一种复合固定化菌剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及环境微生物修复技术领域，尤其涉及一种复合固定化菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着经济高速发展，城市化和工业化进程不断加快，城市和工业区附近的土壤污染日益加剧，并且，土壤中多种污染物共存，发生相互作用而形成的复合污染现象近年来尤为严重，复合污染土壤的修复成为环境科学领域的一个重要研究方向。
3.复合污染通常是指两种或两种以上不同种类和性质的污染物在同一环境中同时存在所形成的污染。其中，重金属和多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是环境中两类典型的污染物，都具有“三致效应”，即致癌、致畸、致突变，两种污染物严重破坏土壤生态环境，且威胁着人体健康。重金属和pahs往往同时或先后进入环境中，造成土壤复合污染，如木材防腐剂厂使用的杂酚油和防腐剂中含有大量的重金属和pahs，在环境中通常可同时被检测到；燃气加工厂和木材存放厂附近的pahs污染点通常也会伴随有高浓度重金属的污染。重金属和pahs以气体、液体或者固体的形式分布于环境中，具有难挥发和水溶性差的特点，吸附在大气和水体中的悬浮物上，进而随悬浮物沉降进入土壤，这使得土壤成为重金属和pahs的主要富集场所。当土壤环境中同时存在重金属与pahs时，两者之间通常会发生物理吸附过程、化学过程以及生物过程上的交互作用，与单一重金属污染或pahs污染所造成的影响相比，这种交互作用使重金属和pahs生态毒性效应变得更为复杂。而现有研究大部分针对的是土壤中重金属或pahs单一类别的污染，对重金属和pahs两种污染物同时存在的复合污染治理的研究仍然较少。
4.微生物修复技术由于其操作方便、成本低、不造成二次污染等优点，逐渐成为土壤污染修复中最为常用的技术，而为了提高微生物的存活率，固定化微生物技术则越来越受到关注。固定化微生物技术修复土壤污染，主要依靠两方面来实现，即菌剂和载体，因此，选择合适的菌剂和载体以提高土壤修复率，成为固定化微生物技术中亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种复合固定化菌剂及其制备方法和应用，其通过选择合适的菌剂和载体，提高了对复合污染土壤的修复效果。
7.(二)技术方案
8.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
9.第一方面，本发明提供一种复合固定化菌剂，包括复合微生物菌剂和复合固定化载体，其中，复合微生物菌剂包括毛霉菌mucor sp.fmm菌剂、黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌剂和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌剂；并且，复合固定化载体包括生物炭和硼泥。
10.优选的，复合微生物菌剂中，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1-2:1-2:1-2混合；
11.并且，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液浓度为1.0-1.2g/l，黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液浓度为0.2-0.3g/l，分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液od600值为0.8-1.2。
12.优选的，复合微生物菌剂中，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1:2:1混合。
13.优选的，生物炭和硼泥的质量比为1:1。
14.优选的，毛霉菌mucor sp.fmm、黑曲霉菌aspergillus niger sf05和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg的菌株来源于：
15.毛霉菌株mucor sp.fmm于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011092，保藏地址为武汉大学；
16.黑曲霉菌株aspergillus niger sf05于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011091，保藏地址为武汉大学；
17.分枝杆菌菌株mycobacterium sp.bfzg于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011083，保藏地址为武汉大学。
18.第二方面，本发明提供一种复合固定化菌剂制备方法，包括以下步骤：
