一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片的制作方法

1.本发明涉及医疗检测技术领域，尤其涉及一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片。


背景技术：

2.实时荧光pcr（real-time pcr）是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测试每次聚合酶链式反应（polymerase chain reaction简称pcr）循环后产物总量的方法。目前实时荧光pcr检测使用的微流控芯片，由于微流控芯片的尺寸有限，在有限尺寸内能够设置的规定容积的腔室较少故检测量较小；同时，现有的实时荧光pcr检测使用的微流控芯片在加样过程中易产生气泡，进而影响后续光学测量结果的准确性。
3.此外，现有的微流控芯片仅能单面进行加热，进而使得微流控芯片与热源之间热传导效率较低导致整个扩增过程时间较长且微流控芯片内的反应液存在温度梯度均一性较差的问题，同样影响了检测结果的准确性。


技术实现要素：

4.（一）要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种多靶标核酸检测的微流控芯片，在加样过程中产生气泡少进而提高了后续光学测量结果的准确性，且在有限尺寸内能够设置多个规定容积的腔室进而实现多靶标的pcr检测。
5.（二）技术方案为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：本发明提供的一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片，包括检测片；检测片上开设有一一对应连通的多个腔室和多个排气孔；检测片上还设有注样孔，腔室与注样孔连通；检测片的第一侧设有第一密封膜以密封腔室的第一侧、排气孔的第一侧以及注样孔的第一侧；检测片的第二侧设有第二密封膜以密封腔室的第二侧；检测片的第二侧还设有防水透气膜以密封排气孔的第二侧；腔室的水平截面为月牙形结构。
6.优选地，腔室包括输入部、容纳部以及输出部，输入部、容纳部和输出部依次连通形成月牙形结构；输入部沿远离容纳部的方向，输入部的宽度越窄；输出部沿远离容纳部的方向，输出部的宽度越窄。
7.优选地，检测片的第一侧向检测片的第二侧延伸凹设有总流道和进液流道，注样孔与总流道连通，每个腔室分别通过进液流道与总流道连通；腔室与排气孔之间通过排气流道连通。
8.优选地，检测片为矩形结构，总流道位于在检测片的中线上，且沿检测片的中线方向延伸；设置两排腔室，每排腔室对应设置一排排气孔；两排腔室分别设置在总流道的两侧，每排腔室包括沿检测片长度方向延伸的多个腔室；总流道延伸的长度小于每排腔室延伸的长度。
9.优选地，检测片包括连接的检测片本体及把持部，把持部设置在沿检测片本体的长度方向延伸的一端；检测片上设有镂空部，镂空部从把持部向检测片本体的一侧延伸。
10.优选地，还包括二维码标签，二维码标签设置在把持部上。
11.优选地，检测片为圆形结构，注样孔设置在检测片的中心，总流道为第一环形结构，注样孔通过连接流道与总流道连通；多个腔室以检测片的中心为圆心、等间距周向布置形成第二环形结构；多个排气孔以检测片的中心为圆心、等间距周向布置形成第三环形结构；第一环形结构、第三环形结构和第二环形结构由内向外依次排布。
12.优选地，排气流道与排气孔连通的一端为斜坡结构。
13.优选地，第一密封膜和第二密封膜的厚度为30-50μm。
14.优选地，还包括盖片；检测片的第二侧凸设有卡槽，盖片通过密封胶片扣设在检测片的卡槽上以封闭注样孔。
15.（三）有益效果本发明的有益效果是：本发明提供的一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片，由于腔室的水平截面为月牙形结构即当液体流入腔室时，腔室的进液侧渐扩，腔室的出气侧渐缩，便于液体充满的同时气体完全排出不残留空气形成气泡进而提高了后续光学检测结果的准确性。
16.同时通常情况下，光学检测设备中对每个腔室的宽度即垂直于多个腔室排列方向不能超过规定尺寸，而本发明中腔室设为月牙形结构能够在相同尺寸的检测片上实现腔室数量的最大化，即实现多靶标的pcr检测。
17.且由于本发明提供的微流控芯片中腔室的第一侧和第二侧分别通过第一密封膜和第二密封膜进行密封便于后续扩增装置同时对腔室的两侧表面进行变温处理，相比周侧边加热，两侧表面同时加热的方式传热面积数倍增大，可以大大缩短pcr反应时间，进而缩短了核酸检测时间，且使腔室内部受热均匀、平衡液体内部温差，提高检测结果的准确性。
