FGF21突变体蛋白及其医药用途的制作方法

fgf21突变体蛋白及其医药用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及fgf21的突变体蛋白及其医药用途。


背景技术：

2.成纤维细胞生长因21(fibroblast growth factor 21,fgf21)是一种由209个氨基酸组成的多肽(seq id no:1)，其氨基酸序列与小鼠的fgf21具有约75％的同源性。fgf21 n末端含有28个氨基酸构成的信号肽，因而成熟的fgf21由181个氨基酸组成(seq id no:3)。成熟的fgf21在本文seq id no:3的第146位上具有leu替代pro的天然人fgf21同等型(isoform)或等位形式(allelic form)。fgf21主要在肝脏和胰腺中表达，同时也存在于脂肪和肌肉组织中。通过fgfr的介导和跨膜蛋白βklotho(klb)的辅助，fgf21能诱导肝脏、胰腺和脂肪组织中的多种信号通路和功能活动，进而实现对糖脂代谢的调节和对胰岛β细胞进行保护的生理功能。fgf21通过激活非胰岛素依赖的葡萄糖吸收，调节脂肪细胞对葡萄糖的摄取。另外，研究还表明，fgf21可剂量依赖性的减少体重和全身体脂，如向患糖尿病的恒河猴施用fgf21，发现其空腹血浆葡萄糖、甘油三酯和胰高血糖素水平均有显著减少。同时，在fgf21转基因小鼠身上发现，其白色脂肪组织脂肪酶表达增加，血浆β-羟丁酸和游离脂肪酸水平升高。这意味着fgf21可能是通过促进脂肪分解以及生酮作用调控脂质代谢。在胰岛细胞和ins-1e细胞中，fgf21能够抑制葡萄糖介导的胰高血糖素的释放，刺激胰岛素的产生，并防止胰岛细胞凋亡，进而改善胰腺细胞功能。此外，fgf21还能激活外分泌胰腺细胞和肝细胞信号通路，抑制肝糖原输出。
3.fgf21作为fgf基因家族的成员，大多数fgf具有广谱的促有丝分裂的能力，而探究结果表明，fgf21既没有促进细胞增殖的能力，也不会拮抗fgf家族其他成员的功能。实验证明，fgf21转基因鼠(体内fgf21量是正常鼠的150倍左右)在整个生命周期内，体内未发现肿瘤以及组织增生等异常状况。同时，其代谢调节作用与机体的代谢水平相关，调节作用仅在代谢异常时发挥作用，即使超过药理学剂量的fgf21也不会出现低血糖症。而目前市场上主要的治疗糖尿病的药物(胰岛素，噻唑烷二酮等)在剂量不当时易产生副作用，如大剂量的胰岛素导致的低血糖，噻唑烷二酮导致的肝功能损坏和水肿，这些在接受fgf21治疗的动物实验中均没有发现，这也足以证明fgf21是一种理想的治疗糖尿病以及肥胖等疾病的药物。
4.fgf21在控制血糖和降低体重等方面的生理功能为治疗相关疾病带来了希望，但是野生型fgf21作为小分子蛋白易被蛋白酶水解，也可通过肾小球滤过，半衰期仅为0.5-2h，难以保证有效药物作用时间。面对这种困难，医药工业界通过进行酶切位点氨基酸定点突变，制备长效融合蛋白或将聚乙二醇连接到多肽骨架等方法来提高fgf21的半衰期。此外，在研发fgf21作为蛋白质制剂中的重大挑战还来自其自身聚集造成的不稳定性。目标治疗蛋白的理想效果是增加对蛋白水解的耐受性以及降低蛋白的聚集性，进而增强fgf21蛋白制剂的半衰期和稳定性，实现对患者的低频给药。在wo2009/149171和wo2017/074117中已经描述了一些基于人野生型fgf21多肽序列的突变体。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种fgf21蛋白或其变体，其通式如下：
6.hpipdsspllqfggqvrqrylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesl
7.lqlkalkpgviqilgvktsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrerlledgy
8.nvyqseahglplhlpgnksphrdpaprgparflplpglppalpeppgilapqppdvgswdplsmvggsqgx
175
spsyes
9.(i)
10.其中：
11.x
175
选自arg或trp。
12.本发明的一个实施方案是通式(i)所述的fgf21蛋白或其变体，其序列如seq id no:5所示。
13.本发明还涉及一种多核苷酸，其编码包含通式(i)所述的fgf21蛋白或其变体。
14.本发明还涉及一种表达载体，其含有如上所述的多核苷酸。
15.另外，本发明还涉及一种宿主细胞，其导入或含有如上所述的表达载体。
