体外受精中的hla i类分子和进一步的医学意义
1.发明背景
2.本发明涉及一种核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合，用于在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法中，(i)其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含seq id no:1-17任一氨基酸序列或由seq id no:1-17任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-23任一核苷酸序列或由seq id no:18-23任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列至少85％相同、优选至少90％相同、最优选至少95％相同的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸，和(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换，和(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽；以及其中提高胚胎植入效率的方法包括：(i)在将受精的卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。
3.在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开虽然不认为与本发明的可专利性相关，但通过引用将其全部并入本文。更具体地，所有引用的文件都以引用的方式并入本文，类似于每个单独的文件被具体和单独指出以引用的方式并入本文。
背景技术：
4.人类白细胞抗原(hla)系统或复合体是编码人类主要组织相容性复合体(mhc)蛋白的基因复合体。hla基因复合体位于染色体6p21内的3mbp节段上。人类白细胞抗原(hla)基因在生物医学科学和治疗中作为重要靶点有着悠久的研究历史。超过100种疾病与组织相容性复合体基因的不同等位基因有关。与此同时，距首次描述hla与人类疾病之间的关联已有50年了。hla分子已被证明对于生理学、保护性免疫和有害的致病的自身免疫反应性至关重要(debdrou et al.(2018),nature reviews immunology volume18,pages 325
–
339)。
5.例如，在gough and simmonds,curr genomics.2007nov；8(7):453
–
465中回顾了hla基因在自身免疫性疾病中的作用。比如，hla-b27等位基因会增加发生称为强直性脊柱炎的炎症性关节疾病的风险。
6.许多其它涉及异常免疫功能的疾病和某些形式的癌症也与特定hla等位基因有
关。例如，ep2561890描述了一种用于癌症免疫治疗的方式。该专利首先描述了在原发性肿瘤组织以及转移和复发性肿瘤中非经典hla ib类组的研究概况。第二步包括量身定制的抗体疗法。
7.hla ib类基因hla-e、hla-f和hlag是在经典hla ia类基因之后很久才被发现的。对其功能的阐明有一个内敛的开始。然而，其正在病理生理学和一系列疾病中展现出基本功能和参与。尽管一系列研究的结果支持hla ib类分子在成年生活中的功能作用，特别是已经对hla-g和hla-f进行了生殖和妊娠相关研究。胎盘中胎儿-母体交界处hla ib类蛋白的表达似乎对母体接受半同种异体胎儿很重要(persson et al.(2017),immunogenetics,doi 10.1007/s00251-017-0988-4)。在妊娠期间，胎盘，更具体地说是滋养层，在胚胎/胎儿和母体免疫系统之间产生一个“交界处”。滋养层不表达胚胎/胎儿的“原始”hla识别(hla-a至-dq)，而是显示非经典hla ib组e、f和g。在与nk细胞的特异性受体(例如杀伤细胞-免疫球蛋白样受体(kir))和淋巴细胞的特异性受体(淋巴细胞-免疫球蛋白样受体(lil-r))相互作用期间，所述非经典hla组在妊娠外抑制这些免疫活性细胞(w
ü
rfel et al.(2019),int.j.mol.sci.2019,20,1830；doi:10.3390/ijms20081830)。
8.尽管已经收集了关于hla基因与疾病关联的所有知识，但仍然需要将研究重点放在hla基因上，特别是鉴定基于hla系统的生物医学科学和治疗的进一步的靶点。本发明解决了此需求。
技术实现要素：
9.因此，本发明在第一方面涉及一种核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合，用于在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法中的用途，(i)其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含seq id no:1-17任一氨基酸序列或由seq id no:1-17任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-34任一核苷酸序列或由seq id no:18-34任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列具有至少85％相同性、优选至少90％相同性、最优选至少95％相同性的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸，及(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换，以及(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；和(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽；并且其中提高胚胎植入效率的方法包括：(i)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；或(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。
10.本发明还涉及在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法，包括(i)在将受精卵
母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；或(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用，其中所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合如结合本发明的第一方面所定义。
11.体外受精(ivf)程序是一系列复杂的步骤，用于帮助有育性问题的雌性，例如预防遗传问题或帮助受孕。ivf程序包括以下步骤：(i)从供体雌性的卵巢收集成熟的未受精卵母细胞，(ii)用精子使分离的成熟未受精卵母细胞受精以获得受精卵母细胞，(iii)任选地，将受精卵在体外在植入前发育为植入前胚胎，和(iv)将受精卵或植入前胚胎移植到雌性子宫中。一个完整的ivf程序周期通常需要大约三周时间。成熟卵母细胞的特征在于其可以被精子受精。成熟卵通常以相邻的极体为特征。这个程序可以使用要接受ivf治疗的雌性自己的卵母细胞和伴侣的精子来完成。ivf也可以涉及来自已知或匿名捐赠者的卵母细胞、精子或植入前胚胎。在体内，在正常妊娠期间，受精卵在输卵管壶腹中发育成植入前胚胎。然而，这种发育也可以在体外发生。因此，受精卵或植入前胚胎都可以移植到雌性的子宫中。ivf是目前最有效的辅助生殖技术形式。
12.本发明第一方面的方法包括在上文第(i)项中提到的未受精卵的情况下，未受精卵被精子受精和任选地进一步发育成植入前胚胎，之后将受精卵或植入前胚胎移植到子宫。
13.胚胎植入是妊娠中胚胎附着在子宫壁上的阶段。在这个产前发育阶段，孕体被称为囊胚。正是通过这种附着，胚胎从母体获得氧和营养物质，从而能够生长。在人正常妊娠期间，植入前胚胎的植入最可能发生在排卵后9天左右；然而，此范围可以是在6至12天之间。同样在ivf程序中，受精卵母细胞或植入前胚胎在已经将其放入子宫后会附着在子宫壁上。
14.与第一实施方案相关的待治疗的雌性优选地是人。更优选是因先前的体外受精程序由于胚胎植入失败而导致失败的人类女性。在这种情况下以及通常来说，提高胚胎植入的方法也可以是治疗或预防植入失败的方法。
15.seq id no:18-34的核酸序列分别是编码人hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f1、f2、f2和hla-g1、g2、g3、g4、g5、g6和g7的基因。在hla-f1至f3中，优选f1和f5的hla。类似地，在hla-g1至g7中，优选g1和g5的hla。
16.在申请ep19184681.5中报道了编码hla-l的基因包含编码跨膜结构域的序列并且还可以检测到可溶hla-l。因此认为hla-l可以以全长膜结合形式以及可溶形式存在。全长hla-l也可以通过翻译后蛋白水解裂解释放，导致可溶hla片段的释放。
17.hla-g的主要转录物(8个外显子，ncbi gene bank nm_002127.5，2019年9月16日版本)可以剪接为7个可变mrna，其编码膜结合(hla-g1、-g2、-g3、-g4)和可溶(hla-g5、-g6、-g7)蛋白质异构体(carosella et al.,2008,trends immunol.；29(3):125-32)。hla-g1是全长hla-g分子，hla-g2缺少外显子4，hla-g3缺少外显子4和5，hla-g4缺少外显子5。hla-g1至-g4因为存在由外显子6和7编码的跨膜和胞质尾区而是膜结合分子。hla-g5与
hla-g1相似但保留内含子5，hla-g6缺少外显子4但保留内含子4，hla-g7缺少外显子4但保留内含子2。由于存在内含子4，因此hla-g5和-g6是可溶形式，内含子4包含提前终止密码子以阻止跨膜和胞质尾区的翻译。由于内含子3的存在，因此hla-g7是可溶的，内含子3包含提前终止密码子。hla-f也是可变剪接的。三种异构体f1、f2和f3都是膜结合异构体。
18.已知hla-h、hla-j、hla-v、hla-y和hla-e没有可变剪接形式。hla-h、hla-j、hla-v、hla-y是可溶的，hla-e是膜结合的。
19.根据本发明，术语“核酸序列”或“核酸分子”包括dna，例如cdna或双链或单链基因组dna和rna。在这方面，“dna”(脱氧核糖核酸)是指化学构件腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的任何链或序列，这些化学构件称为核苷酸碱基，其在脱氧核糖主链上连接在一起。dna可以具有一条核苷酸碱基链，或可以形成双螺旋结构的两条互补链。“rna”(核糖核酸)是指化学构件腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的任何链或序列，这些化学构件称为核苷酸碱基，其在核糖主链上连接在一起。rna通常具有一条核苷酸碱基链，如mrna。还包括单链和双链杂合分子，即dna-dna、dna-rna和rna-rna。某些核酸分子，例如下文所述的shrna、mirna或反义核酸分子，也可以通过本领域已知的许多手段修饰。这种修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰，例如用不带电荷的键的修饰(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸分子，在下文中也称为多核苷酸，可以包含一个或多个额外的共价连接部分，例如蛋白质(例如抗体、信号肽等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷基化剂。多核苷酸可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键来衍生化。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子，例如dna或rna的合成或半合成衍生物和混合聚合物。根据本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、氨基磷酸酯核酸、2
’‑
o-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(hna)、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)(见braasch and corey,chem biol 2001,8:1)。lna是一种rna衍生物，其中核糖环受限于2
’‑
氧和4
’‑
碳之间的亚甲基键。还包括含有修饰碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶。核酸分子通常携带遗传信息，包括通过细胞机制用来制造蛋白质和/或多肽的信息。核酸分子可以额外包含启动子、增强子、应答元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5
’‑
和3
’‑
非编码区等。
20.优选地，根据本发明的核酸分子是基因组dna或mrna。在mrna的情况下，核酸分子可以另外包含聚-a尾。
21.seq id no:1-17的氨基酸序列分别是人hla蛋白hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、、hla-y、hla-e、hla-f1、f2、f3和hla-g1、g2、g3、g4、g5、g6和g7。同样，在hla-f1至f3中，优选f1和f2的hla，在hla-g1至g7中，优选g1和g5的hla。
22.本文可与术语“多肽”互换使用的术语“蛋白质”描述了包含至少50个氨基酸的氨基酸的线性分子链，包括单链蛋白质或其片段。如本文所用，术语“肽”描述了由最多49个氨基酸组成的一组分子。如本文所用，术语“肽”描述了逐渐优选的由至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸和至少40个氨基酸组成的一组分子。这些肽和多肽使用术语“(多)肽”来统称。(多)肽可以进一步形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚体。这种多聚体的相应更高阶结构相应地称为同或异二聚体、同或异三聚体等。例如，hla蛋白包含
半胱氨酸，因此包含潜在的二聚化位点。术语“(多)肽”和“蛋白质”还指天然修饰的(多)肽和蛋白质，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰来实现。
23.根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述了与构成模板核酸或氨基酸序列全长的核苷酸或氨基酸残基数目相比，两个或多个比对的核酸或氨基酸序列的相同核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数目。换句话说，当在比较窗口或在使用本领域已知的序列比较算法测量的指定区域上以最大对应性比较和比对(子)序列时，或在人工比对和目测检查时，使用两个或更多个序列或子序列比对，可以确定相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如80％、85％、90％或95％相同性)。这个定义也适用于待比对的任何序列的互补序列。
24.与本发明有关的核苷酸和氨基酸序列分析和比对方法优选使用ncbi blast算法(stephen f.altschul,thomas l.madden,alejandro a.jinghui zhang,zheng zhang,webb miller,and david j.lipman(1997),nucleic acids res.25:3389-3402)进行。blast可用于核苷酸序列(核苷酸blast)和氨基酸序列(蛋白质blast)。本领域技术人员已知用于比对核酸序列的其它合适程序。
25.如本文所定义，本发明设想至少85％相同性、优选至少90％相同性和最优选至少95％相同性的序列相同性。然而，本发明还设想逐渐优选的至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的序列相同性。与所有这些序列相关，优选其保留编码能发挥免疫抑制作用的蛋白质或肽的相应seq id no序列的能力。与这些序列相关，还优选其保留能提高植入效率的能力。
26.根据本发明第一方面的优选实施方案，所述核酸分子融合至异源核苷酸序列，优选与异源启动子可操作地连接。
27.所述异源核苷酸序列可以直接或间接地与根据本发明的核酸分子融合。在间接融合的情况下，优选将编码肽接头的核苷酸序列用于融合，如gs-接头(例如gly-gly-gly-gly-ser)n(seq id no:35)，其中n是1-3)。
28.如本文所用，异源核苷酸序列是无法在自然界中发现的与本发明第一方面所定义的核苷酸序列融合的序列。注意到这些核苷酸序列来自人，优选所述异源核苷酸序列也来自人。
29.因此，异源启动子是无法在自然界中发现的与本发明第一方面所定义的核苷酸序列可操作地连接的启动子。所述异源启动子优选来自人。
30.启动子是启动特定基因转录的核酸序列，所述基因是根据本发明如本发明第一方面所定义的。就此而言，“可操作地连接”是指异源启动子与根据本发明的核酸分子融合，从而通过所述启动子可以启动根据本发明的核酸分子的转录。所述异源启动子可以是组成型活性启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子或合成启动子。组成型启动子在几乎所有组织中指导表达，并且在很大程度上(如果不是完全的话)独立于环境和发育因素。由于其表达普遍不受内源性因素的条件化，因此组成型启动子通常在跨物种甚至跨界都有活性。组织特异性或发育阶段特异性启动子在一或多种特定组织中或在某些发育阶段指导基因的表达。诱导型启动子的活性是由生物或非生物因素的存在与否而诱导的。诱导型启动子是遗传工程中非常强大的工具，因为与其可操作地连接的基因的表达可以根据需要打开或关闭。合成启动子是通过将来自不同来源的启动子区域的主要元件组合在一
起而构建的。