附图说明
18.图1为本发明实施例一的结构示意图；图2为图1中检测片的正视图；图3为图1中检测片的后视图；图4为图1中腔室的正视图；图5为本发明实施例二的结构示意图；图6为图5中检测片的正视图；图7为图5中检测片的后视图；图8为腔室的结构示意图。
19.【附图标记说明】1：检测片；11：腔室；110：缓坡过渡；111：输入部；112：容纳部；113：输出部；12：排气孔；13：注样孔；14：总流道；15：进液流道；16：排气流道；17：卡槽；171：凸起；18：把持部；181：镂空部；19：连接流道；2：第一密封膜；3：第二密封膜；
4：防水透气膜；5：二维码标签；6：盖片；7：密封胶片。
具体实施方式
20.为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
21.分子诊断通过直接检测基因序列来诊断，特异性好，灵敏度高，广泛应用于传染病诊断、遗传基因筛查、肿瘤靶向用药分型等领域。分子诊断技术包括分子杂交、聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称pcr）、基因芯片及测序等，其中pcr技术占50%以上份额，是新冠肺炎等传染病诊断的标准。
22.现有的核酸检测产品一般只针对单个或者少数几个病原体进行检测，如呼吸道感染，经常只筛查新冠、甲流、乙流等少数靶标，而常见的感染病原体还包括合胞病毒、腺病毒、各型冠状病毒、鼻病毒、肠病毒、各型副流感病毒、肺炎衣原体、支原体、链球菌等，多重核酸检测技术有利于更全面精准的诊断，从而为对症精准治疗提供依据。
23.目前进行多重核酸检测主要有如下方法：多管多重法：一个反应管检测1～4个靶标，12个反应管检测12～48个靶标。由于每个反应管检测靶标不同，需要分别配置不同反应体系，每个反应管需要加入相同的样本，操作比较复杂，检测时间较长，样本消耗量大，依赖于冷链，综合成本高。
24.分子杂交法：通过配置反应体系在pcr仪器上进行多重扩增，取出反应产物进行杂交，杂交完毕后进行洗膜和干燥，然后在荧光成像仪器上进行结果判读。但检测时间长，整个过程最快需要4个半小时以上、操作复杂，对人员专业水平要求高、且易造成气溶胶污染。
25.基于环介导等温扩增技术的芯片扩增法：虽检测速度快且对仪器要求较低，但不可相对定量，只能用于终点定性检测、需要冷链支持且存在假阳性率高的问题。
26.由此，临床应用上亟需一种更精准、更快速、更便捷的多重核酸检测产品。
27.如图1和图5所示，本发明提供的一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片，包括检测片1，检测片1上开设有一一对应连通的多个腔室11和多个排气孔12。
28.检测片1上还设有注样孔13，腔室11与注样孔13连通，检测片1的第一侧设有第一密封膜2以密封腔室11的第一侧、排气孔12的第一侧以及注样孔13的第一侧，检测片1的第二侧设有第二密封膜3以密封腔室11的第二侧，检测片1的第二侧还设有防水透气膜4以密封排气孔12的第二侧，腔室11的水平截面为月牙形结构。优选地，腔室11并非为规则的月牙形，单个腔室11长宽比介于3：1.4-2，长厚比介于3:1-1.5。如图8所示的实施例中，腔室11长度为3mm，宽度为1.7mm，厚度为1.2mm。腔室11设计具有较长的长度，可使每个腔室11具有足够的光学检测面以利于光学检测，而厚度需在满足芯片注塑工艺成型的条件下尽可能地薄，从而适配双面加热的仪器，并提高加热效率。而腔室11的宽度依据腔室11所设计的容积量进行适当调整，但最好满足长宽比介于3：1.4-2的范围，以使圆弧形侧壁具有足够曲率，
有利于减少液体试剂中气泡残留量，发挥凸镜聚光效应和增强光学检测信号。其中，腔室11的容积为6-10μl（例如可设为6μl、8μl或10μl），但本发明不限制具体容积大小，可依照需求进行设计。
29.其中，注样孔13、腔室11以及排气孔12均为通孔，便于制造的同时腔室11为通孔与第一密封膜2和第二密封膜3配合便于后续对腔室11内样本的两侧进行快速升降温。当然，微流控芯片还包括盖片6，检测片1的第二侧凸设有卡槽17，卡槽17位于检测片1第二侧的中部，盖片6通过密封胶片7扣设并密封在检测片1的卡槽17上以封闭注样孔13。其中，在卡槽17上的边缘设有凸起171，以便于盖片6的定位及安装。通过将盖板与检测片1的卡槽17扣接以及密封胶片7的密封实现双重固定装配，防止样本溢出以及升降温反应过程的泄露。