19.s1、制备复合微生物菌液：制备含有毛霉菌mucor sp.fmm、黑曲霉菌aspergillus niger sf05和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg的悬浮液的复合微生物菌液；
20.s2、制备复合固定化载体：将生物炭和硼泥均匀混合，得到复合材料，将所述复合材料在在无氧条件下焙烧，冷却，得到复合固定化载体；
21.s3、制备复合固定化菌剂：将步骤s2得到的所述复合固定化载体加入混合培养基中，经高温灭菌，冷却后，加入步骤s1得到的所述复合微生物菌液，震荡培养40小时以上，于无菌条件下，过筛冲洗后得到所述复合固定化菌剂。
22.优选的，在步骤s1中，复合微生物菌液由毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1-2:1-2:1-2混合得到；
23.更为优选的，在步骤s1中，复合微生物菌液由毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1:2:1混合得到；
24.其中，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液浓度为1.0-1.2g/l，黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液浓度为0.2-0.3g/l，分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液od600值为0.8-1.2。
25.优选的，在步骤s2中，生物炭和硼泥以质量比1:1混合。
26.优选的，复合微生物菌剂重量占总重量的1％(m/m)。
27.优选的，在步骤s3中，混合培养基为lb培养基和pda培养基，体积比为1:2；高温灭菌温度为121℃，灭菌时间为30分钟；培养温度为30℃，培养时间48小时，转速为80r/min。
28.第三方面，本发明提供了上述复合固定化菌剂在修复镉-多环芳烃复合污染土壤中的应用。
29.在上述应用中，优选的，镉-多环芳烃复合污染土壤是镉-菲、芘复合污染土壤。
30.(三)有益效果
31.本发明所采用的毛霉菌、黑曲霉菌和分枝杆菌菌株对于土壤中的pahs均具有较好的降解作用，三种菌对pahs中不同烃类的碳利用具有不同偏好，且三种菌株生命周期不同，处于不同生命周期阶段的菌株降解活性不同，因此本发明将三种菌剂复配使用起到协同增效的作用。此外，三种菌剂组合，会竞争利用pahs中碳源，致使三种菌剂同时对pahs竞争降解，因此，三种菌剂组合进一步提高了pahs降解率。
32.进一步的，本发明选用的毛霉菌mucor sp.fmm菌剂、黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌剂和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌剂，均为经过含pahs污染物的富集培养基的环境压力下培养得到，再以pahs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选、分离、纯化获得。因此对污染土壤中的pahs污染物具有极高的降解率，对于菲、芘降解率分别为均在95％以上，并且降解性能稳定，降解底物范围较广，十分适用于pahs污染土壤的修复，尤其适用于菲和芘污染土壤的修复。
33.本发明进一步优化了三种菌剂的配合比例，按照最优比例混合后，更能够充分发挥各自的降解作用，相辅相成，提高了镉-多环芳烃复合土壤的修复率。
34.另一方面，本发明更是创新的采用生物炭和硼泥混合制备复合固定化载体，生物炭可以以农作物秸秆或椰子壳等为原料，不仅原料廉价易得，能够达到废物资源化的目的，而且，生物炭具有多孔性、高比表面积、较强表面吸附、高度化学惰性以及对污染物具有高度亲和性的优点，对镉等重金属离子具有极好的钝化效果。同时，将生物炭和硼泥以1：1的质量比混合制得的复合固定化载体，明显提高了镉-多环芳烃复合土壤的修复率。
附图说明
35.图1为1％的固定化菌剂对土壤中镉的钝化效果；
36.图2为5％的固定化菌剂对土壤中镉的钝化效果；
37.图3为1％的固定化菌剂对土壤中菲的降解效果；
38.图4为5％的固定化菌剂对土壤中菲的降解效果；
39.图5为1％的固定化菌剂对土壤中芘的降解效果；
40.图6为5％的固定化菌剂对土壤中芘的降解效果。
具体实施方式
41.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
42.本发明实施例提出的一种复合固定化菌剂，包括复合微生物菌剂和复合固定化载体，其中，复合微生物菌剂包括毛霉菌mucor sp.fmm菌剂、黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌剂和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌剂；并且，复合固定化载体包括生物炭和硼泥。
