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一种快速鉴定海分枝杆菌的qPCR方法

2022-11-16 08:52:40 来源:中国专利 TAG:

一种快速鉴定海分枝杆菌的qpcr方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种快速鉴定海分枝杆菌的qpcr方法。


背景技术:

2.海分枝杆菌mycobacterium marinum是淡水和海水鱼类的主要致病菌,此菌也可导致人类的感染,临床以皮肤感染为主,也可累及肺部、骨关节及血液系统等。该病目前已在全世界范围流行,美国发病率为0.27/10万,法国发病率为0.04/10万,克罗尼西亚地区萨托万岛发病率高达6%,严重威胁人类生命健康。
3.海分枝杆菌感染患者的传统诊断主要依靠病原菌的培养,但由于培养的阳性率较低并且耗时较长(30~32℃培养10-28天),限制了临床的早期治疗需求,因此亟需开发一种快速、灵敏、准确的鉴定或辅助鉴定海分枝杆菌的方法。


技术实现要素:

4.本发明的第一个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定海分枝杆菌的引物组。
5.本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定海分枝杆菌的引物组由引物1、引物2和探针组成;
6.所述引物1为如下a1)或a2):
7.a1)序列表中序列1所示的单链dna分子;
8.a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子;
9.所述引物2为如下a3)或a4):
10.a3)序列表中序列2所示的单链dna分子;
11.a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子;
12.所述探针为如下a5)或a6):
13.a5)序列表中序列3所示的单链dna分子;
14.a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子。
15.上述引物组中,所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为5:5:4。
16.本发明的第二个目的是提供上述引物组的新用途。
17.本发明提供了上述引物组在如下b1)-b8)中任一种中的应用:
18.b1)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为海分枝杆菌的产品;
19.b2)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为海分枝杆菌;
20.b3)制备诊断或辅助诊断待测者是否感染海分枝杆菌的产品;
21.b4)诊断或辅助诊断待测者是否感染海分枝杆菌;
22.b5)制备检测或辅助检测待测样品是否含有海分枝杆菌的产品;
23.b6)检测或辅助检测待测样品是否含有海分枝杆菌;
24.b7)制备鉴别或辅助鉴别海分枝杆菌与其它分枝杆菌的产品;
25.b8)鉴别或辅助鉴别海分枝杆菌与其它分枝杆菌。
26.本发明的第三个目的是提供含有上述引物组的试剂盒;
27.所述试剂盒的功能为如下c1)-c4)中任一种:
28.c1)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为海分枝杆菌;
29.c2)诊断或辅助诊断待测者是否感染海分枝杆菌;
30.c3)检测或辅助检测待测样品是否感染海分枝杆菌;
31.c4)鉴别或辅助鉴别海分枝杆菌与其它分枝杆菌。
32.进一步的,所述试剂盒还可包括用于鉴定海分枝杆菌的其他试剂。在本发明中,所述用于鉴定海分枝杆菌的其他试剂可为taqman gene expression master mix。
33.更进一步的,所述试剂盒还包括阴性对照(如ddh2o)和阳性对照(如海分枝杆菌标准菌株(927
tm
)的基因组dna)。
34.本发明的第四个目的是提供上述试剂盒的制备方法,所述方法为如下d1)或d2):
35.d1)将上述引物组中的各条引物分别单独包装;
36.d2)将上述引物组中的各条引物按比例混合在一起。
37.进一步的,所述d2)中,所述引物组中的所述引物1、所述引物2和所述探针按照摩尔比为5:5:4的比例混合在一起。
38.本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为海分枝杆菌的方法。