31.在本领域中用于异源表达基因的异源启动子的非限制性实例是sv40、cmv、hsv、ubc、ef1a、pgk、vlambda1、rsv和cagg(用于哺乳动物系统)；copia和act5c(用于果蝇系统)及gal1、gal10、gal7、gal2(用于酵母系统)并且也可以与本发明结合使用。
32.例如，在hoffmann et al.,gene ther.2017may；24(5):298-307.doi:10.1038/gt.2017.20.epub 2017apr 20中描述了用于人体中高度且稳定的转基因表达的启动子。合适的启动子的非限制性例子是遍在启动子cmv、cag、cba和ef1a以及组织特异性启动子synapsin、camkiia、gfap、rpe、alb、tbg、mbp、mck、tnt和amhc。
33.或者或此外，所述异源核酸序列可以是编码序列，使得本发明的核酸序列产生融合蛋白。
34.如本文所用，术语“简并”是指遗传密码的简并性。密码子的简并性是遗传密码的冗余，表现为指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性。遗传密码的简并性是同义突变存在的原因。
35.包含至少150个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少450个核苷酸、最优选至少600个核苷酸的片段优选是保留编码能发挥免疫抑制作用的蛋白质或肽的相应全长序列的能力的片段。结合第一方面，所述片段还优选地能提高植入效率。最优选所述片段是仅缺少5
’‑
atp起始密码子和/或3
’‑
tag终止密码子的片段。
36.根据本发明，术语“载体”优选意指质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如在遗传工程中常规使用的另一种载体，其携带根据本发明的核酸分子。例如，根据本发明的核酸分子可以插入到一些可商购载体中。对于通过载体在人体中表达转基因，优选慢病毒载体和腺相关载体(aav)，更优选aav。aav是一种可工程化为将dna递送至靶细胞的无包膜病毒，并在该领域引起了极大关注，特别是在临床阶段实验治疗策略中。迄今为止，已证明产生缺少任何病毒基因并含有用于各种治疗应用的感兴趣dna序列的重组aav颗粒的能力是基因疗法最安全的策略之一(见naso et al.(2017),biodrugs；31(4):317
–
334的综述)。
37.插入载体中的核酸分子可以例如通过标准方法合成，或从天然来源分离。编码序列与转录调控元件和/或其它氨基酸编码序列的连接也可以使用已有的方法进行。确保在原核生物或真核细胞中表达的转录调控元件(表达盒的部分)是本领域技术人员熟知的。这些元件包含确保转录起始的调节序列(如翻译起始密码子，启动子，例如天然相关或异源启动子和/或绝缘子；见上文)，内部核糖体进入位点(ires)(owens,proc.natl.acad.sci.usa98(2001),1471-1476)和任选存在的聚-a信号以确保转录终止和转录物稳定。额外的调控元件可以包括转录和翻译增强子。优选地，根据本发明编码多肽/蛋白质或融合蛋白的多核苷酸可操作地连接于这种表达控制序列，使得可以在原核生物或真核细胞中表达。所述载体可以进一步包含编码分泌信号的核酸序列作为进一步的调节元件。这种序列是本领域技术人员熟知的。此外，取决于所使用的表达系统，可以将能够引导表达的多肽至细胞区室中的前导序列加入根据本发明的多核苷酸的编码序列中。这种前导序列在本领域中是熟知的。
38.此外，优选所述载体包含可选择标记。可选择标记的实例包括编码对新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素具有抗性的基因。专门设计的载体允许dna在不同宿主之间穿梭，例如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞(例如invitrogen提供的gateway系统)。根据本发
明的表达载体能指导本发明的多核苷酸和编码的肽或融合蛋白的复制和表达。除了通过诸如噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)的载体引入之外，如上文所述的核酸分子可以被设计为用于直接引入或通过脂质体引入细胞。此外，杆状病毒系统或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)的系统可用作根据本发明的核酸分子的真核表达系统。
39.术语“宿主细胞”意指以任何方式选择、修饰、转化、生长或使用或操纵的任何生物体的任何细胞，用于由所述细胞产生根据本发明的蛋白质或肽或融合蛋白。
40.根据本发明的宿主细胞通常通过将根据本发明的核酸分子或载体引入宿主细胞中而产生，宿主细胞基于其存在而介导编码根据本发明的蛋白质或肽或融合蛋白的根据本发明的核酸分子的表达。从中衍生或分离所述宿主细胞的宿主可以是任何原核或真核细胞或生物体，优选除通过破坏人类胚胎直接衍生的人类胚胎干细胞外。
41.可用作本发明宿主的合适原核生物(细菌)是例如那些通常用于克隆和/或表达的原核生物，如大肠杆菌(比如大肠杆菌菌株bl21、hb101、dh5a、xl1 blue、y1090和jm101)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、荚壳伯克霍尔德氏菌(burkholderia glumae)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域熟知的。
42.合适的真核宿主细胞可以是脊椎动物细胞、昆虫细胞、真菌/酵母细胞、线虫细胞或植物细胞。真菌/酵母细胞可以是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)细胞或曲霉(aspergillus)细胞。使用根据本发明的核酸分子或载体进行遗传工程的宿主细胞的优选实例是酵母、大肠杆菌和/或芽孢杆菌属(bacillus)物种(例如枯草芽孢杆菌)的细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母)。
43.在不同的优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、小鼠骨髓瘤淋巴母细胞、人胚胎肾细胞(hek-293)、人胚胎视网膜细胞(crucell的per.c6)，或人羊水细胞(glycotope和cevec)。这些细胞在本领域中经常用于产生重组蛋白。cho细胞是最常用的哺乳动物宿主细胞，用于工业生产用于人的重组蛋白治疗剂。
44.受精卵母细胞或植入前胚胎成功植入的比率主要取决于两个因素：胚胎的质量和子宫的接受性。关于子宫的接受性，值得注意的是在植入期间，胚胎(通过滋养层)与子宫壁直接接触。如果ivf程序中的卵母细胞来自接受所述受精卵母细胞或植入前胚胎的雌性，由于来自父亲的遗传信息导致胚胎是半异体移植物，如果ivf程序中的卵母细胞来自雌性捐赠者，则胚胎甚至是异体移植物。非常值得注意的是，子宫仍然不会排斥胚胎，而通常允许胚胎附着在子宫上。假设hla ib类基因hla-e、hla-f(f1至f3)和hla-g(g1至g7)以及hla基因hla-h、hla-j、hla-l、hla-v和hla-y由胚胎表达并发挥主要的免疫抑制功能，使所述胚胎在不被母体排斥的情况下植入。虽然从现有技术已知hla-e、hla-f和hla-g在妊娠和癌症中的表达，但就发明人所知的现有技术没有描述hla-e、hla-f和hla-g用于将植入前胚胎植入
子宫的任何特殊作用，更不用说在体外受精程序中的作用了。
45.关于hla-h、hla-j和hla-l，本技术人先前出人意料地发现hla-l、hla-h和hla-j在本领域被错误地注释为假基因。事实上，这些基因编码蛋白质，并且在多种癌症中检测到hla-l、hla-h和hla-j的表达(pct/ep2019/060606，ep19184729.2，ep19184681.5和ep19184717.7)。此外，在hla-v和hla-y中还发现了一个启动子区和一个开放读框。由于hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y在本领域均被错误注释，因此hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y可以共同地描述为新的hla-组，在此称为iw类。此外，在膀胱癌患者中发现hla-l、hla-h和hla-j的高表达水平与这些患者的生存负相关。这些hla基因的表达水平越高，患者在2年内死于癌症的可能性就越大(ep19184681.5和ep19184717.7)。这些证据表明，hla的l、h和j形式的表达被肿瘤用作逃避肿瘤患者免疫系统的机制。对于hla-v和hla-y可以相同假设。关于癌症的这些数据表明，在植入期间，胚胎表达hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y以逃避母体的免疫系统，从而使胚胎能植入子宫。
46.总之，hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g提高了子宫对胚胎的接受性，从而在ivf程序期间提高胚胎植入的效率。实施例1示例说明了在胚细胞培养基补充hla ib和iw类基因从而提高ivf程序期间胚胎植入的效率。此外，实施例2显示了在胚细胞培养基中hla-ib类和iw类基因的表达。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合当用于如上文定义的方法中时，增加子宫的接受性，进而导致在ivf程序期间提高胚胎植入的效率。
47.在这方面，在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，将所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触。在实践中，这可以例如通过在包含所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的培养基中培养所述未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎来完成。这将导致受精卵母细胞或植入前胚胎中hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加，此时将其移植至子宫并随后到达子宫壁。
48.也可以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后，将所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触。在实践中，这可以例如通过制备包含所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的溶液以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后冲洗子宫而完成。这种方法同样导致在植入时受精卵母细胞或植入前胚胎与子宫的交界处hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加。
49.作为又一替代方案，可以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。系统性施用也将导致在植入时在受精卵母细胞或植入前胚胎与子宫交界处hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加。
50.根据本发明第一方面的一个优选实施方案，在体外受精之前是(i)在收集未受精卵母细胞之后至即刻将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前之间的任何时间，和(ii)优选在卵母细胞被精子受精之后至即刻将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前之间的任何时间。
51.如上所述，ivf程序包括(i)从雌性供体的卵巢收集成熟未受精卵母细胞，(ii)用
精子使成熟未受精卵母细胞受精以获得受精卵母细胞，(iii)任选受精卵母细胞发育为植入前胚胎的体外植入前发育，和(iv)将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到雌性子宫。
52.根据上述优选实施方案，体外受精之前可以是处于阶段(ii)或(iii)，优选处于阶段(iii)。
53.根据本发明第一方面的进一步优选的实施方案，体外受精后是(i)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后6天之间的任何时间，(ii)优选是在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后4天之间的任何时间，并且(iii)最优选是在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后2天之间的任何时间。
54.关于这个优选实施方案，值得注意的是，移植受精卵母细胞或植入前胚胎可以在卵母细胞受精后即刻至卵母细胞受精后最多6天的任何时间在人体内进行。这是因为受精后，囊胚在第六天孵化并准备好植入。如果囊胚在子宫外孵化，则就不能再植入子宫。
55.本发明在第二方面涉及在雌性体外受精期间增加受精卵母细胞或植入前胚胎被植入的可能性的离体或体外方法，包括在存在如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的条件下培养分离的卵母细胞或植入前胚胎。
56.本发明第一方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第二方面。
57.(i)至(iv)的ivf程序的ivf步骤已在上文讨论。第二方面的离体或体外方法不包括体内步骤(i)和(iv)，而是涉及离体或体外生产与在不存在如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任意组合的条件下培养的分离的卵母细胞或植入前胚胎相比具有在体外受精(当随后用于步骤(iv)时)过程中植入的可能性增加的受精卵母细胞或植入前胚胎。
58.根据本发明第二方面的优选实施方案，所述分离的卵母细胞是未受精卵母细胞或受精卵母细胞。
59.因此，所述分离的卵母细胞可以在其与精子受精之前和/或之后在存在核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的条件下培养。
60.本发明在第三方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于预防妊娠期间流产的用途。
61.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第三方面。
62.同样，本发明涉及预防妊娠期间流产的方法，包括为妊娠雌性施用如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
63.流产是在胚胎或胎儿在子宫外可以存活之前将其排出而结束妊娠。根据第三方面的流产是在没有干预的情况下发生的，也可以称为非干预流产(miscarriage)或自然流产。15％至30％的已知妊娠止于临床上明显的非干预流产，取决于孕妇的年龄和健康状况。这些自然流产的80％发生在孕早期。
64.此外，在胚胎植入子宫后，胚胎仍可以被母体排斥。这种排斥反应可以通过hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的免疫抑制作用来预防。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合也可用于预防流产。
65.本发明在第四方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或
蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防妊娠雌性中的先兆子痫。
66.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第四方面。
67.同样，本发明涉及治疗或预防妊娠雌性先兆子痫的方法，包括为妊娠雌性施用如本发明的第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
68.先兆子痫是一种影响一些妊娠女性的病症，通常在妊娠的后半期(大约20周)或分娩后不久发生。轻度先兆子痫影响多达6％的妊娠，严重病例在约1％至2％的妊娠中发生。先兆子痫的特征在于高血压和另一个器官系统最常见的是肝脏和肾脏受损的迹象。如果不治疗，先兆子痫会导致母亲和胎儿/婴儿出现严重甚至致命的并发症。
69.目前，最有效的治疗是分娩，但是即使在分娩后，症状消失仍需要一段时间。
70.先兆子痫始于胎盘，胎盘是整个妊娠期滋养胎儿的器官。在妊娠早期，新血管发生并进化以有效地将血液输送到胎盘。滋养层是形成囊胚外层的细胞，为胚胎提供营养并发育成大部分的胎盘。多种免疫细胞和免疫效应分子在胎儿-母体交界处发现并且已经被描述为维持对半异体胎儿的免疫耐受的重要参与者。假定胎儿滋养层细胞表达hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g并通过其免疫抑制作用免受母体t细胞介导的同种异体反应性，所述母体t细胞介导的同种异体反应性与先兆子痫有关。
71.因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合也可用于治疗或预防先兆子痫。
72.根据本发明第四方面的优选实施方案，所述妊娠雌性怀有雄性胚胎或胎儿。
73.怀有雄性胚胎或胎儿的女性的先兆子痫患病率高于怀有雌性胚胎或胎儿的女性。原因可能是由于异基因y染色体的存在所致雄性胎儿的同种异体反应性更强。
74.本发明在第五方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂用于治疗或预防hellp综合征的用途。
75.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第五方面。
76.同样，本发明涉及治疗或预防hellp综合征的方法，包括为有需要的妊娠雌性或分娩雌性施用如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂。