43.本发明中的毛霉菌株mucor sp.fmm、黑曲霉菌株aspergillus niger sf05和分枝杆菌菌株mycobacterium sp.bfzg均是经过含pahs污染物的富集培养基的富集培养，再以pahs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选、分离、纯化获得。因此对污染土壤
中的pahs污染物具有极高的降解率，对于菲、芘降解率分别为均在95％以上，并且，降解性能稳定，降解底物范围较广，十分适用于pahs污染土壤的修复，尤其适用于菲和芘污染土壤的修复。
44.毛霉菌株mucor sp.fmm于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011092，保藏地址为武汉大学。
45.黑曲霉菌株aspergillus niger sf05于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011091，保藏地址为武汉大学。
46.分枝杆菌菌株mycobacterium sp.bfzg于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2011083，保藏地址为武汉大学。
47.进一步地，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1-2:2:1-2混合。
48.更进一步地，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1:2:1混合。
49.本发明的复合固定化载体包括生物炭和硼泥，其中生物炭是一种新型环境功能材料，生物炭是由生物残体在缺氧的情况下经高温慢热解(通常《700℃)产生的一类难溶的、稳定的、高度芳香化的、富含碳素的固态物质，具有孔隙结构发达、呈碱性、比表面积大，表面含有大量的官能团和负电荷，对重金属离子有较强的吸附作用，可作为良好的吸附材料，生物炭来源广泛，主要有农林业废弃物如木材、秸秆、果壳等等，不同原料制备的生物炭对重金属吸附能力不同，研究表明小麦秸秆为原料制备的生物炭对重金属吸附能力较为突出。并且，其中硼泥是一种化工厂用硼矿制取硼砂、硼酸过程中产生的废弃物，主要含有氧化硼、氧化镁等，由于其不含有害物质，因而常用作吸附剂处理废水，也可用于改良土壤。
50.本发明使用植物秸秆和硼泥为农业废弃物和工业废弃物，不仅达到了废物资源化的目的，而且，生物炭和硼泥复合作为复合载体制备的固定化菌剂对比单一生物炭或硼泥作为载体制备的固定化菌剂，其对重金属镉的钝化率以及对多环芳烃尤其是对菲和芘的降解率都有明显提高。
51.进一步地，生物炭和硼泥的质量比为1:1。
52.本发明还提供了一种制备该复合固定化菌剂的方法，方法包括：
53.s1、制备复合微生物菌液：制备含有毛霉菌mucor sp.fmm、黑曲霉菌aspergillus niger sf05和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg的悬浮液的复合微生物菌液。
54.具体的，将毛霉菌mucor sp.fmm、黑曲霉菌aspergillus niger sf05、分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg分别进行纯培养，收集纯培养得到的三种菌体，并分别进行重悬，将重悬后的毛霉菌mucor sp.fmm菌悬液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌悬液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌悬液以体积比1-2:1-2:1-2均匀混合，得到复合微生物菌剂。
55.其中，毛霉菌mucor sp.fmm菌落接种到pda液体培养基中，分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌落接种到lb液体培养基中，并在30℃、120r/min条件下培养24小时，分别得到毛霉菌mucor sp.fmm种子液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg种子液。黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌落接种到pda固体培养基中，并在30℃、120r/min条件下培养48小时，得到黑色孢子，即黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌体。将毛霉mucor sp.fmm
