一种与猪无毛性状相关的miRNA标志物及其应用的制作方法

一种与猪无毛性状相关的mirna标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测及育种技术领域，具体涉及一种与猪无毛性状相关的mirna标志物及其应用。
技术背景
2.一直以来，猪作为医学研究的理想模式动物，用来研究人类医学问题。无毛猪具有毛囊发育不全的特征，可以以无毛猪作为研究人类毛发领域疾病的动物模型。但在无毛猪培育过程中，如何鉴定胚胎期的猪具有无毛性状，却是比较麻烦的事。因为猪胚胎的毛囊中毛干并未伸出皮肤表层，凭肉眼无法直接判定该猪胚胎是否为无毛猪，目前的解决方法主要是先将猪胚胎皮肤组织脱水固定形态，再进行组织形态学观测来判定。实验操作复杂，耗时长。需要有一种简单、方便、有效的区分正常和无毛猪性状的分子标记，以实现对无毛猪的精准鉴定。
3.随着分子生物学的飞速发展和高通量测序技术的日趋成熟，研究发现非编码rna在一些复杂疾病的发生过程中异常表达，具有促使或者抑制疾病发生的作用。mirna(microrna，微小rna)是一类在生物体中广泛存在的长度约为20
‑
24nt的内源单链非编码小分子rna。近年来大量研究表明，mirna通过完全/不完全与靶mrna3’utr互补结合抑制靶mrna的翻译或直接介导靶mrna的降解，进而调控毛囊生长发育以及毛发周期性发育等众多重要生物学过程。筛选出与猪无毛性状相关的mirna及其靶基因，可为快速鉴定胚胎期的猪是否具有无毛性状提供依据，为培育扩群具有医学价值的无毛猪提供了帮助。


技术实现要素：

4.为了解决以上问题，本发明提出一种与猪无毛性状相关的mirna 标志物，所述mirna标志物为mirna
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5p，其中所述mirna
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5p 序列如seq id no.1所示，所述mirna
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5p的前体序列如seq idno.2所示，所述mirna
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5p与靶基因edar的结合位点如seq idno.3所示。
5.本发明同时提供一种与猪无毛性状相关的mirna标志物在无毛猪鉴定培育中的应用，当所述mirna
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29a
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5p在猪胚胎皮肤组织中的基因表达量低于3的判定为有毛猪，所述mirna
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29a
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5p在猪胚胎皮肤组织中的基因表达量高于30判定为无毛猪。
6.进一步，所述猪胚胎为怀孕母猪妊娠天数达到41天时进行流产获得的。
7.本发明同时提供一种检测所述mirna
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5p表达水平的试剂，所述试剂包含特异性识别猪mirna
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5p的寡核苷酸探针、或特异性扩增本发明的mirna
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29a
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5p标志物引物。
8.本发明提供的猪无毛性状相关的mirna标志可应用于无毛猪鉴定培育中，所述无毛猪鉴定培育包括如下步骤：
9.步骤一、皮肤样本mrna提取：选取正常公猪与无毛母猪配种，在怀孕母猪妊娠天数达到41天进行剖腹产，取出猪胚胎采集两份胚胎背部2cm x 2cm大小组织块，分离皮肤组织
并投入液氮中保存；
10.步骤二、mirna
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5p引物设计：在ncbi数据库中获取 mirna
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5p基因的mrna序列信息，利用软件设计引物；
11.步骤三、皮肤样本mirna提取：在液氮中将皮肤组织块进行研磨至粉状，称取组织样50
‑
100mg加入1ml trizol，然后进行匀浆处理。利用氯仿、异丙醇、75％乙醇，无rnase水分别对组织中的蛋白质、 dna及无机盐进行洗脱去除并对mirna沉淀浓缩；
12.步骤四、mirna
