一种乌蔹莓及其伪品的快速鉴别方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药鉴定领域，特别涉及一种能快速鉴定乌蔹莓及其伪品的引物和pcr方法。


背景技术：

2.中药材乌蔹莓为葡萄科乌蔹莓属植物乌蔹莓(cayratia japonica)的全草。现代研究表明，乌蔹莓可有效防治咽喉肿痛、腮腺炎、毒蛇咬伤、痈肿、疔疮、风湿痛、黄疸、痢疾、咯血、尿血等病症。由于乌蔹莓在形态上与绞股蓝、葎草等植物较为相似导致目前市售乌蔹莓质量存在安全性问题。其伪品主要包括绞股蓝(gynostemma pentaphyllum)、葎草(humulus scandens)和雪胆属植物，如马铜铃(hemsleya graciliflora)和曲莲(hemsleya amabilis)等。因此建立乌蔹莓快速、准确的鉴定方法，对保证临床用药安全是十分重要的。


技术实现要素：

3.本发明人基于叶绿体基因组psba-trnh序列，设计了1对乌蔹莓的位点特异性引物，通过pcr扩增和凝胶电泳等操作，即可达到快速准确鉴定检测材料中是否含有乌蔹莓。
4.1.一种鉴定乌蔹莓和伪品的特异性引物，其特征在于所述引物为wlm-3f、wlm-3r，其序列为：
5.表1 1对乌蔹莓的特异性引物
[0006][0007]
2.一种基于特异性引物鉴定乌蔹莓的pcr方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：
[0008]
(1)待测样品dna的提取
[0009]
(2)用权力要求1所述的引物进行pcr反应，获得扩增产物。dna扩增体系包括：25μl反应体系(超光速mix酶12.5μl，wlm-3f、wlm-3r引物各1μl(10pmol)，dna模板1μl(约50ng)，ddh2o 9.5μl)；反应体系：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min。
[0010]
(3)获得的pcr扩增产物使用核酸染料进行染色，分别取10μl扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。如果(2)的产物在凝胶电泳谱图中观察到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中含有乌蔹莓；如果在凝胶电泳谱图中观察不到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中不含有乌蔹莓。
[0011]
3.一种乌蔹莓的pcr鉴别方法，其特征在于，待测样品为乌蔹莓植物。
附图说明
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图1：wlm-3f wlm-3r特异引物鉴别，该引物能够特异性扩增获得乌蔹莓叶绿体基因组psba-trnh上491bp的鉴别条带，而对其他伪品则没有扩增产物。m：marker；xy：乌蔹莓中国药科大学校园；hen：乌蔹莓河南；qls：乌蔹莓青龙山；ah：乌蔹莓安徽；sx：乌蔹莓陕西；ls：绞股蓝老山(jgl-ls)；lc：葎草；mtl：马铜铃；ql：曲莲；ck：阴性对照。
[0013]
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
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(1)对乌蔹莓及其伪品进行收集，各取100mg样品使用冷冻研磨仪进行研磨粉碎，使用核分离液清洗至上清液无色，离心后使用移液枪小心弃去上清液，再使用ctab法提取样品总dna。
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表2核分离液配置表
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表3 ctab溶液配置表
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表4乌蔹莓及其伪品收集表
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(2)将dna稀释至30-50ng/μl，乌蔹莓特异性引物由金斯瑞生物科技有限公司(中国，南京)合成，并稀释为10μmol/l。pcr反应在200μl pcr反应管中进行，包括：
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pcr反应体系为：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min，获得的pcr产物使用核酸染料进行染色，分别取10μl扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果，通过凝胶成像结果即可确定待测样品中是否含有乌蔹莓。


技术特征：
1.一种鉴定乌蔹莓及其伪品的特异性引物，其特征在于所述引物为wlm-3f、wlm-3r，其序列为：wlm-3f：5
’‑
gactcaatggaagctgttctaa-3’wlm-3r：5
’‑
gaatgataaccataacgaaaacg-3’。2.一种基于特异性引物鉴定乌蔹莓的pcr方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：(1)待测样品dna的提取(2)用权利要求1所述的引物进行pcr反应，获得扩增产物。dna扩增体系包括：25μl反应体系(超光速mix酶12.5μl，wlm-3f、wlm-3r引物各1μl(10pmol)，dna模板1μl(约50ng)，ddh2o 9.5μl)；反应体系：95℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后72℃延伸8min。(3)获得pcr扩增产物后，使用核酸染料染色并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行观察。如果(2)的产物在凝胶电泳谱图中观察到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中含有乌蔹莓；如果在凝胶电泳谱图中观察不到分子量为491bp的单一dna条带，则可以确定待测样品中不含有乌蔹莓。3.一种乌蔹莓的pcr鉴别方法，其特征在于，待测样品为乌蔹莓植物。

技术总结
本发明公开了一种用于鉴定乌蔹莓与4种伪品的特异性引物对。本发明提供了1对鉴别引物，为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。采用特异性引物对待测样品进行扩增时，如果能实现有效扩增，则待测样品中含有乌蔹莓。如果不能实现有效扩增，则可以证明待测样品中不含有乌蔹莓。本发明能快速地鉴定出乌蔹莓，且其灵敏度高，稳定性好。使用此方法鉴别乌蔹莓，只需要通过DNA提取、PCR扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别，这为乌蔹莓的快速准确鉴定提供了依据。准确鉴定提供了依据。


技术研发人员：陆续 李萍 徐文波
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2021.11.19
技术公布日：2022/9/1