种子液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg种子液分别于7500r/min下离心3min收集菌体，然后将收集得到的毛霉菌mucor sp.fmm菌体、黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌体、分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg菌体分别用pbs缓冲液重悬两次，得到毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液。
56.进一步的，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液浓度为1.0-1.2g/l，黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液浓度为0.2-0.3g/l，分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液od600值为0.8-1.2。然后将毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液以体积比1-2:1-2:1-2均匀混合，即得到复合微生物菌剂。优选地，毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液体积比为1:2:1。
57.s2、制备复合固定化载体：将生物炭和硼泥均匀混合，得到复合材料，将所述复合材料在在无氧条件下焙烧，冷却，得到复合固定化载体。
58.其中，生物炭可以以小麦秸秆为原料制得，也可以以玉米秸秆、松针或椰子壳等为原料，优选以小麦秸秆为原料制备生物炭。将小麦秸秆磨碎后，500℃条件下烧结4小时，得到小麦秸秆生物炭。将生物炭与硼泥混合均匀，然后将混合材料置于马弗炉中，于500℃条件下烧结4小时，冷却后得到固定化载体。
59.s3、制备复合固定化菌剂：将步骤s2得到的复合固定化载体加入混合培养基中，经高温灭菌，冷却后，加入步骤s1得到的复合微生物菌液，震荡培养40小时以上，于无菌条件下，过筛冲洗后得到所述复合固定化菌剂。
60.其中，混合培养基为lb液体培养基和pd液体培养基以体积比1:2进行混合得到，进一步的，将复合固定化载体加入到混合培养基后，可以进行两次高温灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。待冷却后，将复合微生物菌剂加入其中，优选的，复合微生物菌剂重量占总重量的1％(m/m)。混合均匀后，置于摇床，在30℃、80r/min条件下振荡培养48小时，然后在无菌条件下将培养后的混合物过筛，进一步的，筛网孔径为75μm。过筛后用无菌水冲洗，得到复合固定化菌剂。进一步的，可以用去离子水冲洗三次。
61.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。本领域的普通技术人员可以理解，以下实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的保护以后附的权利要求书所记载的为准。
62.以下实施例中所用的菌株均均是公众可以获得，例如中国科学院沈阳应用生态研究所或中国典型培养物保藏中心；以下实施例中所涉及到的土壤来源于中国科学院沈阳应用生态研究所生态站；以下实施例中涉及到的培养基组成为：
63.细菌培养基(lb培养基)：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph 7.2
±
0.2；
64.真菌培养基(pda培养基)：马铃薯去皮后洗净，称取200g切成小块，加1l水煮沸20min，滤去土豆块，冷却后加入20g葡萄糖，用水定容至1l，ph值为自然。
65.实施例1
66.本实施例提供一种用于修复镉-多环芳烃复合污染土壤的固定化菌剂的制备方法，包括如下步骤：
67.(1)复合微生物菌液的制备
68.a、毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液的制备
69.用接种环从斜面培养基中挑取3块毛霉菌mucor sp.fmm菌落到pda固体培养基中培养。待48h平板长出合适大小的菌落以后，挑取一个菌落接种到pda液体培养液中，于120r/min、30℃条件下，摇床培养24h，作为种子液，将种子液于7500r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用pbs缓冲液重悬两次，调节菌液浓度为1.0g/l。
70.b、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液的制备
71.用接种环从斜面培养基中挑取3块黑曲霉菌aspergillus niger sf05菌落到pda固体培养基中培养。于120r/min、30℃条件下培养48h后，待平板长出合适大小的菌落，收集黑色孢子，将收集得到的孢子用pbs缓冲液重悬两次，调节孢子浓度为0.3g/l。