77.hellp综合征(溶血、肝酶升高和低血小板)是一种妊娠并发症，其特征在于溶血、肝酶升高和低血小板计数。其通常在妊娠的最后三个月或分娩后不久开始。hellp综合征发生在大约0.7％的妊娠中。在hellp综合征中，胎儿的细胞涌进母体机体并导致母体中移植物抗宿主反应。hellp综合征在第一次妊娠时更常见，因为母体的免疫系统尚未耐受胚胎。
78.为使母体的免疫系统能识别流动在母体机体中的胎儿细胞，可以使用如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质的抑制剂。这种抑制剂抑制母体免疫系统对胎儿细胞的免疫耐受性，因为hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的免疫抑制作用被所述抑制剂抑制。
79.根据本发明第五方面的优选实施方案，(i)所述核酸分子的抑制剂选自小分子、适体、sirna、shrna、mirna、核酶、反义核酸分子、基于crispr-cas9的构建体、基于crispr-cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶，和/或(ii)所述蛋白质的结合分子，优选蛋白质的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物、适体。
80.根据本发明第五方面的更优选实施方案，所述抗体模拟物优选选自affibody、
adnectin、anticalin、darpin、avimer、nanofitin、affilin、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和probody。
81.如本文所用，“小分子”优选为有机分子。有机分子涉及或属于具有碳基的化合物类别，碳原子通过碳-碳键连接在一起。有机一词的原始定义与化合物的来源有关，有机化合物是从植物或动物或微生物来源获得的那些含碳化合物，而无机化合物是从矿物来源获得的。有机化合物可以是天然的或合成的。有机分子优选为芳族分子，更优选为杂芳族分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述具有共振键环的环状(环形)平面(扁平)分子，与具有相同原子集的其它几何或连接排列相比表现出更高的稳定性。芳族分子非常稳定，不易分解而与其它物质反应。在杂芳族分子中，芳环中的至少一个原子是碳以外的原子，例如n、s或o。对于所有上述有机分子，分子量优选在200da至1500da范围内，更优选在300da至1000da范围内。
82.或者，根据本发明的“小分子”可以是无机化合物。无机化合物源于矿物来源，包括所有不含碳原子的化合物(二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐除外)。优选地，小分子的分子量小于约2000da，或小于约1000da，例如小于约500da，甚至更优选小于约da amu。小分子的大小可以通过本领域熟知的方法例如质谱法来确定。比如，可以基于靶分子的晶体结构设计小分子，其中可以在体内测定例如体内高通量筛选(hts)测定中鉴定和验证推测与生物活性相关的位点。
83.根据本发明使用的术语“抗体”包括例如多克隆或单克隆抗体。此外，术语“抗体”还包括仍保留对于靶例如hla-j的结合特异性的其衍生物或片段。抗体片段或衍生物尤其包括fab或fab’片段、fd、f(ab’)2、fv或scfv片段、单结构域vh或v-样结构域，例如vhh或v-nar-结构域，以及多聚体形式，例如微型抗体(minibody)、双特异抗体(diabody)、三特异抗体(tribody)或三重抗体(triplebody)、四特异抗体(tetrabody)或化学缀合的fab
’‑
多聚体(见例如harlow and lane"antibodies,a laboratory manual",cold spring harbor laboratory press,198；harlow and lane“using antibodies:alaboratory manual”cold spring harbor laboratory press,1999；altshuler ep,serebryanaya dv,katrukha ag.2010,biochemistry(mosc).,vol.75(13),1584；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),1126)。多聚体形式特别包括可以同时结合两种不同类型抗原的双特异性抗体。第一抗原可见于根据本发明的蛋白质上。第二抗原可以是例如在滋养层细胞或子宫的某一类型细胞上特异表达的胎盘标志物。双特异性抗体形式的非限制性实例是biclonics(双特异性、全长人igg抗体)、dart(双亲和重定向抗体)和bite(由不同抗体的两个单链可变片段(scfv)组成)分子(kontermann and brinkmann(2015),drug discovery today,20(7):838-847)。使用这种双特异性抗体可以将双特异性抗体的作用集中到例如子宫或胎盘。例如，manokhina et al.(2017),hum mol genet.；26(r2):r237-r245描述了胎盘生物标志物。
84.术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化抗体(除非人cdr外是人抗体)的实施方案。
85.用于产生抗体的各种技术在本领域中是熟知的并且描述于例如harlow and lane(1988)和(1999)及altshuler et al.,2010,loc.cit.。因此，多克隆抗体可以在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后从动物的血液中获得，单克隆抗体可以通过提供由连续细胞
系培养物产生的抗体的任何技术来产生。这种技术的实例描述于例如harlow e and lane d,cold spring harbor laboratory press,1988；harlow e and lane d,using antibodies:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory press,1999，并包括最初由and milstein,1975描述的杂交瘤技术，三瘤技术，人b细胞杂交瘤技术(见例如kozbor d,1983,immunology today,vol.4,7；li j,et al.2006,pnas,vol.103(10),3557)以及产生人单克隆抗体的ebv-杂交瘤技术(cole et al.,1985,alan r.liss,inc,77-96)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得或可以使用各种展示方法如噬菌体、核糖体、mrna或细胞展示方法从头制备。用于表达重组(人源化)抗体的合适系统可以选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(见例如美国专利6,080,560；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),11265)。此外，描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可以适用于产生特异于例如hla-j的表位的单链抗体。biacore系统中采用的表面等离子共振可用于提高噬菌体抗体的效率。
86.如本文所用，术语“抗体模拟物”是指与抗体一样可以特异性结合抗原如hla-j蛋白但在结构上与抗体不相关的化合物。抗体模拟物通常是摩尔质量约为3至20kda的人工肽或蛋白质。例如，抗体模拟物可以选自affibody、adnectin、anticalin、darpin、avimer、nanofitin、affilin、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和prododies。这些多肽在本领域中是熟知的并且在下文中更详细地描述。
87.如本文所用，术语“affibody”是指衍生自葡萄球菌蛋白a的z结构域的抗体模拟物家族。在结构上，affibody分子基于也可以掺入融合蛋白质中的三螺旋束结构域。affibody本身的分子量约为6kda，在高温和酸性或碱性条件下是稳定的。通过随机化位于参与亲本蛋白质结构域的结合活性的两个α-螺旋中的13个氨基酸而获得靶特异性(feldwisch j,tolmachev v.；(2012)methods mol biol.899:103-26)。
88.如本文所用，术语“adnectin”(也称为“单体(monobody)”)涉及基于人纤连蛋白iii的第10个胞外结构域(10fn3)的分子，其采用94个残基的ig样β-夹心折叠，具有2至3个暴露的环，但缺少中心二硫键(gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255)。具有所需靶特异性例如针对hla-j的adnectin可以通过在蛋白质的特定环中引入修饰来遗传工程化。
89.如本文所用，术语“anticalin”是指衍生自脂质运载蛋白的工程化蛋白质(beste g,schmidt fs,stibora t,skerra a.(1999)proc natl acad sci u s a.96(5):1898-903；gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255)。anticalin具有八链β-桶，其在脂质运载蛋白中形成高度保守的核心单元并通过在开放端的四个结构可变环自然形成配体的结合位点。anticalin虽然与igg超家族不同源，但显示出迄今为止被认为是抗体结合位点的典型特征：(i)由于序列变异而导致的高结构可塑性和(ii)提高的构象灵活性，允许诱导以适应不同形状的靶。
90.如本文所用，术语“darpin”是指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供通常由三个重复的β-转角产生的刚性界面。darpin通常携带对应于人工共有序列的三个重复，其中每个重复的六个位置是随机化的。因此，darpin缺乏结构灵活性(gebauer and skerra,2009)。
91.如本文所用，术语“avimer”是指一类抗体模拟物，其由两个或更多个肽序列组成，
每个肽序列具有30至35个氨基酸，其衍生自各种膜受体的a结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过a结构域发生并可以通过例如噬菌体展示技术来选择对于例如hla-j具有所需结合特异性的结构域。avimer中包含的不同a结构域的结合特异性可以但非必须相同(weidle uh,et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0092]“nanofitin”(也称为affitin)是一种抗体模拟蛋白，来源于嗜酸嗜热硫化叶杆菌(sulfolobus acidocaldarius)的dna结合蛋白sac7d。nanofitin通常具有约7kda的分子量并通过随机化结合表面上的氨基酸而特异性结合靶分子，例如hla-j(mouratou b,b
é
har g,paillard-laurance l,colinet s,pecorari f.,(2012)methods mol biol.；805:315-31)。
[0093]
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-b结晶或泛素作为支架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。例如通过噬菌体展示或核糖体展示技术选择具有如针对hla-j具有所需靶特异性的affilin。根据支架的不同，affilin的分子量约为10或20kda。如本文所用，术语affilin还指affilin的二聚或多聚形式(weidle uh,et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0094]“kunitz结构域肽”衍生自kunitz型蛋白酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂(bpti)、淀粉样前体蛋白(app)或组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域。kunitz结构域具有约6kda的分子量，可以通过展示技术例如噬菌体展示选择例如对于hla-j具有所需靶特异性的结构域(weidle et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0095]
如本文所用，术语是指源自人fyn sh3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。fyn sh3衍生的多肽在本领域中是熟知的并且已经在如grabulovski et al.(2007)jbc,282,p.3196-3204；wo 2008/022759；bertschinger et al(2007)protein eng des sel 20(2):57-68；gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255或schlatter et al.(2012),mabs 4:4,1-12)中描述。
[0096]
如本文所用，术语“三特异性结合分子”是指具有三个结合结构域并因此能结合、优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中至少一个是本发明第四方面的蛋白质的表位。两个其它表位也可以是本发明第四方面的蛋白质的表位或可以是一种或两种不同抗原的表位。三特异性结合分子优选是tritac。tritac是实体瘤的t细胞衔接器，由三个结合域组成，被设计为具有延长的血清半衰期，大小约为单克隆抗体的三分之一。
[0097]
适体是结合特异靶分子的核酸分子或肽分子。适体通常是通过从大型随机序列库中选择而产生的，但天然适体也存在于核糖开关(riboswitches)中。适体可作为大分子药物用于基础研究和临床目的。适体可以与核酶组合以在其靶分子存在的情况下进行自切割。这些化合物分子具有额外的研究、工业和临床应用(osborne et.al.(1997),current opinion in chemical biology,1:5-9；stull&szoka(1995),pharmaceutical research,12,4:465-483)。
[0098]
核酸适体是通常由(通常是短的)寡核苷酸链组成的核酸种类。通常，其已经通过重复多轮的体外选择或等效的selex(配体通过指数富集的系统进化)工程化以结合各种分子靶如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体。
[0099]
肽适体通常是设计用于干扰细胞内其它蛋白质相互作用的肽或蛋白质。它们由两端连接到蛋白质支架上的可变肽环组成。这种双重结构限制极大地增加了肽适体的结合亲
和力至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变肽环通常包含10至20个氨基酸，并且支架可以是任何具有良好溶解性的蛋白质。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-a是最常用的支架蛋白，可变肽环插入野生型蛋白质中的氧化还原活性位点，其为-cys-gly-pro-cys-环(seq id no:36)，两条半胱氨酸侧链能形成二硫键。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
[0100]
适体为生物技术和治疗应用提供了实用性，因其提供的分子识别特性可与常用的生物分子、特别是抗体相媲美。除了它们的区别性识别之外，适体还提供优于抗体的优势，因为它们可以在试管中完全工程化，易于通过化学合成产生，具有理想的储存特性，并且在治疗应用中引起很少或没有免疫原性。未修饰的适体从血流中被迅速清除，半衰期为几分钟到几小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除所致，这是适体固有的低分子量的结果。未经修饰的适体应用目前专注于治疗短暂的病症，例如血液凝固，或治疗可以局部递送的器官如眼睛。这种快速清除在例如体内诊断成像等应用中可以是一个优势。科学家可以使用多种修饰例如2
’‑
氟取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)键、融合于白蛋白或其它延长半衰期的蛋白质等，从而使适体的半衰期可以延长几天或甚至几周。
[0101]
如本文所用，术语“probody”是指蛋白酶可激活的前药，例如蛋白酶激活的抗体前药。例如，probody由原本的igg重链和修饰的轻链组成。掩蔽肽通过被肿瘤特异性蛋白酶切割的肽接头与轻链融合。掩蔽肽防止probody与健康组织结合，从而最小化毒副作用。此外，还可以通过probody将小分子、抗体或抗体模拟物和适体的结合和/或抑制活性限制于某些组织或细胞类型，特别是患病组织或细胞类型。在这样的probody中，小分子、抗体或抗体模拟物或适体也与限制或阻止与本发明蛋白质结合的掩蔽肽结合，并且该掩蔽肽可以被蛋白酶切割。蛋白酶是通过切割称为底物的特定氨基酸序列将蛋白质消化成更小片段的酶。在正常健康组织中，蛋白酶活性受到严格控制。在癌细胞中，蛋白酶活性上调。在蛋白酶活性受到调节且最小化的健康组织或细胞中，probody的靶结合区域保持被掩盖，因此无法结合。另一方面，在蛋白酶活性上调的患病组织或细胞中，probody的靶结合区域被暴露，因此能结合和/或抑制。
[0102]
根据本发明，术语“小干扰rna(sirna)”，也称为短干扰rna或沉默rna，是指长度为18至30个、优选19至25个、最优选21至23个或甚至更优选21个核苷酸的双链rna分子，其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，sirna参与rna干扰(rnai)途径，其中sirna干扰特定基因的表达。除了它们在rnai途径中的作用外，sirna还作用于rnai相关途径，例如作为抗病毒机制或塑造基因组的染色质结构。
[0103]
