物反应器的出水采集步骤为：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，离心后获得沉淀，并将沉淀冷冻干燥；所述特定天数为第0、2、5天，样品需要离心后，取沉淀冷冻干燥。
19.进一步的，步骤五中检测的指标为细胞中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度。
20.进一步的，步骤六中流动相为8mn的硫酸，流速为0.4ml/min，柱温设定为70℃；葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的出峰时间分别为13.14、14.09和15.41min。
21.本发明的有益效果是：1、本发明所使用的原材料广泛分布于自然界，易于培养；2、本发明操作简单易行，制备成本较为低廉；3、与单独微藻或单独真菌生物治理技术相比，本发明的微藻-真菌共生体可以短时间内明显提高微藻产糖效果，因此，本发明有很大优势，具有大规模推广应用的潜力；4、本发明在提高微藻产糖的同时，还对畜禽养殖废水进行了净化处理；5、通过图5至图7可以看出，藻菌共生体对nh
4
降解速率高于纯藻高于纯菌；藻菌共生体胞外分泌的蛋白质高于纯藻；藻菌共生体内sod酶高于纯藻。
附图说明
22.图1a是实施例一中微藻-真菌共生体系和对照例1单独微藻与单独真菌，氨氮指标降解变化示意图；
23.图1b是实施例一中微藻-真菌共生体系和对照例1单独微藻与单独真菌，总磷指标降解变化示意图；
24.图2是实施例二中微藻-真菌共生体系和对照例2单独微藻与单独真菌，第0天的时候，胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度变化示意图；
25.图3是实施例三中微藻-真菌共生体系和对照例3单独微藻与单独真菌，第2天的时
候，胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度变化示意图；
26.图4是实施例四中微藻-真菌共生体系和对照例4单独微藻与单独真菌，第5天的时候，胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度变化示意图；
27.图5是藻菌共生体对nh
4
降解速率示意图；
28.图6是藻菌共生体胞外分泌的蛋白质示意图；
29.图7是藻菌共生体内sod酶示意图。
具体实施方式
30.具体实施方式一：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法是通过如下步骤实现的：
31.步骤一、将小球藻加入已灭菌的bg-11培养基，然后放入光生物反应器中进行培养，培养至对数期，得到小球藻液；
32.步骤二、将真菌加入已灭菌的ym培养基中，放入恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；
33.步骤三、将步骤一中获得的小球藻液和步骤二中获得的真菌菌液与畜禽尾水混合，并放入光生物反应器中；
34.步骤四、分别在第0天、第2天、第5天对步骤三中的光生物反应器进行出水采集；
35.步骤五、取步骤四中采集获得样品10mg，并记录重量，装于250ml的厌氧瓶内，在厌氧瓶中加入5ml的3％的稀硫酸于灭菌锅121℃中加热21min；反应结束后，取2ml溶液至10ml离心管中，多次投加碳酸钙粉末直到水解液不再冒出气泡，即ph为中性；9000rpm离心5分钟，上清液过滤后采用液相色谱仪检测，根据结果分析细胞中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度；
36.步骤六、步骤五中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度采用高效液相色谱仪-示差检测器分析，配备87h3色谱柱。
37.具体实施方式二：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤一中在光生物反应器中的培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体，co2通气量为2～2.5％；所述微藻为蛋白核小球藻。
38.具体实施方式三：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤二中真菌在恒温培养摇床中的培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟；所述真菌为汉逊徳巴利酵母。
39.具体实施方式四：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤三中小球藻液、真菌菌液、畜禽尾水在光生物反应器中的温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
40.具体实施方式五：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤三中所述曝气的气体是含量为2～2.5％的co2和空气的混合气；所述人工模拟畜禽尾水主要成分为ph：6.8～8.1、cod：400mg/l、no
3-‑
n：8mg/l、nh
4 -n：80mg/l、tp：8mg/l；步骤一得到的小球藻细胞初始浓度控制在0.5g/l和步骤二得到
的真菌初始接种浓度控制在0.1g/l；所述畜禽尾水为低c/n废水。
41.具体实施方式六：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤四中光生物反应器的出水采集步骤为：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，离心后获得沉淀，并将沉淀冷冻干燥；所述特定天数为第0、2、5天，样品需要离心后，取沉淀冷冻干燥。
42.具体实施方式七：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤五中检测的指标为细胞中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的浓度。
43.具体实施方式八：结合图1至图4说明本实施方式，本实施方式所述一种利用微藻-真菌共生体提高微藻产糖的方法的步骤六中流动相为8mn的硫酸，流速为0.4ml/min，柱温设定为70℃；葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的出峰时间分别为13.14、14.09和15.41min。
44.实施例
45.实施例一：
46.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
47.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
48.步骤3：将步骤1获得的小球藻和步骤2获得的真菌，分别按照0.5g/l和0.1g/l的浓度比例，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
49.步骤4：将步骤3的反应器出水，于特定天数(第0、1、2、3、4、5天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为10ml，最后进行水质氨氮和总磷的检测。