72.c、分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液的制备
73.用接种环从斜面培养基中挑取一环分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg到lb固体培养基进行划线分离培养。48h后平板长出合适大小的菌落，挑取一个菌落接种到lb培养液中，于120r/min、30℃摇床培养24h，作为种子液，将种子液在7500r/min下离心3min，收集菌体，将收集得到的菌体用pbs缓冲液重悬两次，调节菌液的od600值到0.8。
74.d、将毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比1:2:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌液。
75.(2)复合固定化载体的制备
76.将小麦秸秆磨碎，在500℃条件下烧结4小时，冷却后得到生物炭，将生物炭与硼泥按重量比1:1混合均匀，混合后将混合材料置于马弗炉中，于500℃条件下烧结4小时，冷却后得到复合固定化载体。
77.(3)复合固定化菌剂的制备
78.取100ml锥形瓶，将1g复合固定化载体浸泡于20ml新鲜混合培养基中(lb:pda＝1:2(v/v))，高温灭菌两次，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。待冷却后，取2.5ml复合微生物菌剂加入到上述含有复合固定化载体的锥形瓶中，然后将锥形瓶放在摇床上，在30℃、80r/min条件下培养48小时。培养后的混合液体过筛，筛孔网径75μm，然后用去离子水冲洗3次去除浮游细胞，得到复合固定化菌剂。
79.实施例2
80.本实施例是在实施例1的基础上进行条件变化，仅将步骤(1)中的d步骤改为：毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比2:1:1的比例混合均匀，得到复合微生物菌液。
81.实施例3
82.本实施例是在实施例1的基础上进行条件变化，仅将步骤(1)中的d步骤改为：将毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比1:1:3的比例混合均匀，得到复合微生物菌液。
83.实施例4
84.本实施例是在实施例1的基础上进行条件变化，仅将步骤(2)中生物炭与硼泥的重量比改为1.5:1混合均匀。
85.实施例5
86.本实施例是在实施例1的基础上进行条件变化，仅将步骤(2)中生物炭与硼泥的重量比改为1:2混合均匀。
87.对比例1
88.在实施例1的基础上，选用生物炭单独作为载体，复合微生物菌剂制备方法与实施例1相同，对比例1菌剂制备方法为：取100ml锥形瓶，将1g生物炭浸泡于20ml新鲜混合培养基中(lb:pda＝1:2(v/v))，高温灭菌两次，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。待冷却后，取2.5ml复合微生物菌剂加入到上述含有生物炭载体的锥形瓶中，然后将锥形瓶放在摇床上，在30℃、80r/min条件下培养48小时。培养后的混合液体过筛，筛孔网径75μm，然后用去离子水冲洗3次去除浮游细胞，得到对比例1的菌剂。
89.对比例2
90.在实施例1的基础上，选用硼泥单独作为载体，复合微生物菌剂制备方法与实施例1相同，对比例1菌剂制备方法为：取100ml锥形瓶，将1g硼泥浸泡于20ml新鲜混合培养基中(lb:pda＝1:2(v/v))，高温灭菌两次，灭菌温度121℃，灭菌时间30min。待冷却后，取2.5ml复合微生物菌剂加入到上述含有硼泥载体的锥形瓶中，然后将锥形瓶放在摇床上，在30℃、80r/min条件下培养48小时。培养后的混合液体过筛，筛孔网径75μm，然后用去离子水冲洗3次去除浮游细胞，得到对比例2的菌剂。
91.对比例3
92.在实施例1的基础上，仅选用毛霉菌作为微生物菌剂制备固定化菌剂，其他条件均与实施例1相同。
93.本实验例用以测定复合固定化菌剂对土壤中镉的钝化效果
94.土壤中有效态镉的提取及测定方法：
95.取2g土壤于50ml试管中，加9ml提取液，摇床旋转震荡两小时(150-200r/min)。震荡后静止1h，过滤，收集4ml左右滤液，测定滤液中镉浓度。
96.将实施例1至实施例5、对比例1至对比例3制得的菌剂分别以1％、5％比例加入到镉污染土壤中，分别于0d、30d、60d取土壤样品进行有效态镉含量测定。测定结果如图1、图2和表1所示。
97.表1镉-多环芳烃复合污染土壤中镉钝化率
[0098] 菌剂投加量为1％时镉钝化率％菌剂投加量为5％时镉钝化率％实施例133％32％实施例231.5％27％实施例325％22％实施例427％23％实施例525％21％对比例126％25％对比例221％15％对比例322％21％
[0099]