天然存在于自然界中的sirna具有明确定义的结构：短双链rna(dsrna)，在任一端均具有2-nt的3’突出端。每条链都有一个5’磷酸基团和一个3’羟基(-oh)基团。这种结构是dicer加工的结果，dicer是一种将长dsrna或小发夹rna转化为sirna的酶。sirna也可以外源(人工)引入细胞中，以实现感兴趣基因的特异性敲低。因此，基本上任何已知序列的基因可以基于与适当定制的sirna的序列互补性而被靶向。双链rna分子或其代谢加工产物能介导靶特异性核酸修饰，特别是rna干扰和/或dna甲基化。外源引入的sirna在其3’和5’末端可以没有突出端，然而，优选至少一条rna链具有5
’‑
和/或3
’‑
突出端。优选地，双链的一端具有1至5个核苷酸、更优选1至3个核苷酸、最优选2个核苷酸的3
’‑
突出端。另一端可以是平端或具有至多6个核苷酸的3
’‑
突出端。通常，本发明展望了任何适合充当sirna的rna分子。
迄今为止，最有效的沉默是使用由21-nt有义链和21-nt反义链组成的sirna双链体获得的，这两条链以具有2-nt的3
’‑
突出端的方式配对。2-nt的3’突出端的序列对限制于与第一个碱基对相邻的未配对核苷酸的靶识别特异性有小贡献(elbashir et al.2001)。3’突出端中的2
’‑
脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成成本更低并且可以更耐核酸酶。sirna的递送可以使用本领域已知的任何方法来完成，例如通过将sirna与盐水组合并通过静脉内或鼻内施用该组合或通过在葡萄糖(例如5％葡萄糖)或阳离子脂质中配制sirna，并且聚合物可用于通过静脉内(iv)或腹膜内(ip)的全身途径在体内递送sirna(fougerolles et al.(2008),current opinion in pharmacology,8:280-285；lu et al.(2008),methods in molecular biology,vol.437:drug delivery systems
–
chapter 3:delivering small interfering rna for novel therapeutics)。
[0104]
短发夹rna(shrna)是一种产生紧密发夹转角的rna序列，可用于通过rna干扰来沉默基因表达。shrna使用引入细胞的载体并利用u6启动子来确保shrna始终被表达。该载体通常被传递给子代细胞，从而使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构被细胞机制切割成sirna，其然后与rna诱导的沉默复合物(risc)结合。这个复合物结合并切割与之结合的匹配所述sirna的mrna。用于本发明的si/shrna优选是使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪化学合成的。rna合成试剂供应商是proligo(hamburg,germany)，dharmacon research(lafayette,co,usa)，pierce chemical(part of perbio science,rockford,il,usa)，glen research(sterling,va,usa)，chemgenes(ashland,ma,usa)和cruachem(glasgow,uk)。最方便地，sirna或shrna得自商用rna寡核苷酸合成供应商，这些供应商销售不同质量和成本的rna合成产品。通常，可用于本发明的rna是常规合成的并且容易以适合rnai的质量提供。
[0105]
实现rnai的其它分子包括例如microrna(mirna)。所述rna种类是单链rna分子。内源性存在的mirna分子通过与互补mrna转录物结合并通过类似于rna干扰的过程触发所述mrna转录物的降解来调节基因表达。因此，外源mirna可以在引入相应细胞后用作抑制剂(例如hla-j的抑制剂)。
[0106]
核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化rna)是催化化学反应的rna分子。许多天然核酶催化其自身切割或其它rna的切割，但也发现其催化核糖体的氨基转移酶活性。已充分表征的小自切割rna的非限制性例子是锤头核酶、发夹核酶、丁型肝炎病毒核酶和体外选择的铅依赖性核酶，而i组内含子是较大核酶的一个实例。近年来，催化自裂解的原理已得到很好确立。在具有核酶活性的rna分子中，锤头核酶被最佳表征。由于示出锤头结构可以整合到异源rna序列中，因此核酶活性可以转移到这些分子上，似乎可以产生几乎任何靶序列的催化反义序列，只要靶序列含有潜在的匹配切割位点即可。构建锤头核酶的基本原理如下：选择包含guc(或cuc)三联体的rna的感兴趣区域。取两条寡核苷酸链，每条通常有6至8个核苷酸，并在它们之间插入催化性锤头序列。最好的结果通常是用短核酶和靶序列获得的。
[0107]
根据本发明也可使用的一项最近的进展是识别小化合物的适体与锤头核酶的组合。适体与靶分子结合后诱导的构象变化可以调节核酶的催化功能。
[0108]
如本文所用，术语“反义核酸分子”是指与靶核酸互补的核酸。根据本发明的反义分子能与靶核酸相互作用，更具体地其能与靶核酸杂交。由于杂合体的形成，靶基因的转录
和/或靶mrna的翻译被减少或阻断。已经描述了与反义技术相关的标准方法(见例如melani et al.,cancer res.(1991)51:2897-2901)。
[0109]
crispr/cas9以及crispr-cpf1技术几乎适用于所有细胞/模型生物并可用于敲除突变、染色体缺失、dna序列编辑和基因表达调节。基因表达的调节可以通过使用与转录阻抑物缀合的催化性死亡cas9酶(dcas9)来操控以阻抑特定基因的转录，在此，例如hla-j基因。类似地，催化性失活的“死亡”cpf1核酸酶(来自prevotella和francisella-1的crispr)可以与合成的转录阻抑物或激活物融合以下调内源性启动子，例如，控制如hla-j表达的启动子。或者，锌指核酸酶(zfn)或转录激活因子样效应子核酸酶(talen)的dna结合结构域可以设计为特异性识别靶(例如hla-j)基因或其启动子区域或其5
’‑
utr，从而抑制靶的表达。
[0110]
本文还设想了作为靶向感兴趣基因或参与其表达的调节分子的抑制性核酸分子而提供的抑制剂。减少或消除靶基因或调节分子的表达的这种分子包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶。这种方法在silva et al.,curr gene ther.2011；11(1):11-27；miller et al.,nature biotechnology.2011；29(2):143-148和klug,annual review of biochemistry.2010；79:213-231中描述。
[0111]
本发明在第六方面涉及如在第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防自身免疫性疾病、优选用于妊娠雌性中的自身免疫性疾病的用途，其中所述自身免疫性疾病优选为皮肌炎、桥本甲状腺炎、干燥综合征或硬皮病。
[0112]
本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第六方面。
[0113]
类似地，本发明涉及一种治疗自身免疫性疾病的方法，包括将第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合施用于待治疗的受试者，优选是妊娠雌性。
[0114]
自身免疫性疾病是受试者自身的免疫系统攻击受试者机体的病症。hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g的免疫抑制作用预期预防或治疗受试者机体不希望的免疫反应。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合是用于治疗自身免疫性疾病的手段。
[0115]
自身免疫性疾病优选选自皮肌炎、桥本甲状腺炎、干燥综合征和硬皮病，注意这些自身免疫性疾病在妊娠女性中的患病率高于非妊娠女性。
[0116]
本发明在第七方面涉及如在第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防移植物抗宿主病的用途。
[0117]
本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第七方面。
[0118]
本发明还涉及治疗或预防移植物抗宿主病的方法，包括为受试者施用如第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
[0119]
移植物抗宿主病(gvhd)是一种免疫病症，当在移植后供体组织(移植物)中存在的免疫细胞攻击宿主自身组织时在患者中发生。gvhd是来自相关和不相关供体的骨髓移植(干细胞移植)后的并发症。这些类型的移植物被称为同种异体移植物。对于急性gvhd和慢性gvhd，症状可以从轻微到严重，甚至危及生命，并且通常包括皮肤炎症、黄疸和胃肠道(gi)不适以及其它器官问题。急性gvhd通常发生在移植后的前100天内；该疾病的急性形式会导致皮疹、肝脏问题以及恶心和腹泻等肠道症状的临床症状。慢性gvhd发生较晚；该疾病
的慢性形式可以影响许多不同器官和机体系统。gvhd具有复杂的病理生理学，涉及移植供体和受体患者的免疫细胞之间的许多相互作用。
[0120]
hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g的免疫抑制作用有望预防或治疗gvhd。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合是用于治疗gvhd的手段。
[0121]
最后，根据本发明所有前述方面的优选实施方案，(i)所述至少一种核酸分子选自以下核酸分子：(a)编码包含seq id no:1-6任一氨基酸序列或由seq id no:1-6任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-23任一核苷酸序列或由seq id no:18-23任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列具有至少85％相同性、优选至少90％相同性、最优选至少95％相同性的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列具有至少95％相同性、优选至少96％相同性、最优选至少98％相同性的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸，及(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换；以及(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；及(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽。
[0122]
关于本发明的第五方面，其涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂治疗hellp综合征，应当理解这个抑制剂优选是上述优选实施方案(i)中定义的核酸分子或(iv)中定义的蛋白质或肽的抑制剂。
[0123]
seq id no:1-6是hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v和hla-y的氨基酸序列，seq id no:18-23是编码hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v和hla-y的核苷酸序列。如上所述，本技术以及申请人在此引用的先前申请的贡献是：hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、hla-y之前被错误地描述为假基因，但实际上是蛋白质编码基因。出于上述原因，hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、、hla-v、hla-y或其抑制剂可用于本文所公开的各种医学治疗以及本发明第二方面的方法。对于hla-l，与膜结合形式相比，优选可溶形式。
[0124]
结合上述优选实施方案，优选另外使用hla-g、hla-e和/或hla-f或其抑制剂，这取决于医学用途是否需要促进或抑制这些hla的免疫耐受原性作用。
[0125]
关于在本说明书中特别是在权利要求中表征的实施方案，旨在将在从属权利要求中提及的每个实施方案均与所述从属权利要求所从属的每个(独立或从属)权利要求的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1列举3个选项a、b和c的情况下，从属权利要求2列举3个选项d、e和f以及权利要求3从属于权利要求1和2并列举3个选项g、h和i的情况下，应当理解，本说明书明确地公开了对应于以下组合的实施方案：a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有特别说明。
[0126]
类似地，并且在独立权利要求和/或从属权利要求没有列举选项的那些情况下，应当理解如果从属权利要求回引多个在前的权利要求，则认为明确公开了由此涵盖的主题的
任何组合。例如，在独立权利要求1、回引权利要求1的从属权利要求2和回引权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，权利要求3和1的主题组合与权利要求3、2和1的主题组合一样清楚且明确地公开。在存在引用权利要求1至3任一项的进一步从属权利要求4的情况中，则权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚且明确地公开。
[0127]
实施例示例说明了本发明。
[0128]
实施例1：在胚细胞培养基中补充hla ib和iw类基因
[0129]
这个实施例涉及通过用合成的hla ib和iw类分子补充胚细胞培养物或通过全身性应用其来支持体外受精胚胎植入的程序。
[0130]
将hla-g、hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e和/或hla-f加入胚胎细胞培养物中。根据et al.(c1,wikland m,robertson sa.,hum reprod.1999dec；14(12):3069-76)和bhatnagar et al.(bhatnagar p1,papaioannou ve,biggers jd,development.1995may；121(5):1333-9)评估加入细胞培养物中的hla蛋白的剂量。根据现有技术水平和favier et al(favier et al.,plos one.2011；6(7):e21011)产生重组hla-g或hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f蛋白。
[0131]
对于静脉内应用，在cgmp条件下产生重组hla-g、hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e和/或hla-f蛋白。根据欧洲药典v.8.0(european pharmacopoeia(ph.eur.)vol 8(2013
–
2016)european directorate of quality of medicines)的专论对质量、无菌性、内毒素检测以及化学纯度进行检测。
[0132]
为比较hla补充对植入率和妊娠率的影响，还监测了未接受hla蛋白补充的对照组。
[0133]
根据美国生殖医学学会的指南(fertil steril,2017；107:882-96)，在第5天移植胚胎。通过测量游离β-人绒毛膜促性腺激素(β-hcg)的血清水平和阴道超声观察来监测成功的植入。
[0134]
可以观察到，与对照组相比，接受hla补充治疗的胚胎的植入率和成功妊娠率显著更高。
[0135]
实施例2：在胚细胞培养基中hla ib和iw类基因的提取和确定
[0136]
为通过定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)评估胚细胞培养基中hla ib和iw类表达，首先提取rna。由于胚细胞在细胞外囊泡(ev)中脱落rna(giacomini et al.,sci rep.2017；7:5210)，根据et al.(et al.,hum immunol.2016sep；77(9):791-9)的方案首先在exoquick
tm
(sbi systems bioscience inc.mountain view ca,usa)中收集ev来分离rna。去除exoquick
tm
试剂后，根据stratifyer血液提取试剂盒的方案提取rna。简而言之，在蛋白酶k消化后，在存在促进核酸结合的特殊缓冲液下将裂解物与涂有锗的磁性颗粒混合。通过混合、磁化、离心和去除污染物的连续循环进行纯化。用25μl洗脱缓冲液洗脱rna，然后将rna洗脱液储存在-80℃直至使用。通过使用qrt-pcr对已知为稳定参考/管家基因的组成型表达基因calmodulin 2基因(calm2)进行定量，测试所有提取物的足够高质量rna含量。为通过qrt-pcr方法详细分析基因表达，使用了位于感兴趣区域两侧的引物和在其间杂交的荧光标记探针。使用rna特异性引物/探针序列以通过定位跨外显子/外显子边界的引物/探针序列来实现rna特异性测量。如果存在同一基因的多个同种型，则选择
引物以酌情扩增所有相关或选择的剪接变体。通过常规pcr反应检查所有引物对的特异性。已针对hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g生成了特异性引物。
[0137]
发现hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g在胚细胞培养物中表达。
1.发明背景