39.本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测菌是否为海分枝杆菌的方法包括如下步骤:提取待测菌的核酸,以待测菌核酸为模板,采用上述引物组进行实时荧光定量pcr;反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测菌是否为海分枝杆菌:若待测菌有s型扩增曲线且ct值<35,则待测菌为或候选为海鱼分枝杆菌,否则待测菌不为或候选不为海鱼分枝杆菌。
40.本发明的第六个目的是提供一种诊断或辅助诊断待测者是否感染海分枝杆菌的方法。
41.本发明提供的诊断或辅助诊断待测者是否感染海分枝杆菌的方法包括如下步骤:提取待测者的核酸,以待测者核酸为模板,采用上述引物组进行实时荧光定量pcr;反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测者是否感染海分枝杆菌:若待测者有s型扩增曲线且ct值<35,则待测者感染或候选感染海鱼分枝杆菌,否则待测者未感染或候选未感染海鱼分枝杆菌。
42.本发明的第七个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否含有海分枝杆菌的方法。
43.本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否含有海分枝杆菌的方法包括如下步骤:提取待测样品的核酸,以待测样品核酸为模板,采用上述引物组进行实时荧光定量pcr;反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测样品是否含有海分枝杆菌:若待测样品有s型扩增曲线且ct值<35,则待测样品含有海鱼分枝杆菌,否则待测样品不含有或候选不含有海鱼分枝杆菌。
44.本发明的最后一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别海分枝杆菌与其它分枝杆菌
的方法。
45.本发明提供的鉴别或辅助鉴别海分枝杆菌与其它分枝杆菌的方法包括如下步骤:提取待测菌的核酸,以待测菌核酸为模板,采用上述引物组进行实时荧光定量pcr;反应结束后通过扩增曲线和ct值判断待测菌为海分枝杆菌还是其它分枝杆菌:若待测菌有s型扩增曲线且ct值<35,则待测菌为或候选为海鱼分枝杆菌,否则为或候选为其它分枝杆菌。
46.上述任一所述方法还包括如下步骤:在阴性对照无扩增曲线或ct值>35且阳性对照有s型扩增曲线且ct值<35的前提下进行结果判定。
47.上述任一所述方法中,所述引物1和所述引物2在实时荧光定量pcr体系中的终浓度均具体可为7.5μm,所述探针在实时荧光定量pcr体系中的终浓度具体可为6μm。
48.所述实时荧光定量pcr体系具体可由15μl taqman gene expression master mix、0.75μl引物1、0.75μl引物2、0.6μl探针、2μl模板和10.9μl ddh2o组成。
49.所述实时荧光定量pcr反应程序具体可为50℃2min,95℃10min,40个循环(95℃15s、60℃1min)。
50.上述任一所述方法中,所述核酸为基因组dna。
51.上述任一所述应用或试剂盒或方法中,所述其它分枝杆菌可为如下分枝杆菌中的至少一种:龟分枝杆菌mycobacterium chelonei、结核分枝杆菌mycobacterium tuberculosis、偶发分枝杆菌mycobacterium fortuitum、嗜血分枝杆菌mycobacterium haemophilum。
52.本发明所要解决的技术问题是建立一种采用实时荧光定量pcr技术检测海分枝杆菌的方法。为解决上述技术问题,本发明进行了如下实验过程:以海分枝杆菌特异性基因mel2为目的基因,设计其特异性引物和探针。然后采用海分枝杆菌标准菌株(927
tm
)为阳性对照,选取经明确诊断的100例海分枝杆菌、1例龟分枝杆菌、1例结核分枝杆菌、2例偶发分枝杆菌、2例嗜血分枝杆菌感染患者的皮肤组织样本的培养菌落为实验组,同时设置空白对照组,通过荧光定量pcr技术对上述样本进行检测。结果显示:实验组中的100例海分枝杆菌感染患者培养菌落均为阳性,准确度达100%;其余菌落以及空白对照均为阴性,特异度达100%。本发明成功建立了采用实时荧光定量pcr技术检测海分枝杆菌的方法,为海分枝杆菌感染患者的尽早诊断与治疗提供了有效的技术手段。
具体实施方式
53.以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
54.下述实施例中的试验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
55.下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
56.以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
57.下述实施例中的海分枝杆菌标准菌株(mma20)是atcc的产品,编号为927
tm