由图1、图2和表1可知：在固定化菌剂投加量为1％时，0-60d内，实施例1的复合固定化菌剂的钝化效果最好，钝化率为33％，当毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌
aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比为2:1:1时，其对镉的钝化效果仅略低于实施例1，然而当体积比1:1:3时，钝化效果则远低于实施例1；并且当改变了生物炭与硼泥的重量比时，钝化效果也大大降低。在固定化菌剂投加量为5％时，0-60d内，依旧是实施例1的复合固定化菌剂对土壤中镉的钝化效果最好，钝化率为32％。
[0100]
本实验例用以测定复合固定化菌剂对土壤中菲的修复效果
[0101]
土壤中菲的提取及测定方法：
[0102]
称取10进行冷冻干燥，干燥后取2g土壤样品于离心管中，加入30ml二氯甲烷，于超声水浴中萃取2h，温度控制在35℃以下，然后于4000r min-1离心5min，移取一定体积上清液过0.22μm有机滤膜至烧杯中，氮气吹至近干，用甲醇定容移入液相色谱进样瓶。通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography，hplc)测定样品中菲的浓度。
[0103]
将实施例1至实施例5、对比例1至对比例3制得的菌剂分别以1％、5％比例加入到菲污染土壤中，分别于0d、30d、60d取土壤样品进行菲含量测定。测定结果如图3、图4和表2所示。
[0104]
表2镉-多环芳烃复合污染土壤中菲降解率
[0105] 菌剂投加量为1％时菲降解率％菌剂投加量为5％时菲降解率％实施例191％91％实施例290％89％实施例386％80.5％实施例483％85％实施例583％80％对比例189％79％对比例289％89％对比例385％77％
[0106]
由图3、图4和表2可知：在固定化菌剂投加量为1％时，0-60d内，实施例1的复合固定化菌剂对菲的降解效果最好，降解率为91％，当毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比为2:1:1时，其对菲的降解效果仅略低于实施例1，然而当体积比1:1:3时，降解效果则远低于实施例1；并且当改变了生物炭与硼泥的重量比时，降解效果也大大降低。在固定化菌剂投加量为5％时，0-60d内，依旧是实施例1的复合固定化菌剂对菲的降解效果最好，降解率为91.98％。
[0107]
本实验例用以测定复合固定化菌剂对土壤中芘的修复效果
[0108]
土壤中菲的提取及测定方法：
[0109]
称取10g土样进行冷冻干燥，干燥后取2g土壤样品于离心管中，加入30ml二氯甲烷，于超声水浴中萃取2h，温度控制在35℃以下，然后于4000r min-1
离心5min，移取一定体积上清液过0.22μm有机滤膜至烧杯中，氮气吹至近干，用甲醇定容移入液相色谱进样瓶。通过hplc测定样品中芘的浓度。
[0110]
将实施例1至实施例5、对比例1至对比例3制得的菌剂分别以1％、5％比例加入到镉污染土壤中，分别于0d、30d、60d取土壤样品进行芘含量测定。测定结果如图5、图6和表3
所示。
[0111]
表3镉-多环芳烃复合污染土壤中芘降解率
[0112] 菌剂投加量为1％时芘降解率％菌剂投加量为5％时芘降解率％实施例145％61％实施例245％54％实施例340％47％实施例441.5％48％实施例541％55％对比例146％34％对比例223％49％对比例330％32％
[0113]
由图5、图6和表3可知：在固定化菌剂投加量为1％时，0-60d内，对比例1的固定化菌剂，即生物炭作为载体制成的菌剂对土壤中芘的降解率最高，为46％；实施例1的复合固定化菌剂对土壤中芘的降解率为45％，仅仅略低于对比例1，并且当毛霉菌mucor sp.fmm悬浮液、黑曲霉菌aspergillus niger sf05悬浮液和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg悬浮液按照体积比为2:1:1时，其对菲的降解效果仍然是仅略低于实施例1，然而当体积比1:1:3时，降解效果则远低于实施例1；并且当改变了生物炭与硼泥的重量比时，降解效果同样也大大降低。在固定化菌剂投加量为5％时，0-60d内，仍然是实施例1的复合固定化菌剂对土壤中芘的降解效果最好，降解率为61％。
[0114]
由此可见，虽然当菌剂投加量为1％时，生物炭作为载体制成的菌剂对芘有更高的降解率，然而综合来看，当选用毛霉菌mucor sp.fmm、黑曲霉菌aspergillus niger sf05和分枝杆菌mycobacterium sp.bfzg三种菌剂复配，并且选用生物炭和硼泥复合材料作为固定化所使用的载体，同时，三种菌剂和复合材料均按照本发明提出的最优比例混合时，对镉-pahs复合污染土壤的修复率更高。
[0115]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。