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5p基因表达量检测：使用qrt
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pcr试剂盒对mirna
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5p进行pcr扩增，利用roche lightcycler480荧光定量仪对mirna
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5p表达量进行检测；将测出的mirna
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5p荧光信号ct值转化成mirna
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5p基因表达量，转化公式如下：
13.mirna
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‑
5p基因表达量＝2
‑△△
ct
；
14.步骤五、结果判定：当mirna
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5p基因表达量低于3的判定为有毛猪，高于30判定为无毛猪。
15.根据本发明的技术方案鉴定培育的无毛猪应用在医学和科研领域。
16.本发明的有益效果如下：
17.1、候选基因筛选精准，提供了重要的动物模型：本发明利用全转录组策略精准筛选无毛性状候选基因技术手段，将不同rna多层次的生物信息进行整合利用，精准筛选候选基因，通过对候选基因不同时期的rna和蛋白水平的交叉验证，找到了猪无毛性状关键非编码rna：mirna
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5p。本发明为无毛猪表型鉴定提供了一种早期辅助诊断mirna标志物及辅助育种。
18.2、提供了一种无毛性状的分子标记：可通过本发明提供的分子标记来对无毛猪进行选育纯化，也可对遗传性无毛症进行鉴定。
19.3、提供了可供研究使用的大白猪无毛试验群体：本发明的试验群体是先期发现的少量大白无毛猪，利用了遗传育种理论，对发现的大白猪无毛个体进行了扩群，为开展毛囊发育和模型动物的研究提供了具有价值的实验材料。
20.4、集成多学科技术对猪无毛性状进行遗传解析，结果更为准确：本发明整合了多组学思想进行交叉验证分析，涉及多种学科，包括到细胞学、分子生物学、统计基因组学、生物信息学和计算机学等多个领域对猪无毛性状进行遗传解析，得到了更为准确的结果，也减小一些假阳性的存在，在解析无毛性状遗传机理的同时为复杂性状的研究提供新的思路。
附图说明
21.图1为实施例1的41天有毛与无毛猪胚胎单位毛囊计数对比图；
22.图2为实施例2筛选得到的有毛猪和无毛猪表达量差异显著的mirna；
23.图3为仅在41天猪胚胎皮肤中特异性差异表达的mirna；
24.图4为重合mirna靶基因功能注释；
25.图5为重合mirna靶基因信号通路注释；
26.图6为mrna，mirna及lncrna中重合的靶基因韦恩图；
27.图7为cerna表达调控网络构建；
28.图8为靶基因功能注释及信号通路注释；
29.图9为不同脊椎动物mirna
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5p序列；
30.图10为不同时期mirna精细定位；
31.图11为双荧光素酶报告系统验证mirna
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5p表达量；
32.图12为mirna
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5p靶基因edar蛋白表达量检测；
33.图13为毛囊基板形成相关的关键基因表达量检测；
34.图14为cck8细胞增殖试剂盒检测细胞增殖能力；
35.图15为brdu细胞增殖试剂盒检测细胞增殖能力；
36.图16为三步法pcr参数设置。图17为通过表型鉴定验证mirna
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5p表达量判定猪无毛性状的实验结果对比图。
具体实施方式
37.以下结合实施例对本发明作进一步说明。
38.实施例1：筛选与无毛性状相关的基因mirna
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5p
39.本发明的试验群体是先期发现的少量大白无毛猪(发现地址:河北省衡水市安平县，发现人：中国农业大学动物科技学院丁向东副研究员)
40.s1、无毛猪配种计划：选取正常公猪与无毛母猪配种，在怀孕母猪妊娠天数达到41天进行剖腹产，取出猪胚胎采集两份胚胎背部2cmx 2cm大小组织块，然后分离皮肤组织并进行消毒。其中一份放入液氮中进行rna保存，一份放入多聚甲醛中用于后期表型鉴定。