30.在实际应用的过程中，在注入样本之前，已在腔室11内均预先放入检测试剂并进行干燥。从检测片1的注样孔13注入需检测的样本后，样本流入各个腔室11中，腔室11中的空气通过排气孔12排出使腔室11内无气泡以提高pcr的检测结果。其中，第一密封膜2和第二密封膜3通过热封工艺分别在检测片1的第一侧和第二侧无气泡密封贴合，以防止试剂或样本在热反应等过程中溢出。由于在排气孔12的第一侧设置了第一密封膜2，排气孔12的第二侧设置了防水透气膜4，实现了排气孔12可以透气但是不透水的效果。当从检测片1的注样孔13注入完需检测的样本后，再将盖片6扣设并密封在检测片1的卡槽17上以封闭注样孔13。由于盖片6与检测片1配合以封闭注样孔13，使微流控芯片的腔室11注样后的内部形成封闭，在pcr反应的升降温过程中不会造成样本及试剂的泄露，造成环境污染，从而确保在注样时腔室11内无气泡的同时能够使样本充满整个腔室11而且不漏液。
31.根据多次试验可得，当在相同试验环境中，分别向相同容量的圆形腔室、椭圆形腔室、矩形腔室以及月牙形腔室中分别入等量样本，在显微镜观察下，圆形腔室中平均气泡数量为大于2个，椭圆形腔室中平均气泡数量为1.4个，矩形腔室中平均气泡数量为8个，而月牙形腔室中平均气泡数量为0个。
32.本发明提供的一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片，由于腔室11的水平截面为月牙形结构即当液体流入腔室11时，腔室11的进液侧渐扩，腔室11的出气侧渐缩，便于液体充满的同时气体完全排出不残留空气形成气泡进而提高了后续光学检测结果的准确性。同时，通常光学检测设备中对每个腔室11的宽度即垂直于多个腔室11排列方向不能超过规定尺寸，由于本发明中腔室11为月牙形结构能够在相同尺寸的检测片1上实现腔室11数量的最大化，即实现更多靶标的pcr检测。
33.参见图4所示，由于腔室11为月牙形结构，即其外侧为弧形面有利于荧光的折射聚集进而提高了后续光学检测结果的准确性，且在本实施例中，由于腔室11的上下两个侧面同时作为加热面，传热面积大，传热更快且均匀。腔室11均设置在微流控芯片的边缘处，便于设置在微流控芯片外周边的光学检测模块利用腔室11弧形面的聚光效应，增强光学信号，进而便于后续光学检测模块采集荧光信号。
34.应当说明的是，本技术提供的一种用于多靶标核酸检测的微流控芯片中的检测片1为经过干燥处理后的检测片1，可以在室温、密封、干燥条件下长期保存。且检测片1的形状根据实际需求设计，检测片1可以为透明材料，优选为聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等。且由于本技术中的微流控芯片，预先在腔室11内封装检测试剂，可使用移液器将待检测样本注入微流控芯片，样本通过各流道进入腔室11，与预封试剂混合，只需一次
提取待检测样本，大大减少操作人员的移液次数。
35.如图4所示，腔室11包括输入部111、容纳部112以及输出部113，输入部111、容纳部112和输出部113依次连通形成月牙形结构，即输入部111和输出部113分别设置在容纳部112 的两侧，输入部111沿远离容纳部112的方向，输入部111的宽度越窄即腔室11的进液侧渐扩，输出部113沿远离容纳部112的方向，输出部113的宽度越窄即腔室11的出气侧渐缩。液体进入腔室时会排出腔室内的气体，如果空气没有及时排出容易形成气泡残留，使用渐扩渐缩的结构可以避免腔室内形成直角、锐角或者其他阻碍流体流动的部分，便于液体进入腔室和腔室内的空气排出。
36.如图2和图6及图8所示，检测片1的第一侧向检测片1的第二侧延伸凹设有总流道14和进液流道15，即总流道14、进液流道15以及排气流道16仅在检测片1的一侧镂空，便于检测片1上后续排气孔12上防水透气膜4的安装。其中，注样孔13与总流道14连通，每个腔室11分别通过进液流道15与总流道14连通，腔室11与排气孔12之间通过排气流道16连通。在本技术中，排气流道16靠近排气孔12的一端为斜坡结构，进而液体在一定坡度的引导下，流入排气孔12，会形成旋涡将液体的气泡排出。应当说明的是，总流道14、进液流道15以及排气流道16的内壁均为光滑过渡通道，以便于注样时样本的流动。腔室11为两侧通孔以便于在小体积范围内盛放较多试剂和两侧面进行快速即热，但与腔室11连通的进液流道15和排气流道16均在检测片1上为不穿透，且与腔室11连接处设有缓坡过渡110。这种结构，既又利于试剂快速进入到腔室11中，减少湍流和腔室11内的气泡残留量，又能节省试剂用量。
