一种将基因ZmNAC77应用于玉米中增强根系生长的方法

一种将基因zmnac77应用于玉米中增强根系生长的方法
技术领域
1.本发明涉及玉米增产技术领域，尤其涉及一种将基因zmnac77应用于玉米中增强根系生长的方法。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，并不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.玉米是我国主要粮食作物之一，其种植面积远超水稻、小麦等其它粮食作物，稳居我国粮食作物第一位。出了人们公认其作为食物以及饲料的用途外，玉米还有许多工业用途，比如生物乙醇和淀粉的生产，也有研究表明玉米还有作为高价值产品(如重组药物蛋白和特殊化学品)生产载体的价值。然而，玉米作为多糖植物对环境变化较为敏感，使得玉米的产量以及品质易受到环境影响。增强植物生长的多个过程，包括根系的生长发育、叶夹角的增加、细胞的伸长等，都有利于植株抵抗突然的环境胁迫。


技术实现要素：

4.本发明提出一种将基因zmnac77应用于玉米中增强根系生长的方法，本发明通过新发现的基因zmnac77具有促进玉米生长的作用，使该基因在玉米中过表达，有效提高了玉米产量。为实现上述目的，本发明技术方案如下所示。
5.一种过表达基因zmnac77的玉米的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将zmnac77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。
7.(2)重组载体转入农杆菌中，获得重组农杆菌，然后将所述重组农杆菌转化至玉米植株中，收集其成熟的玉米种子。
8.(3)将所述玉米种子播种后筛选出阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种，并进行阳性纯系转基因株系筛选。
9.(4)测定所述阳性纯系转基因株系中的zmnac77表达量，选择目标植株，即得三种不同表达量的阳性纯合株系。
10.进一步地，步骤(1)中，首先依据所述zmnac77基因序列设计扩增引物，然后经扩增得到zmnac77基因表达片段，最后将所述zmnac77基因表达片段克隆至玉米过表达载体中，获得重组载体。
11.进一步地，所述扩增引物序列为：
12.zmnac77-f-1：acgatggtggagatgtctgtg；
13.zmnac77-r-1：caccgcaccaggatagattta。
14.进一步地，所述玉米过表达载体包括pubxcn-myc、pbpc-zmptill-bar、pcem-t-35sbar等中的任意一种。
15.进一步地，将所述zmnac77基因表达片段克隆至pubxcn-myc中的方法包括：通过
sma i内切酶对所述pubxcn-myc进行酶切形成含t碱基的粘性末端，得到表达载体。然后利用taq酶将zmnac77 cdna与该表达载体连接，得到过表达载体zmnac77-pubxcn，即为所述重组载体。
16.进一步地，步骤(2)中，将所述质粒转入农杆菌中，获得重组农杆菌，然后利用浸染法将该重组农杆菌转化至以kn5585为背景的玉米植株，收集其成熟的玉米种子，得到zmanc77过表达转基因株系。
17.进一步地，步骤(2)中，所述zmnac77过表达转基因株系的获得方法包括：将所述玉米植株的玉米棒子上的玉米须剪去，然后将所述重组农杆菌的菌液从玉米棒子的下部直接注入，待玉米棒子上的玉米籽成熟，收集该成熟的玉米种子，得到zmnac77过表达转基因株系。
18.优选地，所述菌液的注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜。
19.进一步地，步骤(3)中，将所述玉米种子晒干后播种，待幼苗长到3～4叶期时用除草剂basta检测筛选阳性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后再次进行繁种。
20.进一步地，步骤(3)中，所述独立转化事件的玉米苗繁种成熟后取玉米棒子上的籽粒，以其叶片总dna为模板，利用bar基因进行阳性纯系转基因株系筛选。
21.进一步地，步骤(4)中，利用qrt-pcr对所述阳性纯系转基因株系的植株内zmnac77表达量进行测定。
22.与现有技术相比，本发明具有以下方面的有益效果：本发明发现，zmnac77基因的过表达有助于玉米植株的生长发育，其原因在于zmnac77参与调控脂质代谢通路，zmanc77的过表达可能加快了三酰甘油分解到磷酸酯合成这一条通路的进行，而磷脂酶的增加往往可以诱导如脱落酸、生长素等植物激素含量发生变化。进一步地，本发明培育出了能够在玉米中过表达zmnac77基因的阳性纯系转基因株系，有效提高了玉米产量。实验显示：同一种植时期的zmnac77过表达株系与玉米野生型相比，其根系更长，植株更强壮，也更易生存，对于提高玉米产量的产量具有重要作用。
附图说明
23.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