2.本发明涉及一种核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合，用于在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法中，(i)其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含seq id no:1-17任一氨基酸序列或由seq id no:1-17任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-23任一核苷酸序列或由seq id no:18-23任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列至少85％相同、优选至少90％相同、最优选至少95％相同的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸，和(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换，和(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽；以及其中提高胚胎植入效率的方法包括：(i)在将受精的卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。
3.在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开虽然不认为与本发明的可专利性相关，但通过引用将其全部并入本文。更具体地，所有引用的文件都以引用的方式并入本文，类似于每个单独的文件被具体和单独指出以引用的方式并入本文。
背景技术：
4.人类白细胞抗原(hla)系统或复合体是编码人类主要组织相容性复合体(mhc)蛋白的基因复合体。hla基因复合体位于染色体6p21内的3mbp节段上。人类白细胞抗原(hla)基因在生物医学科学和治疗中作为重要靶点有着悠久的研究历史。超过100种疾病与组织相容性复合体基因的不同等位基因有关。与此同时，距首次描述hla与人类疾病之间的关联已有50年了。hla分子已被证明对于生理学、保护性免疫和有害的致病的自身免疫反应性至关重要(debdrou et al.(2018),nature reviews immunology volume18,pages 325
–
339)。
5.例如，在gough and simmonds,curr genomics.2007nov；8(7):453
–
465中回顾了hla基因在自身免疫性疾病中的作用。比如，hla-b27等位基因会增加发生称为强直性脊柱炎的炎症性关节疾病的风险。
6.许多其它涉及异常免疫功能的疾病和某些形式的癌症也与特定hla等位基因有
关。例如，ep2561890描述了一种用于癌症免疫治疗的方式。该专利首先描述了在原发性肿瘤组织以及转移和复发性肿瘤中非经典hla ib类组的研究概况。第二步包括量身定制的抗体疗法。
7.hla ib类基因hla-e、hla-f和hlag是在经典hla ia类基因之后很久才被发现的。对其功能的阐明有一个内敛的开始。然而，其正在病理生理学和一系列疾病中展现出基本功能和参与。尽管一系列研究的结果支持hla ib类分子在成年生活中的功能作用，特别是已经对hla-g和hla-f进行了生殖和妊娠相关研究。胎盘中胎儿-母体交界处hla ib类蛋白的表达似乎对母体接受半同种异体胎儿很重要(persson et al.(2017),immunogenetics,doi 10.1007/s00251-017-0988-4)。在妊娠期间，胎盘，更具体地说是滋养层，在胚胎/胎儿和母体免疫系统之间产生一个“交界处”。滋养层不表达胚胎/胎儿的“原始”hla识别(hla-a至-dq)，而是显示非经典hla ib组e、f和g。在与nk细胞的特异性受体(例如杀伤细胞-免疫球蛋白样受体(kir))和淋巴细胞的特异性受体(淋巴细胞-免疫球蛋白样受体(lil-r))相互作用期间，所述非经典hla组在妊娠外抑制这些免疫活性细胞(w
ü
rfel et al.(2019),int.j.mol.sci.2019,20,1830；doi:10.3390/ijms20081830)。
8.尽管已经收集了关于hla基因与疾病关联的所有知识，但仍然需要将研究重点放在hla基因上，特别是鉴定基于hla系统的生物医学科学和治疗的进一步的靶点。本发明解决了此需求。
技术实现要素：
9.因此，本发明在第一方面涉及一种核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合，用于在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法中的用途，(i)其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含seq id no:1-17任一氨基酸序列或由seq id no:1-17任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-34任一核苷酸序列或由seq id no:18-34任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列具有至少85％相同性、优选至少90％相同性、最优选至少95％相同性的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸，及(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换，以及(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；和(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽；并且其中提高胚胎植入效率的方法包括：(i)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；或(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。
10.本发明还涉及在体外受精程序中提高胚胎植入效率的方法，包括(i)在将受精卵
母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，使核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触；或(ii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，使核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触；或(iii)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前、同时和/或之后，系统性施用核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用，其中所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合如结合本发明的第一方面所定义。
11.体外受精(ivf)程序是一系列复杂的步骤，用于帮助有育性问题的雌性，例如预防遗传问题或帮助受孕。ivf程序包括以下步骤：(i)从供体雌性的卵巢收集成熟的未受精卵母细胞，(ii)用精子使分离的成熟未受精卵母细胞受精以获得受精卵母细胞，(iii)任选地，将受精卵在体外在植入前发育为植入前胚胎，和(iv)将受精卵或植入前胚胎移植到雌性子宫中。一个完整的ivf程序周期通常需要大约三周时间。成熟卵母细胞的特征在于其可以被精子受精。成熟卵通常以相邻的极体为特征。这个程序可以使用要接受ivf治疗的雌性自己的卵母细胞和伴侣的精子来完成。ivf也可以涉及来自已知或匿名捐赠者的卵母细胞、精子或植入前胚胎。在体内，在正常妊娠期间，受精卵在输卵管壶腹中发育成植入前胚胎。然而，这种发育也可以在体外发生。因此，受精卵或植入前胚胎都可以移植到雌性的子宫中。ivf是目前最有效的辅助生殖技术形式。
12.本发明第一方面的方法包括在上文第(i)项中提到的未受精卵的情况下，未受精卵被精子受精和任选地进一步发育成植入前胚胎，之后将受精卵或植入前胚胎移植到子宫。
13.胚胎植入是妊娠中胚胎附着在子宫壁上的阶段。在这个产前发育阶段，孕体被称为囊胚。正是通过这种附着，胚胎从母体获得氧和营养物质，从而能够生长。在人正常妊娠期间，植入前胚胎的植入最可能发生在排卵后9天左右；然而，此范围可以是在6至12天之间。同样在ivf程序中，受精卵母细胞或植入前胚胎在已经将其放入子宫后会附着在子宫壁上。
14.与第一实施方案相关的待治疗的雌性优选地是人。更优选是因先前的体外受精程序由于胚胎植入失败而导致失败的人类女性。在这种情况下以及通常来说，提高胚胎植入的方法也可以是治疗或预防植入失败的方法。
15.seq id no:18-34的核酸序列分别是编码人hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f1、f2、f2和hla-g1、g2、g3、g4、g5、g6和g7的基因。在hla-f1至f3中，优选f1和f5的hla。类似地，在hla-g1至g7中，优选g1和g5的hla。
16.在申请ep19184681.5中报道了编码hla-l的基因包含编码跨膜结构域的序列并且还可以检测到可溶hla-l。因此认为hla-l可以以全长膜结合形式以及可溶形式存在。全长hla-l也可以通过翻译后蛋白水解裂解释放，导致可溶hla片段的释放。
17.hla-g的主要转录物(8个外显子，ncbi gene bank nm_002127.5，2019年9月16日版本)可以剪接为7个可变mrna，其编码膜结合(hla-g1、-g2、-g3、-g4)和可溶(hla-g5、-g6、-g7)蛋白质异构体(carosella et al.,2008,trends immunol.；29(3):125-32)。hla-g1是全长hla-g分子，hla-g2缺少外显子4，hla-g3缺少外显子4和5，hla-g4缺少外显子5。hla-g1至-g4因为存在由外显子6和7编码的跨膜和胞质尾区而是膜结合分子。hla-g5与
hla-g1相似但保留内含子5，hla-g6缺少外显子4但保留内含子4，hla-g7缺少外显子4但保留内含子2。由于存在内含子4，因此hla-g5和-g6是可溶形式，内含子4包含提前终止密码子以阻止跨膜和胞质尾区的翻译。由于内含子3的存在，因此hla-g7是可溶的，内含子3包含提前终止密码子。hla-f也是可变剪接的。三种异构体f1、f2和f3都是膜结合异构体。
18.已知hla-h、hla-j、hla-v、hla-y和hla-e没有可变剪接形式。hla-h、hla-j、hla-v、hla-y是可溶的，hla-e是膜结合的。
19.根据本发明，术语“核酸序列”或“核酸分子”包括dna，例如cdna或双链或单链基因组dna和rna。在这方面，“dna”(脱氧核糖核酸)是指化学构件腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的任何链或序列，这些化学构件称为核苷酸碱基，其在脱氧核糖主链上连接在一起。dna可以具有一条核苷酸碱基链，或可以形成双螺旋结构的两条互补链。“rna”(核糖核酸)是指化学构件腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的任何链或序列，这些化学构件称为核苷酸碱基，其在核糖主链上连接在一起。rna通常具有一条核苷酸碱基链，如mrna。还包括单链和双链杂合分子，即dna-dna、dna-rna和rna-rna。某些核酸分子，例如下文所述的shrna、mirna或反义核酸分子，也可以通过本领域已知的许多手段修饰。这种修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰，例如用不带电荷的键的修饰(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸分子，在下文中也称为多核苷酸，可以包含一个或多个额外的共价连接部分，例如蛋白质(例如抗体、信号肽等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷基化剂。多核苷酸可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键来衍生化。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子，例如dna或rna的合成或半合成衍生物和混合聚合物。根据本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、氨基磷酸酯核酸、2
’‑
o-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(hna)、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)(见braasch and corey,chem biol 2001,8:1)。lna是一种rna衍生物，其中核糖环受限于2
’‑
氧和4
’‑
碳之间的亚甲基键。还包括含有修饰碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶。核酸分子通常携带遗传信息，包括通过细胞机制用来制造蛋白质和/或多肽的信息。核酸分子可以额外包含启动子、增强子、应答元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5
’‑
和3
’‑
非编码区等。
20.优选地，根据本发明的核酸分子是基因组dna或mrna。在mrna的情况下，核酸分子可以另外包含聚-a尾。
21.seq id no:1-17的氨基酸序列分别是人hla蛋白hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、、hla-y、hla-e、hla-f1、f2、f3和hla-g1、g2、g3、g4、g5、g6和g7。同样，在hla-f1至f3中，优选f1和f2的hla，在hla-g1至g7中，优选g1和g5的hla。
22.本文可与术语“多肽”互换使用的术语“蛋白质”描述了包含至少50个氨基酸的氨基酸的线性分子链，包括单链蛋白质或其片段。如本文所用，术语“肽”描述了由最多49个氨基酸组成的一组分子。如本文所用，术语“肽”描述了逐渐优选的由至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸和至少40个氨基酸组成的一组分子。这些肽和多肽使用术语“(多)肽”来统称。(多)肽可以进一步形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚体。这种多聚体的相应更高阶结构相应地称为同或异二聚体、同或异三聚体等。例如，hla蛋白包含
半胱氨酸，因此包含潜在的二聚化位点。术语“(多)肽”和“蛋白质”还指天然修饰的(多)肽和蛋白质，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰来实现。
23.根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述了与构成模板核酸或氨基酸序列全长的核苷酸或氨基酸残基数目相比，两个或多个比对的核酸或氨基酸序列的相同核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数目。换句话说，当在比较窗口或在使用本领域已知的序列比较算法测量的指定区域上以最大对应性比较和比对(子)序列时，或在人工比对和目测检查时，使用两个或更多个序列或子序列比对，可以确定相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如80％、85％、90％或95％相同性)。这个定义也适用于待比对的任何序列的互补序列。
24.与本发明有关的核苷酸和氨基酸序列分析和比对方法优选使用ncbi blast算法(stephen f.altschul,thomas l.madden,alejandro a.jinghui zhang,zheng zhang,webb miller,and david j.lipman(1997),nucleic acids res.25:3389-3402)进行。blast可用于核苷酸序列(核苷酸blast)和氨基酸序列(蛋白质blast)。本领域技术人员已知用于比对核酸序列的其它合适程序。
25.如本文所定义，本发明设想至少85％相同性、优选至少90％相同性和最优选至少95％相同性的序列相同性。然而，本发明还设想逐渐优选的至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的序列相同性。与所有这些序列相关，优选其保留编码能发挥免疫抑制作用的蛋白质或肽的相应seq id no序列的能力。与这些序列相关，还优选其保留能提高植入效率的能力。
26.根据本发明第一方面的优选实施方案，所述核酸分子融合至异源核苷酸序列，优选与异源启动子可操作地连接。
27.所述异源核苷酸序列可以直接或间接地与根据本发明的核酸分子融合。在间接融合的情况下，优选将编码肽接头的核苷酸序列用于融合，如gs-接头(例如gly-gly-gly-gly-ser)n(seq id no:35)，其中n是1-3)。
28.如本文所用，异源核苷酸序列是无法在自然界中发现的与本发明第一方面所定义的核苷酸序列融合的序列。注意到这些核苷酸序列来自人，优选所述异源核苷酸序列也来自人。
29.因此，异源启动子是无法在自然界中发现的与本发明第一方面所定义的核苷酸序列可操作地连接的启动子。所述异源启动子优选来自人。
30.启动子是启动特定基因转录的核酸序列，所述基因是根据本发明如本发明第一方面所定义的。就此而言，“可操作地连接”是指异源启动子与根据本发明的核酸分子融合，从而通过所述启动子可以启动根据本发明的核酸分子的转录。所述异源启动子可以是组成型活性启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子或合成启动子。组成型启动子在几乎所有组织中指导表达，并且在很大程度上(如果不是完全的话)独立于环境和发育因素。由于其表达普遍不受内源性因素的条件化，因此组成型启动子通常在跨物种甚至跨界都有活性。组织特异性或发育阶段特异性启动子在一或多种特定组织中或在某些发育阶段指导基因的表达。诱导型启动子的活性是由生物或非生物因素的存在与否而诱导的。诱导型启动子是遗传工程中非常强大的工具，因为与其可操作地连接的基因的表达可以根据需要打开或关闭。合成启动子是通过将来自不同来源的启动子区域的主要元件组合在一
起而构建的。