16.其中上述宿主细胞为细菌，或者为酵母菌，或者为哺乳动物细胞；优选为大肠杆菌、毕赤酵母、cho细胞或hek293细胞。
17.本发明还涉及一种生产fgf21蛋白或其变体的方法，包括步骤：
18.1)培养如上所述的宿主细胞；
19.2)从培养物中分离fgf21蛋白或其变体；
20.3)以及对所述的蛋白或其变体进行纯化。
21.本发明进一步包含一种药物组合物，其含有通式(i)所述的fgf21蛋白或其变体。
22.上述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
23.本发明还涉及所述的fgf21蛋白或其变体或如上所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病。
24.本发明提供的fgf21突变体蛋白，能够诱导葡萄糖摄取、促进erk1/2蛋白的磷酸化，这些特征对于治疗性蛋白的制备和配制有利，并具有对糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病的潜在治疗效果。
25.发明的详细说明
26.除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
27.本发明的fgf21突变体中氨基酸的位置改变从成熟的人野生型fgf21(seq id no:3)多肽中的氨基酸位置决定。
28.本发明的氨基酸序列含有二十种氨基酸的标准单字母或三字母代码。
29.术语“fgf21多肽”是指人体内表达的天然存在的野生型多肽。包括seq id no:1组成由seq id no:2编码的全长形式，和seq id no:3组成由seq id no:4编码的成熟形式。
30.术语“fgf21突变体”是指基于天然存在的fgf21氨基酸(seq id no:3)序列而修饰的fgf21多肽。这类修饰包括但不仅限于一个或多个氨基酸被取代，包括且不仅限于本文所述的蛋白酶抗性fgf21突变体、聚集减少的fgf21突变体以及fgf21组合突变体。
31.术语“患者”是哺乳动物，优选人。
32.术语“治疗”指减缓、降低或逆转症状、病症或疾病的进展或严重性。
33.术语“fc片段”指免疫球蛋白的重链的恒定区。
34.术语“载体”指用于向宿主细胞传递编码信息的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。
35.术语“表达载体”指适于宿主细胞转化并含有指导和/或控制插入异源核酸序列表达的核酸序列的载体。包含但不限于诸如转录、翻译和rna剪接等过程。
36.术语“宿主细胞”用来指被核酸序列转化或能够被所述核酸序列转化然后能够表达选定目标基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，无论子代在形态或遗传组成上是否与最初的亲代相同，主要存在选定的基因。
具体实施方式
37.为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。
38.1.主要实验试剂：
[0039][0040][0041]
2.主要实验仪器：
[0042]
名称品牌型号蛋白纯化仪geakta-pure150酶标仪ms美谷分子
[0043]
实施例1fgf21突变体蛋白的制备
[0044]
采用expicho系统(thermo fisher#a29133)表达fgf21突变体蛋白(seq id no:5)。
[0045]
具体的，将编码c端带有his标签的fgf21突变体蛋白的dna序列克隆至pcdna3.1载体中，经过测序，确认得到表达融合蛋白的质粒。使用expifectamine试剂将质粒转染至expicho-s细胞中，在100ml的expicho培养基中培养细胞7天后，收获上清液；采用离心过滤或深层过滤的方法进行发酵液的澄清。
[0046]
配置eq缓冲液(pbs,ph7.4)的方法为取pbs磷酸缓冲液粉剂一袋，将该粉末用2000ml超纯水溶解，用0.22μm滤膜过滤备用。
[0047]
配置elution缓冲液(500mm咪唑,ph7.4)的方法为称取咪唑34g加eq缓冲液450ml，调节ph至7.4，定容至500ml，0.22μm滤膜过滤备用。
[0048]
将收获后的上清液通过akta pure仪器进行纯化。首先用eq缓冲液平衡仪器，直至
流出液体的ph和电导值与eq缓冲液一致；再用elution缓冲液收集样品。
[0049]
用紫外分光光度法测定制备蛋白的浓度和纯度。
[0050]