24.图1为实施例1中zmnac77扩增片段图。
25.图2为实施例1中部分过表达株系bar基因筛选图。
26.图3为实施例1中zmnac77过表达株系显著性差异分析结果。
27.图4为实施例2中部分zmnac77基因编辑株系靶标鉴定筛选图。
28.图5为下列实施例中野生型、实施例1的zmnac77过表达株系、实施例2的基因编辑株系出苗率测定结果图。
29.图6为下列实施例中野生型、实施例1的zmnac77过表达株系、实施例2的基因编辑株系鲜重测定结果图。
30.图7为下列实施例中野生型、实施例1的zmnac77过表达株系、实施例2的基因编辑株系三叶期效果图。
31.图8为下列实施例中野生型、实施例1的zmnac77过表达株系、实施例2的基因编辑株系根系长度测定结果图。
具体实施方式
32.在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
33.除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的工艺进一步说明。
34.实施例1
35.一种过表达基因zmnac77的玉米的制备方法，包括如下步骤：
36.(1)克隆zmnac77基因(其基因序列参考专利申请：201910221636.1)，通过在zmnac77基因5'和3'末端引入a碱基粘性末端，通过pcr扩增得到基因的全长cdna序列，基因扩增使用的引物序列为：
37.zmnac77-f-1：acgatggtggagatgtctgtg；
38.zmnac77-r-1：caccgcaccaggatagattta。
39.所述pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s；56℃退火1min；72℃总延伸2min，33个循环；72℃复性5min；10℃保存。
40.(2)将步骤(1)得到的扩增产物(如图1所示)进行胶回收，测定浓度。通过smaⅰ内切酶将pubxcn-myc载体进行酶切形成含t碱基的粘性末端，得到表达载体。然后利用taq酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)将zmanc77 cdna与所述表达载体连接，连接程序如下：
41.pcr反应程序为∶95℃预变性30s；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃总延伸2min，35个循环；72℃彻底延伸7min。
42.(3)农杆菌介导的转zmnac77基因玉米的获得及鉴定：将步骤(2)连接成功得到的zmnanc77-pubxcn表达载体转化农杆菌ag10中，获得重组农杆菌ag10/zmnanc77-pubxcn，具体参见文献：methods in molecular biology，vol.343：agrobacterium protocols，2/e，volume 1(isbn:978-1-4939-1695-5)。
43.(4)农杆菌介导对目的玉米的转化：原位转化液的配制：在1/4ms培养基中加质量分数为：2％的蔗糖、0.05％的silwet-77(表面活性剂)，2mg/l 6-ba，1ng/l 2，4-d以及10mg/l乙酰丁香酮。每100ml培养基中加4ml所述农杆菌ag10/zmnanc77-pubxcn菌液，于28℃，250rpm条件下培养24小时，得到菌液，备用。
44.(5)将kn5585背景的玉米植株的玉米棒子上的玉米须剪去，用注射器将步骤(4)得到的菌液从玉米棒子的下部1/3处直接注入，注入至玉米须处有菌液渗出为止。然后经过两个月的生长，收获玉米粒。
45.(6)将步骤(5)得到的玉米粒晒干后播种，待幼苗长到3～4叶期时用配制的质量分数为0.01％的除草剂basta和bar蛋白检测试纸条(型号：as013ls)检测玉米植株中表达载体zmnanc77-pubxcn上所含的bar基因蛋白，若非阳性植株会在除草剂下死亡，筛选得到阳
性转基因植株，获得独立转化事件的玉米苗后进行繁种。
46.(7)繁种所述独立转化事件的玉米苗成熟后，每个玉米棒子上选取20颗籽粒，以其叶片总dna为模板，利用bar基因进行阳性纯系转基因株系筛选结果，阳性纯系株系中20颗籽粒均可得到条带(如图2所示)。筛选得到8棵阳性纯系植株。鉴定引物为：
47.zmnac77-oe-f：tgcaccatcgtcaaccactacat；
48.zmnac77-oe-r：agaaacccacgtcatgccagt。
49.pcr反应程序为∶95℃预变性5min：95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，32个循环：72℃总延伸5min，10℃保存。
50.所得阳性纯系株系利用qrt-pcr对植株内zmnac77表达量进行测定，选定表达量高中低三个纯合株系，根据表达量命名为oe1，oe2，oe2(如图3所示)，即zmnac77过表达株系，用于后续的实验。
51.实施例2