50.对比例1
51.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
52.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
53.步骤3：将步骤1获得的小球藻，按照0.5g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
54.步骤4：将步骤2获得的真菌，按照0.1g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/
m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
55.步骤5：将步骤3和4的反应器出水，于特定天数(第0、1、2、3、4、5天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为10ml，最后进行水质氨氮和总磷的检测。
56.具体实验结果如图1所示：相较于纯真菌组和纯微藻组，微藻-真菌共生体可以明显加速去除污水中氨氮和总磷。
57.实施例二：
58.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
59.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
60.步骤3：将步骤1获得的小球藻和步骤2获得的真菌，分别按照0.5g/l和0.1g/l的浓度比例，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
61.步骤4：将步骤3的反应器出水，于特定天数(第0天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度的检测。
62.对比例2
63.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
64.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
65.步骤3：将步骤1获得的小球藻，按照0.5g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
66.步骤4：将步骤2获得的真菌，按照0.1g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
67.步骤5：将步骤3和4的反应器出水，于特定天数(第0天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖浓度的检测。
68.具体实验结果如图2所示：相较于纯真菌组和纯微藻组，微藻-真菌共生体可以提高胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度。
69.实施例三：
70.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
71.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
72.步骤3：将步骤1获得的小球藻和步骤2获得的真菌，分别按照0.5g/l和0.1g/l的浓度比例，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
73.步骤4：将步骤3的反应器出水，于特定天数(第2天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度的检测。
74.对比例3
75.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
76.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
77.步骤3：将步骤1获得的小球藻，按照0.5g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
78.步骤4：将步骤2获得的真菌，按照0.1g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
79.步骤5：将步骤3和4的反应器出水，于特定天数(第2天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖浓度的检测。
80.具体实验结果如图3所示：相较于纯真菌组和纯微藻组，微藻-真菌共生体可以明显提高胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度。
81.实施例四：
82.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
83.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至
对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
84.步骤3：将步骤1获得的小球藻和步骤2获得的真菌，分别按照0.5g/l和0.1g/l的浓度比例，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
85.步骤4：将步骤3的反应器出水，于特定天数(第5天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度的检测。
86.对比例4
87.步骤1：将小球藻chlorellapyrenoidosa加入已灭菌的bg-11培养基，然后于光生物反应器中进行预培养，培养至对数期，得到小球藻液；其中在光生物反应器中进行预培养的参数为：培养温度为27～30℃，培养转速为200rpm～300rpm，培养光照150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，通入一定浓度的co2气体。
88.步骤2：将真菌加入已灭菌的ym培养基中，于恒温培养摇床中进行预培养，培养至对数期，得到真菌菌液；其中在恒温培养摇床中进行预培养的参数为：培养温度为26-28℃，振荡器调速为150-170次/分钟。
89.步骤3：将步骤1获得的小球藻，按照0.5g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
90.步骤4：将步骤2获得的真菌，按照0.1g/l的浓度，接种于畜禽尾水中。培养于500ml的光生物反应器中，培养条件为：温度27～30℃，转速为200～300rpm，光照强度为150μmol/m2/s～250μmol/m2/s，co2通气量为2～2.5％。
91.步骤5：将步骤3和4的反应器出水，于特定天数(第5天)采集。采集过程如下：首先将反应器内的液体旋转均匀，水样采取体积为50ml，冷冻干燥后，直接萃糖，最后进行胞内葡萄糖浓度的检测。
92.具体实验结果如图4所示：相较于纯真菌组和纯微藻组，微藻-真菌共生体可以明显提高胞内葡萄糖、木糖、阿拉伯糖浓度。
93.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。