41.s2、表型鉴定：表型鉴定采用苏木精伊红(he)染色进行毛囊计数统计(图1)。以妊娠41天猪胚胎皮肤组织为研究对象(无毛和正常猪毛囊对比最为明显)，测量单位面积毛囊数。在背部相同部位检测囊数，将单位面积内毛干数小于等于3根(平均数 标准差)的猪判定为无毛猪，多于等于6根(平均数－标准差)的为正常猪。同时将背部组织进行横切，通过he染色观察，横切he用来观察单位面积毛囊数的多少，从而进行辅助无毛性状判定。
42.s3、mirna测序及候选mirna靶基因预测：
43.皮肤毛囊相关基因表达检测采用二代高通量测序技术mirna转录组测序(交于诺禾致源生物有限公司)。采用病例对照家系分析对影响猪无毛性状性状进行转录组测序(mirna)，筛选与目标性状显著关联，与猪胚胎期毛囊发育相关的差异mirna，并对其调控的靶基因进行预测分析，结果显示：筛选得到9个在有毛猪和无毛猪表达量差异显著的mirna(图2)，进一步对仅在皮肤毛囊中差异表达的mirna 进行筛选发现，这9个差异mirna均仅在41天猪胚胎的皮肤中特异性表达，说明可能是无毛性状的潜在候选mirna(图3)。同时使用两种不同的mirna靶基因预测软件miranda和rnahybird对这9个mirna 的靶基因进行了预测，选取其交集的1296个基因作为这9个mirna 的可靠靶基因。
44.s4、候选mirna靶基因功能注释
45.我们对筛选出来的靶基因进一步进行基因功能注释(go)和信号通路分析。go功能分析(图4)发现差异靶基因在细胞成分，分子功能和生物过程等方面显著富集成纤维细胞生长因子受体，wnt信号通路及细胞增殖等毛囊发育过程。kegg通路分析(图5)发现部分差异靶基因注释在wnt，tgfβ，nf
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kb等通路中，存在于这些通路的重要差异mirna及其靶基因基因可作为猪胚胎时期毛囊基板发生、发育关键的候选对象。最终筛选出来包含edar，
dkk4，bmp3等共计31个靶基因及其mirna 5个(图6)。
46.s4、候选mirna筛选：
47.对筛选出来的5个mirna进行cerna构建和共表达网络分析(wgcna)，以确定在胚胎41天特异性表达在皮肤毛囊基板中的调控机制。cerna构建结果显示(图7)：根据cerna表达调控模式(mirna 与靶基因的表达趋势相反)，最终我们筛选出包含3个mirna和18个靶基因的cerna调控机制。其中edar，fgfr2，bmpr1b及vangl1主要富集到wnt，edar/nf
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kb,tgfβ，bmp及fgf信号通路，主要跟皮肤毛发发育，皮肤干细胞，皮肤成纤维细胞等生物学功能有关，说明这些基因可能是导致毛囊基板形成受阻的主要候选靶基因(图8)。利用氨基酸分析软件与蛋白比对软件，对猪mirna序列以及其他脊椎动物(人类，小鼠，大鼠，牛，羊，鸡等)mirna序列进行比对，观察mirna是否位于高保守性区域(图9)。
48.此外利用不同时期(e39，e41,e45,e52,e60)的mrna测序技术对筛选出来的mirna进一步精细定位(图10)，结果显示仅有edar 及bmpr1b在e41天特异性表达，且edar和bmpr1b的靶向mirna均为mirna
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5p。根据以上实验结果筛选出了本发明的影响猪毛囊基板的候选mirna：mirna
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29a
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5p。
49.s5、mirna
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29a
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5p细胞水平验证：
50.对筛选出来的mirna
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5p在细胞水平上进一步分析其影响毛囊基板形成的具体遗传机制。首先对妊娠e41胚胎猪皮肤组织中的成纤维细胞进行分离培养，待成纤维细胞系稳定生长传代后，对 mirna
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29a
‑
5p进行功能验证。利用双荧光素酶报告系统验证 mirna
‑
29a
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5p的靶向基因edar，mrna表达检测结果显示(图11)野生型mirna
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29a