37.其中，防水透气膜4为多层复合材质，优选为不吸水的材质，防止了防水透气膜4在扩增反应中从排气孔12吸走液体造成腔室11中产生气泡，进而影响检测精确度。
38.具体地，第一密封膜2和第二密封膜3的厚度为30-50μm，优选为40μm，在保证密封效果的同时腔室11为通孔与第一密封膜2和第二密封膜3配合进行双侧加热便于腔室11内样本的快速加热及冷却，并避免了单侧加热造成的腔室11的液体内部形成温度梯度，从而提升反应速度和反应效能。
39.实施例一如图1-3所示，在本实施例中，检测片1为矩形结构，总流道14位于在检测片1的中线上，且沿检测片1的中线方向延伸，设置两排腔室11，每排腔室11对应设置一排排气孔12，两排腔室11分别设置在总流道14的两侧，每排腔室11包括沿检测片1长度方向延伸的多个腔室11，多个腔室11等间距、间隔设置。其中，腔室11呈一定规则阵列的结构，便于后续的光学检测。总流道14延伸的长度小于每排腔室11延伸的长度，以使检测片1的结构更紧凑。
40.为了便于防水透气膜4的封装，每排排气孔12均呈一字型排布，且设置在检测片1的中部，且两排排气孔12分别设置在总流道14的两侧，每排排气孔12延伸的长度小于总流道14的长度，以进一步使检测片1的结构更紧凑有利于其密封同时减少防水透气膜4的使用面积节约生产成本。为了便于加工，且使检测片1的结构进一步更紧凑，排气流道16及进液流道15可为直线型也可为弯折型。
41.如图3所示，检测片1包括连接的检测片本体及把持部18，把持部18设置在沿检测片本体的长度方向延伸的一端，通过设置把持部18便于微流控芯片的安装。为了使检测片1更轻质易于握持且便于检测片1的注塑成型检测片1上设有镂空部181，镂空部181从把持部18向检测本体的一侧延伸。
42.在实际应用的过程中，检测片上还粘贴有与检测试剂对应的二维码标签5，二维码标签5设置在把持部18上以便于后续注入试剂或待检测样本时，扫码快速选择合适的检测程序。其中，二维码标签5主要信息包括：检测试剂种类及对应的注样孔13、检测片1制备时间、主要操作人员等，二维码标签5可人为输入信息进行设定和生成。
43.在本实施例中，总流道14、排气流道16以及进液流道15的深度为0.15mm、宽度为0.2mm的光滑过渡通道，利于注样时液体的流动，且注样孔13直径为1.2mm的圆孔且与移液枪口尺寸对应，确保注样时不溢液不漏气，排气孔12直径为0.8mm的圆孔。在本实施例中，微流控芯片共包括26个腔室11，双排对称腔室11结构，1个注样孔13对应26个腔室11，不同腔室11内可预先封装多种不同试剂，配合多色实时荧光pcr设备可同时检测52种或更多种靶标。
44.在本实施例中仅举出优选实施例，当然可根据实际情况设计总流道14、排气流道16、进液流道15、注样孔13、排气孔12的尺寸以及腔室11的数量。
45.实施例二如图5-如图7所示，在本实施例中，检测片1为圆形结构，注样孔13设置在检测片1的中心，总流道14为第一环形结构，注样孔13通过连接流道19与总流道14连通，多个腔室11以检测片1的中心为圆心、等间距周向布置形成第二环形结构，多个排气孔12以检测片1的中心为圆心、等间距周向布置形成第三环形结构，第一环形结构、第三环形结构和第二环形结构由内向外依次排布即第一环形结构、第三环形结构和第二环形结构的直径依次增大。
46.在本实施例中，进液流道15为直线型，进液流道15的一端与腔室11连通，进液流道15的另一端与总流道14连通，排气流道16为弯折型，排气流道16的一端与腔室11连通，排气流道16的另一端与排气孔12连通。
47.其中，本实施例的微流控芯片共包括18个腔室11，腔室11呈圆形阵列分布，1个注样孔13对应18个腔室11，各腔室11可预先封装多种不同试剂，配合多色实时荧光pcr设备可同时检测36或更多种靶标。
48.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
49.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连；可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
50.在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述，是指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进
行结合和组合。
51.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行改动、修改、替换和变型。