31.在本领域中用于异源表达基因的异源启动子的非限制性实例是sv40、cmv、hsv、ubc、ef1a、pgk、vlambda1、rsv和cagg(用于哺乳动物系统)；copia和act5c(用于果蝇系统)及gal1、gal10、gal7、gal2(用于酵母系统)并且也可以与本发明结合使用。
32.例如，在hoffmann et al.,gene ther.2017may；24(5):298-307.doi:10.1038/gt.2017.20.epub 2017apr 20中描述了用于人体中高度且稳定的转基因表达的启动子。合适的启动子的非限制性例子是遍在启动子cmv、cag、cba和ef1a以及组织特异性启动子synapsin、camkiia、gfap、rpe、alb、tbg、mbp、mck、tnt和amhc。
33.或者或此外，所述异源核酸序列可以是编码序列，使得本发明的核酸序列产生融合蛋白。
34.如本文所用，术语“简并”是指遗传密码的简并性。密码子的简并性是遗传密码的冗余，表现为指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性。遗传密码的简并性是同义突变存在的原因。
35.包含至少150个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少450个核苷酸、最优选至少600个核苷酸的片段优选是保留编码能发挥免疫抑制作用的蛋白质或肽的相应全长序列的能力的片段。结合第一方面，所述片段还优选地能提高植入效率。最优选所述片段是仅缺少5
’‑
atp起始密码子和/或3
’‑
tag终止密码子的片段。
36.根据本发明，术语“载体”优选意指质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如在遗传工程中常规使用的另一种载体，其携带根据本发明的核酸分子。例如，根据本发明的核酸分子可以插入到一些可商购载体中。对于通过载体在人体中表达转基因，优选慢病毒载体和腺相关载体(aav)，更优选aav。aav是一种可工程化为将dna递送至靶细胞的无包膜病毒，并在该领域引起了极大关注，特别是在临床阶段实验治疗策略中。迄今为止，已证明产生缺少任何病毒基因并含有用于各种治疗应用的感兴趣dna序列的重组aav颗粒的能力是基因疗法最安全的策略之一(见naso et al.(2017),biodrugs；31(4):317
–
334的综述)。
37.插入载体中的核酸分子可以例如通过标准方法合成，或从天然来源分离。编码序列与转录调控元件和/或其它氨基酸编码序列的连接也可以使用已有的方法进行。确保在原核生物或真核细胞中表达的转录调控元件(表达盒的部分)是本领域技术人员熟知的。这些元件包含确保转录起始的调节序列(如翻译起始密码子，启动子，例如天然相关或异源启动子和/或绝缘子；见上文)，内部核糖体进入位点(ires)(owens,proc.natl.acad.sci.usa98(2001),1471-1476)和任选存在的聚-a信号以确保转录终止和转录物稳定。额外的调控元件可以包括转录和翻译增强子。优选地，根据本发明编码多肽/蛋白质或融合蛋白的多核苷酸可操作地连接于这种表达控制序列，使得可以在原核生物或真核细胞中表达。所述载体可以进一步包含编码分泌信号的核酸序列作为进一步的调节元件。这种序列是本领域技术人员熟知的。此外，取决于所使用的表达系统，可以将能够引导表达的多肽至细胞区室中的前导序列加入根据本发明的多核苷酸的编码序列中。这种前导序列在本领域中是熟知的。
38.此外，优选所述载体包含可选择标记。可选择标记的实例包括编码对新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素具有抗性的基因。专门设计的载体允许dna在不同宿主之间穿梭，例如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞(例如invitrogen提供的gateway系统)。根据本发
明的表达载体能指导本发明的多核苷酸和编码的肽或融合蛋白的复制和表达。除了通过诸如噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)的载体引入之外，如上文所述的核酸分子可以被设计为用于直接引入或通过脂质体引入细胞。此外，杆状病毒系统或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)的系统可用作根据本发明的核酸分子的真核表达系统。
39.术语“宿主细胞”意指以任何方式选择、修饰、转化、生长或使用或操纵的任何生物体的任何细胞，用于由所述细胞产生根据本发明的蛋白质或肽或融合蛋白。
40.根据本发明的宿主细胞通常通过将根据本发明的核酸分子或载体引入宿主细胞中而产生，宿主细胞基于其存在而介导编码根据本发明的蛋白质或肽或融合蛋白的根据本发明的核酸分子的表达。从中衍生或分离所述宿主细胞的宿主可以是任何原核或真核细胞或生物体，优选除通过破坏人类胚胎直接衍生的人类胚胎干细胞外。
41.可用作本发明宿主的合适原核生物(细菌)是例如那些通常用于克隆和/或表达的原核生物，如大肠杆菌(比如大肠杆菌菌株bl21、hb101、dh5a、xl1 blue、y1090和jm101)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、荚壳伯克霍尔德氏菌(burkholderia glumae)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域熟知的。
42.合适的真核宿主细胞可以是脊椎动物细胞、昆虫细胞、真菌/酵母细胞、线虫细胞或植物细胞。真菌/酵母细胞可以是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)细胞或曲霉(aspergillus)细胞。使用根据本发明的核酸分子或载体进行遗传工程的宿主细胞的优选实例是酵母、大肠杆菌和/或芽孢杆菌属(bacillus)物种(例如枯草芽孢杆菌)的细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母)。
43.在不同的优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、小鼠骨髓瘤淋巴母细胞、人胚胎肾细胞(hek-293)、人胚胎视网膜细胞(crucell的per.c6)，或人羊水细胞(glycotope和cevec)。这些细胞在本领域中经常用于产生重组蛋白。cho细胞是最常用的哺乳动物宿主细胞，用于工业生产用于人的重组蛋白治疗剂。
44.受精卵母细胞或植入前胚胎成功植入的比率主要取决于两个因素：胚胎的质量和子宫的接受性。关于子宫的接受性，值得注意的是在植入期间，胚胎(通过滋养层)与子宫壁直接接触。如果ivf程序中的卵母细胞来自接受所述受精卵母细胞或植入前胚胎的雌性，由于来自父亲的遗传信息导致胚胎是半异体移植物，如果ivf程序中的卵母细胞来自雌性捐赠者，则胚胎甚至是异体移植物。非常值得注意的是，子宫仍然不会排斥胚胎，而通常允许胚胎附着在子宫上。假设hla ib类基因hla-e、hla-f(f1至f3)和hla-g(g1至g7)以及hla基因hla-h、hla-j、hla-l、hla-v和hla-y由胚胎表达并发挥主要的免疫抑制功能，使所述胚胎在不被母体排斥的情况下植入。虽然从现有技术已知hla-e、hla-f和hla-g在妊娠和癌症中的表达，但就发明人所知的现有技术没有描述hla-e、hla-f和hla-g用于将植入前胚胎植入
子宫的任何特殊作用，更不用说在体外受精程序中的作用了。
45.关于hla-h、hla-j和hla-l，本技术人先前出人意料地发现hla-l、hla-h和hla-j在本领域被错误地注释为假基因。事实上，这些基因编码蛋白质，并且在多种癌症中检测到hla-l、hla-h和hla-j的表达(pct/ep2019/060606，ep19184729.2，ep19184681.5和ep19184717.7)。此外，在hla-v和hla-y中还发现了一个启动子区和一个开放读框。由于hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y在本领域均被错误注释，因此hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y可以共同地描述为新的hla-组，在此称为iw类。此外，在膀胱癌患者中发现hla-l、hla-h和hla-j的高表达水平与这些患者的生存负相关。这些hla基因的表达水平越高，患者在2年内死于癌症的可能性就越大(ep19184681.5和ep19184717.7)。这些证据表明，hla的l、h和j形式的表达被肿瘤用作逃避肿瘤患者免疫系统的机制。对于hla-v和hla-y可以相同假设。关于癌症的这些数据表明，在植入期间，胚胎表达hla-l、hla-h、hla-j、hla-v和hla-y以逃避母体的免疫系统，从而使胚胎能植入子宫。
46.总之，hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g提高了子宫对胚胎的接受性，从而在ivf程序期间提高胚胎植入的效率。实施例1示例说明了在胚细胞培养基补充hla ib和iw类基因从而提高ivf程序期间胚胎植入的效率。此外，实施例2显示了在胚细胞培养基中hla-ib类和iw类基因的表达。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合当用于如上文定义的方法中时，增加子宫的接受性，进而导致在ivf程序期间提高胚胎植入的效率。
47.在这方面，在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前，将所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎接触。在实践中，这可以例如通过在包含所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的培养基中培养所述未受精卵母细胞、受精卵母细胞和/或植入前胚胎来完成。这将导致受精卵母细胞或植入前胚胎中hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加，此时将其移植至子宫并随后到达子宫壁。
48.也可以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后，将所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合与子宫接触。在实践中，这可以例如通过制备包含所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的溶液以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后冲洗子宫而完成。这种方法同样导致在植入时受精卵母细胞或植入前胚胎与子宫的交界处hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加。
49.作为又一替代方案，可以在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植至子宫之前、同时和/或之后，系统性施用所述核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或任何组合，优选通过注射、经皮和/或阴道施用。系统性施用也将导致在植入时在受精卵母细胞或植入前胚胎与子宫交界处hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的量增加。
50.根据本发明第一方面的一个优选实施方案，在体外受精之前是(i)在收集未受精卵母细胞之后至即刻将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前之间的任何时间，和(ii)优选在卵母细胞被精子受精之后至即刻将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之前之间的任何时间。
51.如上所述，ivf程序包括(i)从雌性供体的卵巢收集成熟未受精卵母细胞，(ii)用
精子使成熟未受精卵母细胞受精以获得受精卵母细胞，(iii)任选受精卵母细胞发育为植入前胚胎的体外植入前发育，和(iv)将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到雌性子宫。
52.根据上述优选实施方案，体外受精之前可以是处于阶段(ii)或(iii)，优选处于阶段(iii)。
53.根据本发明第一方面的进一步优选的实施方案，体外受精后是(i)在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫之后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后6天之间的任何时间，(ii)优选是在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后4天之间的任何时间，并且(iii)最优选是在将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后即刻至将受精卵母细胞或植入前胚胎移植到子宫后2天之间的任何时间。
54.关于这个优选实施方案，值得注意的是，移植受精卵母细胞或植入前胚胎可以在卵母细胞受精后即刻至卵母细胞受精后最多6天的任何时间在人体内进行。这是因为受精后，囊胚在第六天孵化并准备好植入。如果囊胚在子宫外孵化，则就不能再植入子宫。
55.本发明在第二方面涉及在雌性体外受精期间增加受精卵母细胞或植入前胚胎被植入的可能性的离体或体外方法，包括在存在如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的条件下培养分离的卵母细胞或植入前胚胎。
56.本发明第一方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第二方面。
57.(i)至(iv)的ivf程序的ivf步骤已在上文讨论。第二方面的离体或体外方法不包括体内步骤(i)和(iv)，而是涉及离体或体外生产与在不存在如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任意组合的条件下培养的分离的卵母细胞或植入前胚胎相比具有在体外受精(当随后用于步骤(iv)时)过程中植入的可能性增加的受精卵母细胞或植入前胚胎。
58.根据本发明第二方面的优选实施方案，所述分离的卵母细胞是未受精卵母细胞或受精卵母细胞。
59.因此，所述分离的卵母细胞可以在其与精子受精之前和/或之后在存在核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合的条件下培养。
60.本发明在第三方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于预防妊娠期间流产的用途。
61.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第三方面。
62.同样，本发明涉及预防妊娠期间流产的方法，包括为妊娠雌性施用如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
63.流产是在胚胎或胎儿在子宫外可以存活之前将其排出而结束妊娠。根据第三方面的流产是在没有干预的情况下发生的，也可以称为非干预流产(miscarriage)或自然流产。15％至30％的已知妊娠止于临床上明显的非干预流产，取决于孕妇的年龄和健康状况。这些自然流产的80％发生在孕早期。
64.此外，在胚胎植入子宫后，胚胎仍可以被母体排斥。这种排斥反应可以通过hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的免疫抑制作用来预防。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合也可用于预防流产。
65.本发明在第四方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或
蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防妊娠雌性中的先兆子痫。
66.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第四方面。
67.同样，本发明涉及治疗或预防妊娠雌性先兆子痫的方法，包括为妊娠雌性施用如本发明的第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
68.先兆子痫是一种影响一些妊娠女性的病症，通常在妊娠的后半期(大约20周)或分娩后不久发生。轻度先兆子痫影响多达6％的妊娠，严重病例在约1％至2％的妊娠中发生。先兆子痫的特征在于高血压和另一个器官系统最常见的是肝脏和肾脏受损的迹象。如果不治疗，先兆子痫会导致母亲和胎儿/婴儿出现严重甚至致命的并发症。
69.目前，最有效的治疗是分娩，但是即使在分娩后，症状消失仍需要一段时间。
70.先兆子痫始于胎盘，胎盘是整个妊娠期滋养胎儿的器官。在妊娠早期，新血管发生并进化以有效地将血液输送到胎盘。滋养层是形成囊胚外层的细胞，为胚胎提供营养并发育成大部分的胎盘。多种免疫细胞和免疫效应分子在胎儿-母体交界处发现并且已经被描述为维持对半异体胎儿的免疫耐受的重要参与者。假定胎儿滋养层细胞表达hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g并通过其免疫抑制作用免受母体t细胞介导的同种异体反应性，所述母体t细胞介导的同种异体反应性与先兆子痫有关。
71.因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合也可用于治疗或预防先兆子痫。
72.根据本发明第四方面的优选实施方案，所述妊娠雌性怀有雄性胚胎或胎儿。
73.怀有雄性胚胎或胎儿的女性的先兆子痫患病率高于怀有雌性胚胎或胎儿的女性。原因可能是由于异基因y染色体的存在所致雄性胎儿的同种异体反应性更强。
74.本发明在第五方面涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂用于治疗或预防hellp综合征的用途。
75.本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第五方面。