蛋白编号浓度(mg/l)纯度(％)seq id no:584697seq id no:685093
[0051]
实施例2fgf21突变体诱导的葡萄糖摄取功能研究
[0052]
评价fgf21蛋白突变体对葡萄糖摄取水平的调节作用。3t3-l1小鼠胚胎成纤维细胞分化成熟的脂肪细胞表面表达葡萄糖转运蛋白1(glut1)，fgf21蛋白通过调节glut1的表达水平，进而调节脂肪细胞对葡萄糖摄取水平。
[0053]
将培养的3t3-l1(南京科佰，cat#:cbp60758)小鼠胚胎成纤维细胞用胰蛋白酶(gibco，cat#:25200-056)消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度至1x106/ml，接种于t75培养瓶，于37℃，5％二氧化碳培养箱内培养过夜。吸取原培养基，加入诱导培养基，即在含10％胎牛血清(gibco，cat#:1009141c)的dmem(gibco，cat#:11995-065)完全培养基中加入2μg/ml人胰岛素(sinobiologics，cat#:11038-hnay)溶液，1μm地塞米松(sigma，cat#:d4902-25mg)和0.5mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)(sigma，cat#:i7018-100mg)，诱导培养3t3-l1细胞3天，镜下观察细胞内脂肪粒的数量及大小，使其分化成脂肪细胞，之后将分化培养基换成只含有2μg/ml人胰岛素完全培养基。
[0054]
将诱导分化成熟的脂肪细胞消化，制备单细胞悬液，用dmem完全基础培养基调整细胞密度至1x106/ml，100ul/孔，接种于96孔板(corning，cat#:3610)，待细胞贴壁，在实验组加入以dmem基础培养基稀释待测突变体蛋白，使其终浓度为5000nm，100ul/孔加入板内，对照组加入相同体积的dmem基础培养基，于37℃，5％二氧化碳孵育过夜。次日，将细胞在dmem基础培养基中饥饿2小时，之后加入100um 2-nbdg，于37℃孵育1小时，ph7.4 pbs溶液洗细胞2次，胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，将细胞转移至v型底96孔板，利用ze5流式细胞仪检测胞内2-nbdg信号，利用mfi计算葡萄糖的摄取率，计算公式：葡萄糖摄取率％＝(实验组mfi-对照组mfi)/对照组mfi*100％。
[0055]
fgf21蛋白突变体对葡萄糖摄取水平的调节作用
[0056]
蛋白编号葡萄糖摄取率5000nm(％)seq id no:642.76
[0057]
实验结果表明，本发明的fgf21突变体显著诱导脂肪细胞对葡糖糖类似物2-nbdg摄取，诱导效率良好。
[0058]
实施例3fgf21突变体诱导erk1/2蛋白磷酸化的细胞功能研究
[0059]
fgf21蛋白通过ras/raf/mapk信号通路途径调节erk1/2蛋白的磷酸化水平转导细胞信号参与体内能量代谢。评价比较fgf21蛋白突变体对erk1/2蛋白的磷酸水平调节差异可评价其转导细胞信号的水平。
[0060]
将huh-7(中科院，cat#:scsp-526)以1x105/ml接种于96孔板，100ul/孔，于37℃，5％二氧化碳孵育过夜，次日，将细胞在dmem(gibco，cat#:11995-065)基础培养基中饥饿2小时，在实验组加入以dmem基础培养基稀释待测蛋白，调整待测突变体蛋白终浓度为50nm，100ul/孔加入板内，对照组加入相同体积的dmem基础培养基，37℃孵育20分钟，加入固定液(bd cytofix，cat#:554655)于37℃固定30分钟，以400g，4℃离心5分钟，洗两遍。加入通透
液(bd phosflow，cat#:558050)4℃通透1小时之后加入alexa647标记小鼠抗人perk1/2蛋白抗体(biolegend，cat#:369504)，4℃孵育1小时，以400g，4℃离心5分钟，洗两遍，100ul/孔加入2％fbs溶液重悬细胞于ze5(bio-rad)流式细胞仪检测alexa647通道信号，利用平均荧光强度(mfi)计算perk1/2增长效率，计算公式：perk1/2增长率％＝(实验组mfi-对照组mfi)/对照组mfi*100％。
[0061]
蛋白编号perk1/2增长率％seq id no:513.13seq id no:616.25
[0062]
实验结果表明，本发明的fgf21突变体可上调huh-7细胞内erk1/2蛋白的磷酸水平，效果良好。
[0063]
[0064]