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5p表达升高导致抑制靶基因的表达变化，而突变型 mirna
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5p表达量变化对靶基因edar表达量无影响，说明 mirna
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‑
5p可以通过结合靶基因edar抑制其表达量变化从而发挥功能。此外在蛋白水平(图12)，对mirna
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29a
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5p进行抑制(inhibitor)和过表达(overexpression)后，我们利用western blot技术对靶基因edar蛋白表达进行检测，其结果与mrna表达水平一致。
51.此外，基于mirna
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29a
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5p表达量的变化，我们也检测了一系列与毛囊基板形成相关的关键基因(eda，nf
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kb，wnt10b，bmp4，pcad， lhx2，fgf20)，其表达量均有显著的上调或者下调(图13)。进一步说明mirna
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29a
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5p可能通过特异性结合靶基因edar来调控毛囊基板的形成过程。此外我们利用cck8(图14)及brdu(图15)两种细胞增殖试剂盒检测发现mirna
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29a
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5p表达升高后，成纤维细胞细胞增殖能力减弱。而毛囊基板的形成就是细胞增殖加快，细胞聚集变厚的过程。综合细胞水平研究，我们发现mirna
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29a
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5p可以通过靶向edar，降低edar的表达量，抑制毛囊基板相关细胞的增殖能力，从而抑制毛囊基板的形成。
52.实施例2验证猪胚胎皮肤中mirna
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5prna基因表达量与无毛表型之间的联系(实验验证mirna
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5prna基因表达量数值与无毛性状之间的关系)
53.s1、无毛猪配种计划：选取正常公猪与无毛母猪配种，在怀孕母猪妊娠天数达到41天进行剖腹产，取出猪胚胎采集两份胚胎背部2cmx 2cm大小组织块，然后分离皮肤组织并进行消毒。将样品放入液氮中进行rna保存。
54.s2、mirna
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5p引物设计：
55.在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取 mirna
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29a
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5p基因的序列信息，利用软件mirprimer2设计。扩增持家基因gapdh的引物同上方法进行设计,并交
由上海生工生物工程有限公司合成。
56.引物序列信息如下
[0057][0058]
s3、皮肤样本mirna提取：在液氮中将组织块进行研磨至粉状，称取组织样50
‑
100mg加入1ml trizol，然后进行匀浆处理。利用氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、75％乙醇，无rnase水(需要用depc处理水配制)分别对组织中的蛋白质，dna及无机盐进行洗脱去除并对mirna 沉淀浓缩。
[0059]
在提取过程中，为了提高mirna的得率，需要对提取步骤进行改善，其中：(1)在rna析出过程中，加入异丙醇含量需要与上清液等体积；(2)异丙醇与上清液混合液在
‑