76.同样，本发明涉及治疗或预防hellp综合征的方法，包括为有需要的妊娠雌性或分娩雌性施用如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂。
77.hellp综合征(溶血、肝酶升高和低血小板)是一种妊娠并发症，其特征在于溶血、肝酶升高和低血小板计数。其通常在妊娠的最后三个月或分娩后不久开始。hellp综合征发生在大约0.7％的妊娠中。在hellp综合征中，胎儿的细胞涌进母体机体并导致母体中移植物抗宿主反应。hellp综合征在第一次妊娠时更常见，因为母体的免疫系统尚未耐受胚胎。
78.为使母体的免疫系统能识别流动在母体机体中的胎儿细胞，可以使用如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质的抑制剂。这种抑制剂抑制母体免疫系统对胎儿细胞的免疫耐受性，因为hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-e、hla-f和/或hla-g的免疫抑制作用被所述抑制剂抑制。
79.根据本发明第五方面的优选实施方案，(i)所述核酸分子的抑制剂选自小分子、适体、sirna、shrna、mirna、核酶、反义核酸分子、基于crispr-cas9的构建体、基于crispr-cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶，和/或(ii)所述蛋白质的结合分子，优选蛋白质的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物、适体。
80.根据本发明第五方面的更优选实施方案，所述抗体模拟物优选选自affibody、
adnectin、anticalin、darpin、avimer、nanofitin、affilin、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和probody。
81.如本文所用，“小分子”优选为有机分子。有机分子涉及或属于具有碳基的化合物类别，碳原子通过碳-碳键连接在一起。有机一词的原始定义与化合物的来源有关，有机化合物是从植物或动物或微生物来源获得的那些含碳化合物，而无机化合物是从矿物来源获得的。有机化合物可以是天然的或合成的。有机分子优选为芳族分子，更优选为杂芳族分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述具有共振键环的环状(环形)平面(扁平)分子，与具有相同原子集的其它几何或连接排列相比表现出更高的稳定性。芳族分子非常稳定，不易分解而与其它物质反应。在杂芳族分子中，芳环中的至少一个原子是碳以外的原子，例如n、s或o。对于所有上述有机分子，分子量优选在200da至1500da范围内，更优选在300da至1000da范围内。
82.或者，根据本发明的“小分子”可以是无机化合物。无机化合物源于矿物来源，包括所有不含碳原子的化合物(二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐除外)。优选地，小分子的分子量小于约2000da，或小于约1000da，例如小于约500da，甚至更优选小于约da amu。小分子的大小可以通过本领域熟知的方法例如质谱法来确定。比如，可以基于靶分子的晶体结构设计小分子，其中可以在体内测定例如体内高通量筛选(hts)测定中鉴定和验证推测与生物活性相关的位点。
83.根据本发明使用的术语“抗体”包括例如多克隆或单克隆抗体。此外，术语“抗体”还包括仍保留对于靶例如hla-j的结合特异性的其衍生物或片段。抗体片段或衍生物尤其包括fab或fab’片段、fd、f(ab’)2、fv或scfv片段、单结构域vh或v-样结构域，例如vhh或v-nar-结构域，以及多聚体形式，例如微型抗体(minibody)、双特异抗体(diabody)、三特异抗体(tribody)或三重抗体(triplebody)、四特异抗体(tetrabody)或化学缀合的fab
’‑
多聚体(见例如harlow and lane"antibodies,a laboratory manual",cold spring harbor laboratory press,198；harlow and lane“using antibodies:alaboratory manual”cold spring harbor laboratory press,1999；altshuler ep,serebryanaya dv,katrukha ag.2010,biochemistry(mosc).,vol.75(13),1584；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),1126)。多聚体形式特别包括可以同时结合两种不同类型抗原的双特异性抗体。第一抗原可见于根据本发明的蛋白质上。第二抗原可以是例如在滋养层细胞或子宫的某一类型细胞上特异表达的胎盘标志物。双特异性抗体形式的非限制性实例是biclonics(双特异性、全长人igg抗体)、dart(双亲和重定向抗体)和bite(由不同抗体的两个单链可变片段(scfv)组成)分子(kontermann and brinkmann(2015),drug discovery today,20(7):838-847)。使用这种双特异性抗体可以将双特异性抗体的作用集中到例如子宫或胎盘。例如，manokhina et al.(2017),hum mol genet.；26(r2):r237-r245描述了胎盘生物标志物。
84.术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化抗体(除非人cdr外是人抗体)的实施方案。
85.用于产生抗体的各种技术在本领域中是熟知的并且描述于例如harlow and lane(1988)和(1999)及altshuler et al.,2010,loc.cit.。因此，多克隆抗体可以在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后从动物的血液中获得，单克隆抗体可以通过提供由连续细胞
系培养物产生的抗体的任何技术来产生。这种技术的实例描述于例如harlow e and lane d,cold spring harbor laboratory press,1988；harlow e and lane d,using antibodies:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory press,1999，并包括最初由and milstein,1975描述的杂交瘤技术，三瘤技术，人b细胞杂交瘤技术(见例如kozbor d,1983,immunology today,vol.4,7；li j,et al.2006,pnas,vol.103(10),3557)以及产生人单克隆抗体的ebv-杂交瘤技术(cole et al.,1985,alan r.liss,inc,77-96)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得或可以使用各种展示方法如噬菌体、核糖体、mrna或细胞展示方法从头制备。用于表达重组(人源化)抗体的合适系统可以选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(见例如美国专利6,080,560；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),11265)。此外，描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可以适用于产生特异于例如hla-j的表位的单链抗体。biacore系统中采用的表面等离子共振可用于提高噬菌体抗体的效率。
86.如本文所用，术语“抗体模拟物”是指与抗体一样可以特异性结合抗原如hla-j蛋白但在结构上与抗体不相关的化合物。抗体模拟物通常是摩尔质量约为3至20kda的人工肽或蛋白质。例如，抗体模拟物可以选自affibody、adnectin、anticalin、darpin、avimer、nanofitin、affilin、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和prododies。这些多肽在本领域中是熟知的并且在下文中更详细地描述。
87.如本文所用，术语“affibody”是指衍生自葡萄球菌蛋白a的z结构域的抗体模拟物家族。在结构上，affibody分子基于也可以掺入融合蛋白质中的三螺旋束结构域。affibody本身的分子量约为6kda，在高温和酸性或碱性条件下是稳定的。通过随机化位于参与亲本蛋白质结构域的结合活性的两个α-螺旋中的13个氨基酸而获得靶特异性(feldwisch j,tolmachev v.；(2012)methods mol biol.899:103-26)。
88.如本文所用，术语“adnectin”(也称为“单体(monobody)”)涉及基于人纤连蛋白iii的第10个胞外结构域(10fn3)的分子，其采用94个残基的ig样β-夹心折叠，具有2至3个暴露的环，但缺少中心二硫键(gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255)。具有所需靶特异性例如针对hla-j的adnectin可以通过在蛋白质的特定环中引入修饰来遗传工程化。
89.如本文所用，术语“anticalin”是指衍生自脂质运载蛋白的工程化蛋白质(beste g,schmidt fs,stibora t,skerra a.(1999)proc natl acad sci u s a.96(5):1898-903；gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255)。anticalin具有八链β-桶，其在脂质运载蛋白中形成高度保守的核心单元并通过在开放端的四个结构可变环自然形成配体的结合位点。anticalin虽然与igg超家族不同源，但显示出迄今为止被认为是抗体结合位点的典型特征：(i)由于序列变异而导致的高结构可塑性和(ii)提高的构象灵活性，允许诱导以适应不同形状的靶。
90.如本文所用，术语“darpin”是指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供通常由三个重复的β-转角产生的刚性界面。darpin通常携带对应于人工共有序列的三个重复，其中每个重复的六个位置是随机化的。因此，darpin缺乏结构灵活性(gebauer and skerra,2009)。
91.如本文所用，术语“avimer”是指一类抗体模拟物，其由两个或更多个肽序列组成，
每个肽序列具有30至35个氨基酸，其衍生自各种膜受体的a结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过a结构域发生并可以通过例如噬菌体展示技术来选择对于例如hla-j具有所需结合特异性的结构域。avimer中包含的不同a结构域的结合特异性可以但非必须相同(weidle uh,et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0092]“nanofitin”(也称为affitin)是一种抗体模拟蛋白，来源于嗜酸嗜热硫化叶杆菌(sulfolobus acidocaldarius)的dna结合蛋白sac7d。nanofitin通常具有约7kda的分子量并通过随机化结合表面上的氨基酸而特异性结合靶分子，例如hla-j(mouratou b,b
é
har g,paillard-laurance l,colinet s,pecorari f.,(2012)methods mol biol.；805:315-31)。
[0093]
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-b结晶或泛素作为支架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。例如通过噬菌体展示或核糖体展示技术选择具有如针对hla-j具有所需靶特异性的affilin。根据支架的不同，affilin的分子量约为10或20kda。如本文所用，术语affilin还指affilin的二聚或多聚形式(weidle uh,et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0094]“kunitz结构域肽”衍生自kunitz型蛋白酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂(bpti)、淀粉样前体蛋白(app)或组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域。kunitz结构域具有约6kda的分子量，可以通过展示技术例如噬菌体展示选择例如对于hla-j具有所需靶特异性的结构域(weidle et al.,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0095]
如本文所用，术语是指源自人fyn sh3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。fyn sh3衍生的多肽在本领域中是熟知的并且已经在如grabulovski et al.(2007)jbc,282,p.3196-3204；wo 2008/022759；bertschinger et al(2007)protein eng des sel 20(2):57-68；gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255或schlatter et al.(2012),mabs 4:4,1-12)中描述。
[0096]
如本文所用，术语“三特异性结合分子”是指具有三个结合结构域并因此能结合、优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中至少一个是本发明第四方面的蛋白质的表位。两个其它表位也可以是本发明第四方面的蛋白质的表位或可以是一种或两种不同抗原的表位。三特异性结合分子优选是tritac。tritac是实体瘤的t细胞衔接器，由三个结合域组成，被设计为具有延长的血清半衰期，大小约为单克隆抗体的三分之一。
[0097]
适体是结合特异靶分子的核酸分子或肽分子。适体通常是通过从大型随机序列库中选择而产生的，但天然适体也存在于核糖开关(riboswitches)中。适体可作为大分子药物用于基础研究和临床目的。适体可以与核酶组合以在其靶分子存在的情况下进行自切割。这些化合物分子具有额外的研究、工业和临床应用(osborne et.al.(1997),current opinion in chemical biology,1:5-9；stull&szoka(1995),pharmaceutical research,12,4:465-483)。
[0098]
核酸适体是通常由(通常是短的)寡核苷酸链组成的核酸种类。通常，其已经通过重复多轮的体外选择或等效的selex(配体通过指数富集的系统进化)工程化以结合各种分子靶如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体。
[0099]
肽适体通常是设计用于干扰细胞内其它蛋白质相互作用的肽或蛋白质。它们由两端连接到蛋白质支架上的可变肽环组成。这种双重结构限制极大地增加了肽适体的结合亲
和力至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变肽环通常包含10至20个氨基酸，并且支架可以是任何具有良好溶解性的蛋白质。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-a是最常用的支架蛋白，可变肽环插入野生型蛋白质中的氧化还原活性位点，其为-cys-gly-pro-cys-环(seq id no:36)，两条半胱氨酸侧链能形成二硫键。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
[0100]
适体为生物技术和治疗应用提供了实用性，因其提供的分子识别特性可与常用的生物分子、特别是抗体相媲美。除了它们的区别性识别之外，适体还提供优于抗体的优势，因为它们可以在试管中完全工程化，易于通过化学合成产生，具有理想的储存特性，并且在治疗应用中引起很少或没有免疫原性。未修饰的适体从血流中被迅速清除，半衰期为几分钟到几小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除所致，这是适体固有的低分子量的结果。未经修饰的适体应用目前专注于治疗短暂的病症，例如血液凝固，或治疗可以局部递送的器官如眼睛。这种快速清除在例如体内诊断成像等应用中可以是一个优势。科学家可以使用多种修饰例如2
’‑
氟取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)键、融合于白蛋白或其它延长半衰期的蛋白质等，从而使适体的半衰期可以延长几天或甚至几周。
[0101]
如本文所用，术语“probody”是指蛋白酶可激活的前药，例如蛋白酶激活的抗体前药。例如，probody由原本的igg重链和修饰的轻链组成。掩蔽肽通过被肿瘤特异性蛋白酶切割的肽接头与轻链融合。掩蔽肽防止probody与健康组织结合，从而最小化毒副作用。此外，还可以通过probody将小分子、抗体或抗体模拟物和适体的结合和/或抑制活性限制于某些组织或细胞类型，特别是患病组织或细胞类型。在这样的probody中，小分子、抗体或抗体模拟物或适体也与限制或阻止与本发明蛋白质结合的掩蔽肽结合，并且该掩蔽肽可以被蛋白酶切割。蛋白酶是通过切割称为底物的特定氨基酸序列将蛋白质消化成更小片段的酶。在正常健康组织中，蛋白酶活性受到严格控制。在癌细胞中，蛋白酶活性上调。在蛋白酶活性受到调节且最小化的健康组织或细胞中，probody的靶结合区域保持被掩盖，因此无法结合。另一方面，在蛋白酶活性上调的患病组织或细胞中，probody的靶结合区域被暴露，因此能结合和/或抑制。
[0102]
根据本发明，术语“小干扰rna(sirna)”，也称为短干扰rna或沉默rna，是指长度为18至30个、优选19至25个、最优选21至23个或甚至更优选21个核苷酸的双链rna分子，其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，sirna参与rna干扰(rnai)途径，其中sirna干扰特定基因的表达。除了它们在rnai途径中的作用外，sirna还作用于rnai相关途径，例如作为抗病毒机制或塑造基因组的染色质结构。