52.敲除zmnac77基因的玉米(基因编辑株系，简称crispr)的制备方法，包括如下步骤：
53.(1)根据zmnac77基因的核苷酸序列进行同源比对选取靶标序列cacctgacaacctagaggcg。以质粒prgeb31为模板通过overlapping pcr方法获得带有目标序列的全长片段，分别进行两次pcr。第一轮扩增分别用载体prgeb31中的u3启动子序列(u3-forward)作为上游引物，以靶标序列与prgeb31中一段上游grna序列做下游引物；引物序列为：
54.u3-forward：aagcttaaggaatctttaaacatacg；
55.zmnac77-cas9-r1：cacctgacaacctagaggcggttttagagctagaa。
56.第二轮扩增用靶标序列与prgeb31中一段上游grna序列做上游引物，用载体prgeb31中grna序列(grna-reverse)做下游引物，引物序列为：
57.zmnac77-cas9-f1：cacctgacaacctagaggcggtgccacggatcatct；
58.grna-reverse：cctgcaggcatgcacgcgctaaaaac。
59.(2)分别回收两轮扩增产物，合并后作为扩增模板，以载体prgeb31中u3启动子序列作为上游引物，以grna-reverse序列做下游引物，做第三轮overlapping pcr扩增。回收扩增产物连接到pgem-teasy vector，16℃连接过夜，然后转化大肠杆菌dh5α，利用质粒小提试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取质粒后进行测序。
60.(3)取测序结果正确的重组质粒和载体prgeb31分别用hindⅲ和sbfⅰ双酶切，回收酶切产物并建立连接体系，16℃连接过夜，然后转化至大肠杆菌dh5α，用卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，取酶切正确的克隆进行测序，得到含有目标序列的重组载体。
61.(4)采用与实施例1中构建zmanc77过表达转基因玉米材料相同的方法，利用农杆菌介导对目的玉米的转化，将所述过表达载体注入kn5585为背景的玉米棒子中，并直接进行繁种。
62.(5)繁种所得独立转化事件的玉米苗成熟后每个棒子选取20颗籽粒，以其叶片总dna为模板，利用靶标基因鉴定引物进行阳性纯系转基因株系筛选。筛选得到8棵阳性纯系植株。鉴定转基因植株，鉴定时以野生型目的玉米植株为阴性对照，鉴定引物为：
63.zmanc77-f：ctgatccggtccgatgatcc；
64.zmanc77-f：agaaacccacgtcatgccagt。
65.pcr反应条件为∶95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃总延伸5min。
66.(6)观察pcr结果，同一发生系20颗株系叶片条带大小是否一致且单一，选择单一条带者，切胶后连接t载体送往公司进行一代测序(如图4所示)。然后利用bioedit软件对测序结果和maizegdb数据库中公布的zmnac77 cdna序列进行比对，选择靶标序列处无其他突变位点且无双峰的发生系作为基因编辑阳性纯合玉米材料选取阳性纯合株系。
67.效果测试
68.对野生型kn5585、实施例1的zmnac77过表达株系、实施例2的crispr的出苗率、根系长度和鲜重这三个指标进行测试，以研究玉米中的zmnac77基因参与植物生长发育通路以及在该通路中的作用。
69.为此，从同一繁种时期的野生型kn5585、zmnac77过表达株系、crispr中各选择50颗饱满无残缺的籽粒，同一时期进行土培种植，放置于28℃，16h光照，8h黑暗的温室内培养。
70.(1)上述植株培养至14天后，统计各个株系的出苗率，计算各株系50颗籽粒中发芽的概率(结果如图5所示)。
71.(2)从每种株系中随机选取10棵植株，用流水清理根系浮土，洗净后用吸水纸擦干附着水分，利用精准天平测量植株鲜重，精准至小数点后三位数(结果如图6和图7所示)；同时用米尺测量各株系根系长度，精准至小数点后两位数(结果如图8所示)。
72.上述测试结果显示，(1)关于出苗率：实施例1的zmnac77过表达株系(qe1)的出苗率为98％，较野生型材料出苗率高了近8％，而zmnac77敲除的crispr出苗率为63％，较野生型材料出苗率低了近27％。(2)关于植株鲜重：实施例1的zmnac77过表达株系(qe1)的鲜重为1.488g，较野生型高了近19％，crispr鲜重为0.706g，较野生型降低了40％，较qe1低了50％。(3)关于根系长度：实施例1的zmnac77过表达株系(qe1)的根长为15.05cm，较野生型高了近36％，crispr根长仅为8.47cm，较野生型低了23％，较qe1低了43％。
73.以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的根据权利要求为准。