20℃下，静置过夜；(3)在 mirna沉淀浓缩过程中，使用25000g离心15分钟；通过对提取条件的改善，可以提高mirna的得率；
[0060]
s4、皮肤样本mirna反转录及表达量检测：mirna反转录采用 trans公司的green mirna two
‑
step qrt
‑
pcr试剂盒(aq202)。
[0061]
a.加尾反应和第一链cdna合成：在冰上将如下成分依次加入配制反应混合液，为保证每个反应管中的反应液均一性和准确性，可按反应数 2的总量进行配制master mix，然后再将总反应液进行平均分装至每个反应管中，最后按照试验设计加入所需的mirna样品。
[0062]
20μl mirna体系：
[0063][0064]
*total mirna无法用分光光度计定量，推荐用量1
‑
9μl(20μl体系)
[0065]
b.mirna qrt
‑
rcr表达检测：在冰上将如下成分依次加入配制反应混合液，为保证每个反应管中的反应液均一性和准确性，可按反应数 2的总量进行配制master mix，然后再将总反应液进行平均分装至每个反应管中,每个反应管20μl，混合完成后立即进行荧光定量检测。pcr程序按图6的三步法pcr参数进行设置。将测出的 mirna29a
‑
5p荧光信号ct值(循环数)转化成mirna29a
‑
5p表达量，转化公式如下：
[0066]
mirna29a
‑
5p表达量＝2
‑△△
ct
；
[0067]
20μl mirna反转录体系：
[0068][0069]
*1
反转录所得cdna稀释5
‑
10倍后使用；
[0070]
*2
上游引物为mirna特异引物，根据目的mirna设计；
[0071]
(a)引物浓度在0.2－1μm范围内为宜，本反应起始浓度使用0.2μm/each；(b)在20μl反应体系中，使用纯化的cdna(20ng)作为模板－如果使用不纯的模板，可酌情减少模板体积(不超过2ul)，同时可通过延长预变性时间(10min)以降低体系中模板杂质对pcr反应的影响；(c)加样过程中要尽量降低误差，建议使用20μl反应体系；(d)试验中设置阴性对照，即以pcr水替代模板，以排除模板污染带来的假阳性结果；(e)按照pcr反应需要量来配制mix，混匀后离心分加到各孔中，减少加样误差；(f)上机：以封板膜封板；1500g 离心pcr多孔板2min；将板放入480仪器
[0072]
对mirna29a
‑
5p基因表达量用graphpad prism软件进行作图，以mirna
‑
29a
‑
5p的表达水平作为判定猪无毛性状的判断标准，当 mirna
‑
29a
‑
5p基因表达量(fpkm值)低于3的判定为有毛猪， mirna
‑
29a
‑
5p表达量高于30(fpkm值)判定为无毛猪。
[0073]
s5、mirna
‑
29a
‑
5p表达量判定无毛性状验证
[0074]
为了验证猪皮肤中mirna
‑
29a
‑
5p基因表达量与无毛表型之间的联系，我们挑选mirna
‑
29a
‑
5p低表达个体(个体1，2，3)和高表达个体(个体4，5，6)猪皮肤组织各三头进行表型鉴定(图17)。其中3个低表达个体mirna
‑
29a
‑
5p表达量均低于3，平均值为1.14，低表达个体都为有毛猪；而3个高表达个体mirna
‑
29a
‑
5p基因表达量均大于30，平均值为45.23，高表达个体都为无毛猪。表型鉴定采用苏木精伊红(he)染色，以妊娠41天仔猪皮肤组织为研究对象，测量单位面积毛囊数。在背部相同部位检测囊数，将单位面积内毛干数小于等于3根(平均数 标准差)的猪判定为无毛猪，多于等于6 根(平均数－标准差)的为正常猪。通过对背部组织横切和he染色观察发现，mirna
‑
29a
‑
5p低表达组中单位面积毛囊数均多于等于13 根，平均值为14.33，远远高于有毛猪单位面积毛囊数大于6根的标准。同时mirna
‑
29a
‑
5p高表达组中单位面积毛囊数均小于等于2，平均值为1.67，远远低于无毛猪单位面积毛囊数小于3根的标准。通过对表型鉴定，我们发现mirna
‑
29a
‑
5p表达量高低影响猪的毛囊数，从而导致无毛性状的产生。
[0075]
综上我们发现本发明所述的mirna
‑
29a
‑
5p在毛囊形态发育过程中特异性高表达并且在有毛和无毛猪中差异显著，说明本发明所述的 mirna
‑
29a
‑
5p基因在毛囊形态发育
过程中发挥重要功能。
[0076]
根据本发明的实施例，该方法通过对待测猪进行前面所述的分子标记的检测，以便确定待测猪的无毛性状，由此利用本发明的 mirna
‑
29a
‑
5p基因对猪进行辅助育种，能够有效的选择出能稳定遗传的无毛性状的母猪，进而能够实现短时间、低成本、高准确性的选育品种优良的疾病模型猪，其次也可以作为鉴定导致遗传性无毛症产生的分子标记，进一步还可以应用于哺乳动物的毛发发育研究。
[0077]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0078]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
[0079]