[0103]
天然存在于自然界中的sirna具有明确定义的结构：短双链rna(dsrna)，在任一端均具有2-nt的3’突出端。每条链都有一个5’磷酸基团和一个3’羟基(-oh)基团。这种结构是dicer加工的结果，dicer是一种将长dsrna或小发夹rna转化为sirna的酶。sirna也可以外源(人工)引入细胞中，以实现感兴趣基因的特异性敲低。因此，基本上任何已知序列的基因可以基于与适当定制的sirna的序列互补性而被靶向。双链rna分子或其代谢加工产物能介导靶特异性核酸修饰，特别是rna干扰和/或dna甲基化。外源引入的sirna在其3’和5’末端可以没有突出端，然而，优选至少一条rna链具有5
’‑
和/或3
’‑
突出端。优选地，双链的一端具有1至5个核苷酸、更优选1至3个核苷酸、最优选2个核苷酸的3
’‑
突出端。另一端可以是平端或具有至多6个核苷酸的3
’‑
突出端。通常，本发明展望了任何适合充当sirna的rna分子。
迄今为止，最有效的沉默是使用由21-nt有义链和21-nt反义链组成的sirna双链体获得的，这两条链以具有2-nt的3
’‑
突出端的方式配对。2-nt的3’突出端的序列对限制于与第一个碱基对相邻的未配对核苷酸的靶识别特异性有小贡献(elbashir et al.2001)。3’突出端中的2
’‑
脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成成本更低并且可以更耐核酸酶。sirna的递送可以使用本领域已知的任何方法来完成，例如通过将sirna与盐水组合并通过静脉内或鼻内施用该组合或通过在葡萄糖(例如5％葡萄糖)或阳离子脂质中配制sirna，并且聚合物可用于通过静脉内(iv)或腹膜内(ip)的全身途径在体内递送sirna(fougerolles et al.(2008),current opinion in pharmacology,8:280-285；lu et al.(2008),methods in molecular biology,vol.437:drug delivery systems
–
chapter 3:delivering small interfering rna for novel therapeutics)。
[0104]
短发夹rna(shrna)是一种产生紧密发夹转角的rna序列，可用于通过rna干扰来沉默基因表达。shrna使用引入细胞的载体并利用u6启动子来确保shrna始终被表达。该载体通常被传递给子代细胞，从而使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构被细胞机制切割成sirna，其然后与rna诱导的沉默复合物(risc)结合。这个复合物结合并切割与之结合的匹配所述sirna的mrna。用于本发明的si/shrna优选是使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪化学合成的。rna合成试剂供应商是proligo(hamburg,germany)，dharmacon research(lafayette,co,usa)，pierce chemical(part of perbio science,rockford,il,usa)，glen research(sterling,va,usa)，chemgenes(ashland,ma,usa)和cruachem(glasgow,uk)。最方便地，sirna或shrna得自商用rna寡核苷酸合成供应商，这些供应商销售不同质量和成本的rna合成产品。通常，可用于本发明的rna是常规合成的并且容易以适合rnai的质量提供。
[0105]
实现rnai的其它分子包括例如microrna(mirna)。所述rna种类是单链rna分子。内源性存在的mirna分子通过与互补mrna转录物结合并通过类似于rna干扰的过程触发所述mrna转录物的降解来调节基因表达。因此，外源mirna可以在引入相应细胞后用作抑制剂(例如hla-j的抑制剂)。
[0106]
核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化rna)是催化化学反应的rna分子。许多天然核酶催化其自身切割或其它rna的切割，但也发现其催化核糖体的氨基转移酶活性。已充分表征的小自切割rna的非限制性例子是锤头核酶、发夹核酶、丁型肝炎病毒核酶和体外选择的铅依赖性核酶，而i组内含子是较大核酶的一个实例。近年来，催化自裂解的原理已得到很好确立。在具有核酶活性的rna分子中，锤头核酶被最佳表征。由于示出锤头结构可以整合到异源rna序列中，因此核酶活性可以转移到这些分子上，似乎可以产生几乎任何靶序列的催化反义序列，只要靶序列含有潜在的匹配切割位点即可。构建锤头核酶的基本原理如下：选择包含guc(或cuc)三联体的rna的感兴趣区域。取两条寡核苷酸链，每条通常有6至8个核苷酸，并在它们之间插入催化性锤头序列。最好的结果通常是用短核酶和靶序列获得的。
[0107]
根据本发明也可使用的一项最近的进展是识别小化合物的适体与锤头核酶的组合。适体与靶分子结合后诱导的构象变化可以调节核酶的催化功能。
[0108]
如本文所用，术语“反义核酸分子”是指与靶核酸互补的核酸。根据本发明的反义分子能与靶核酸相互作用，更具体地其能与靶核酸杂交。由于杂合体的形成，靶基因的转录
和/或靶mrna的翻译被减少或阻断。已经描述了与反义技术相关的标准方法(见例如melani et al.,cancer res.(1991)51:2897-2901)。
[0109]
crispr/cas9以及crispr-cpf1技术几乎适用于所有细胞/模型生物并可用于敲除突变、染色体缺失、dna序列编辑和基因表达调节。基因表达的调节可以通过使用与转录阻抑物缀合的催化性死亡cas9酶(dcas9)来操控以阻抑特定基因的转录，在此，例如hla-j基因。类似地，催化性失活的“死亡”cpf1核酸酶(来自prevotella和francisella-1的crispr)可以与合成的转录阻抑物或激活物融合以下调内源性启动子，例如，控制如hla-j表达的启动子。或者，锌指核酸酶(zfn)或转录激活因子样效应子核酸酶(talen)的dna结合结构域可以设计为特异性识别靶(例如hla-j)基因或其启动子区域或其5
’‑
utr，从而抑制靶的表达。
[0110]
本文还设想了作为靶向感兴趣基因或参与其表达的调节分子的抑制性核酸分子而提供的抑制剂。减少或消除靶基因或调节分子的表达的这种分子包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶。这种方法在silva et al.,curr gene ther.2011；11(1):11-27；miller et al.,nature biotechnology.2011；29(2):143-148和klug,annual review of biochemistry.2010；79:213-231中描述。
[0111]
本发明在第六方面涉及如在第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防自身免疫性疾病、优选用于妊娠雌性中的自身免疫性疾病的用途，其中所述自身免疫性疾病优选为皮肌炎、桥本甲状腺炎、干燥综合征或硬皮病。
[0112]
本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第六方面。
[0113]
类似地，本发明涉及一种治疗自身免疫性疾病的方法，包括将第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合施用于待治疗的受试者，优选是妊娠雌性。
[0114]
自身免疫性疾病是受试者自身的免疫系统攻击受试者机体的病症。hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g的免疫抑制作用预期预防或治疗受试者机体不希望的免疫反应。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合是用于治疗自身免疫性疾病的手段。
[0115]
自身免疫性疾病优选选自皮肌炎、桥本甲状腺炎、干燥综合征和硬皮病，注意这些自身免疫性疾病在妊娠女性中的患病率高于非妊娠女性。
[0116]
本发明在第七方面涉及如在第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合用于治疗或预防移植物抗宿主病的用途。
[0117]
本发明上述方面的定义和优选实施方案比照适用于本发明的第七方面。
[0118]
本发明还涉及治疗或预防移植物抗宿主病的方法，包括为受试者施用如第一方面所定义的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合。
[0119]
移植物抗宿主病(gvhd)是一种免疫病症，当在移植后供体组织(移植物)中存在的免疫细胞攻击宿主自身组织时在患者中发生。gvhd是来自相关和不相关供体的骨髓移植(干细胞移植)后的并发症。这些类型的移植物被称为同种异体移植物。对于急性gvhd和慢性gvhd，症状可以从轻微到严重，甚至危及生命，并且通常包括皮肤炎症、黄疸和胃肠道(gi)不适以及其它器官问题。急性gvhd通常发生在移植后的前100天内；该疾病的急性形式会导致皮疹、肝脏问题以及恶心和腹泻等肠道症状的临床症状。慢性gvhd发生较晚；该疾病
的慢性形式可以影响许多不同器官和机体系统。gvhd具有复杂的病理生理学，涉及移植供体和受体患者的免疫细胞之间的许多相互作用。
[0120]
hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g的免疫抑制作用有望预防或治疗gvhd。因此，根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其任何组合是用于治疗gvhd的手段。
[0121]
最后，根据本发明所有前述方面的优选实施方案，(i)所述至少一种核酸分子选自以下核酸分子：(a)编码包含seq id no:1-6任一氨基酸序列或由seq id no:1-6任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)包含seq id no:18-23任一核苷酸序列或由seq id no:18-23任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列具有至少85％相同性、优选至少90％相同性、最优选至少95％相同性的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列具有至少95％相同性、优选至少96％相同性、最优选至少98％相同性的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并序列的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸，及(g)对应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中t被u置换；以及(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；及(iv)所述至少一种蛋白质或肽选自由(i)的核酸分子编码的蛋白质或肽。
[0122]
关于本发明的第五方面，其涉及如本发明第一方面所定义的核酸分子或蛋白质或肽的抑制剂治疗hellp综合征，应当理解这个抑制剂优选是上述优选实施方案(i)中定义的核酸分子或(iv)中定义的蛋白质或肽的抑制剂。
[0123]
seq id no:1-6是hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v和hla-y的氨基酸序列，seq id no:18-23是编码hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v和hla-y的核苷酸序列。如上所述，本技术以及申请人在此引用的先前申请的贡献是：hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、hla-v、hla-y之前被错误地描述为假基因，但实际上是蛋白质编码基因。出于上述原因，hla-h、hla-j、可溶hla-l、膜结合hla-l、、hla-v、hla-y或其抑制剂可用于本文所公开的各种医学治疗以及本发明第二方面的方法。对于hla-l，与膜结合形式相比，优选可溶形式。
[0124]
结合上述优选实施方案，优选另外使用hla-g、hla-e和/或hla-f或其抑制剂，这取决于医学用途是否需要促进或抑制这些hla的免疫耐受原性作用。
[0125]
关于在本说明书中特别是在权利要求中表征的实施方案，旨在将在从属权利要求中提及的每个实施方案均与所述从属权利要求所从属的每个(独立或从属)权利要求的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1列举3个选项a、b和c的情况下，从属权利要求2列举3个选项d、e和f以及权利要求3从属于权利要求1和2并列举3个选项g、h和i的情况下，应当理解，本说明书明确地公开了对应于以下组合的实施方案：a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有特别说明。
[0126]
类似地，并且在独立权利要求和/或从属权利要求没有列举选项的那些情况下，应当理解如果从属权利要求回引多个在前的权利要求，则认为明确公开了由此涵盖的主题的
任何组合。例如，在独立权利要求1、回引权利要求1的从属权利要求2和回引权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，权利要求3和1的主题组合与权利要求3、2和1的主题组合一样清楚且明确地公开。在存在引用权利要求1至3任一项的进一步从属权利要求4的情况中，则权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚且明确地公开。
[0127]
实施例示例说明了本发明。
[0128]
实施例1：在胚细胞培养基中补充hla ib和iw类基因
[0129]
这个实施例涉及通过用合成的hla ib和iw类分子补充胚细胞培养物或通过全身性应用其来支持体外受精胚胎植入的程序。
[0130]
将hla-g、hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e和/或hla-f加入胚胎细胞培养物中。根据et al.(c1,wikland m,robertson sa.,hum reprod.1999dec；14(12):3069-76)和bhatnagar et al.(bhatnagar p1,papaioannou ve,biggers jd,development.1995may；121(5):1333-9)评估加入细胞培养物中的hla蛋白的剂量。根据现有技术水平和favier et al(favier et al.,plos one.2011；6(7):e21011)产生重组hla-g或hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f蛋白。
[0131]
对于静脉内应用，在cgmp条件下产生重组hla-g、hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e和/或hla-f蛋白。根据欧洲药典v.8.0(european pharmacopoeia(ph.eur.)vol 8(2013
–
2016)european directorate of quality of medicines)的专论对质量、无菌性、内毒素检测以及化学纯度进行检测。
[0132]
为比较hla补充对植入率和妊娠率的影响，还监测了未接受hla蛋白补充的对照组。
[0133]
根据美国生殖医学学会的指南(fertil steril,2017；107:882-96)，在第5天移植胚胎。通过测量游离β-人绒毛膜促性腺激素(β-hcg)的血清水平和阴道超声观察来监测成功的植入。
[0134]
可以观察到，与对照组相比，接受hla补充治疗的胚胎的植入率和成功妊娠率显著更高。
[0135]
实施例2：在胚细胞培养基中hla ib和iw类基因的提取和确定
[0136]
为通过定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)评估胚细胞培养基中hla ib和iw类表达，首先提取rna。由于胚细胞在细胞外囊泡(ev)中脱落rna(giacomini et al.,sci rep.2017；7:5210)，根据et al.(et al.,hum immunol.2016sep；77(9):791-9)的方案首先在exoquick
tm
(sbi systems bioscience inc.mountain view ca,usa)中收集ev来分离rna。去除exoquick
tm
试剂后，根据stratifyer血液提取试剂盒的方案提取rna。简而言之，在蛋白酶k消化后，在存在促进核酸结合的特殊缓冲液下将裂解物与涂有锗的磁性颗粒混合。通过混合、磁化、离心和去除污染物的连续循环进行纯化。用25μl洗脱缓冲液洗脱rna，然后将rna洗脱液储存在-80℃直至使用。通过使用qrt-pcr对已知为稳定参考/管家基因的组成型表达基因calmodulin 2基因(calm2)进行定量，测试所有提取物的足够高质量rna含量。为通过qrt-pcr方法详细分析基因表达，使用了位于感兴趣区域两侧的引物和在其间杂交的荧光标记探针。使用rna特异性引物/探针序列以通过定位跨外显子/外显子边界的引物/探针序列来实现rna特异性测量。如果存在同一基因的多个同种型，则选择
引物以酌情扩增所有相关或选择的剪接变体。通过常规pcr反应检查所有引物对的特异性。已针对hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g生成了特异性引物。
[0137]
发现hla-h、hla-j、hla-l、hla-v、hla-v、hla-y、hla-e、hla-f和hla-g在胚细胞培养物中表达。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