58.实施例1、用于快速鉴定海分枝杆菌的引物组及其鉴定方法
59.一、用于快速鉴定海分枝杆菌的引物组
60.本发明以海分枝杆菌特异性基因mel2为目的基因,通过primer express software for real-time pcr version 3.0软件设计其特异性引物和探针,具体序列如表1所示。序列1所示的单链dna分子、序列2所示的单链dna分子和序列3所示的单链dna分子组成本发明的用于快速鉴定海分枝杆菌的引物组。
61.表1、特异性引物和探针
[0062][0063]
二、快速鉴定海分枝杆菌的qpcr方法
[0064]
1、实验器材
[0065]
(1)仪器:生物安全柜、二氧化碳培养箱、4度冰箱、-20度冰箱、-80度冰箱、微量移液器、干式恒温金属浴、离心机、纯水仪、美国abi steponeplus荧光定量pcr等。
[0066]
(2)试剂:dna提取液、引物和探针(invitrogen)、taqman gene expression master mix(thermo fisher,applied biosystems,00826956)。
[0067]
(3)耗材:枪头、1.5ml ep管、八连管等。
[0068]
2、实验方法
[0069]
(1)生物安全柜紫外灯照射30分钟后,从二氧化碳培养箱中取出培养的待测菌菌落,置于生物安全柜中。分别用接种环刮取菌落少许,置于1.5ml ep管中。
[0070]
(2)向含有菌落的1.5ml ep管中加入80μl dna提取液,涡旋振荡10s,然后10000r/min离心10s,使菌落和dna提取液处于ep管底。
[0071]
(3)置于干式恒温金属浴中,100℃,10min,提取菌落dna。
[0072]
(4)将ep管从干式恒温金属浴中取出,10000r/min离心30s,上清液中即含有菌落的核酸。然后置于-80度冰箱中储存,备用。
[0073]
(5)按照表2的配方配制pcr体系(30μl),引物f、引物r和probe在pcr体系中的终浓度分别为7.5μm、7.5μm、6μm。同时设置阴性对照和阳性对照,阴性对照:ddh2o;阳性对照:海分枝杆菌标准菌株(927
tm
)基因组dna溶液。
[0074]
表2、pcr体系
[0075]
组分1
×
(μl)taqman gene expression master mix15f0.75r0.75probe0.6ddh2o10.9dna模板2
[0076]
(6)采用美国abi steponeplus荧光定量pcr仪进行检测,反应程序为50℃2min,95℃10min,40个循环(95℃15s、60℃1min)。
[0077]
3、结果判定
[0078]
阴阳性对照合格(阴性对照无扩增曲线或ct值>35,阳性对照有s型扩增曲线且ct值<35)的前提下,若待测菌有s型扩增曲线且ct值<35,则待测菌为海鱼分枝杆菌,否则待测菌不为海鱼分枝杆菌。
[0079]
实施例2、灵敏度测试
[0080]
一、实验材料
[0081]
将海分枝杆菌标准菌株(927
tm
)的基因组dna溶液进行连续倍比稀释,分别得到浓度依次为83.71
×
10-1
ng/l、83.71
×
10-2
ng/l、83.71
×
10-3
ng/l、83.71
×
10-4
ng/l、83.71
×
10-5
ng/l、83.71
×
10-6
ng/l、83.71
×
10-7
ng/l、83.71
×
10-8
ng/l、83.71
×
10-9
ng/l的海分枝杆菌dna溶液。
[0082]
二、实验方法与结果
[0083]
分别以不同浓度的海分枝杆菌dna溶液为模板,采用实施例1步骤二中的方法进行荧光定量pcr和结果判定。
[0084]
结果表明:本发明检测方法的灵敏度可达83.71
×
10-8
ng/l。
[0085]
实施例3、特异性测试
[0086]
一、实验材料
[0087]
实验材料:感染分枝杆菌患者的皮肤组织样本的培养菌落。分枝杆菌患者具体如下:100例海分枝杆菌mycobacterium marinum感染患者、2例嗜血分枝杆菌mycobacterium haemophilum感染患者、1例龟分枝杆菌mycobacterium chelonei感染患者、1例结核分枝杆菌mycobacterium tuberculosis感染患者和2例偶发分枝杆菌mycobacterium fortuitum感染患者,所有患者均经临床确诊且知情同意。
[0088]
二、实验方法与结果
[0089]
分别从步骤一中的实验材料提取基因组dna,并以提取的dna溶液作为模板,采用实施例1步骤二中的方法进行荧光定量pcr和结果判定。同时以ddh2o为空白对照。
[0090]
结果表明:100例海分枝杆菌菌落的检测结果均为阳性,准确度达100%,其余菌落以及空白对照均为阴性,特异度达100%。
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
再多了解一些

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