一种栀子多糖及其制备方法及用途

1.本发明涉及一种栀子多糖及其制备方法及用途，具体地，涉及一种从栀子(gardenia jasminoides)中提取得到的均一多糖，其制备方法，以及其在抗肝纤维化中的用途。


背景技术：

2.肝纤维化(liver fibrosis)是各种损伤因子累积肝脏后发生的一种慢性恢复反应。包括病毒性肝炎、酒精性/非酒精性脂肪肝、药物源性肝病、自身免疫性肝病甚至先天性遗传疾病等在内均有可能引起肝纤维化。肝脏疾病分为病毒性和非病毒性肝炎。大部分肝病进展为肝纤维化、肝硬化，此后进展为肝癌、肝衰竭，成为致死性疾病。
3.栀子(gardenia jasminoides)是茜草科植物栀子的干燥果实，性苦、寒，是一种药食两用的中药，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。栀子中含黄酮、栀子黄素、环烯醚萜苷、萜类等化学成分。已有研究发现从栀子中提取的多糖具有明显的抗氧化作用。


技术实现要素：

4.本发明用一种简单有效的提取和纯化植物多糖的工艺和方法，以江西产地的栀子为原料获得了一种混合多糖组分，并进一步进行了纯化获得了均一的多糖(本文中命名为gje0.2-2)。药理实验表明gje0.2-2可以抑制肝星状细胞，另外，通过体内实验证明，其可以在四氯化碳诱导的慢性肝纤维化模型中减轻肝损伤并减弱肝纤维化。因此gje0.2-2有望被开发成为一种抗肝纤维化的多糖类药物。
5.为解决上述发明目的，本发明提供了一种栀子多糖，其单糖主要由半乳糖醛酸、己烯糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。
6.优选地，所述栀子多糖具有如下结构：
[0007][0008]
在以上结构中，galpa表示半乳糖醛酸，hexpa表示己烯糖醛酸，rhap表示鼠李糖，araf表示阿拉伯糖，galp表示半乳糖，6ome表示galpa或hexpa的c6羧基被甲氧基酯化，t表示末端，所述栀子多糖的分子量范围为1-65kda，优选为35-50kda。
[0009]
本发明还提供了所述栀子多糖的制备方法，其包括如下步骤：
[0010]
(1)多糖的提取：栀子经沸水提取，得到提取液，浓缩，浓缩液加入乙醇醇沉，在添加乙醇的同时进行搅拌，静置过夜，离心，沉淀物冷冻冻干，得栀子粗多糖gje；
[0011]
(2)多糖的纯化：粗多糖gje经deae sepharose
tm fast flow阴离子交换柱分离，收集0.2m nacl洗脱液的洗脱组分，得到所述栀子多糖组分gje0.2，该洗脱组分再经过sephacryl s-300hr凝胶柱进一步纯化，得到所述栀子多糖。
[0012]
优选地，步骤(1)中，沉淀所用乙醇为体积分数95％的乙醇；沉淀所用的乙醇体积为浓缩液体积的3～6倍(比如4倍)。
[0013]
优选地，步骤(1)中，在进行乙醇沉淀前，先对浓缩液进行离心，然后对离心上清液进行透析，透析时间优选为24～72h。
[0014]
优选地，在步骤(1)和步骤(2)之间进行洗涤，采用乙醇和丙酮交替洗，例如各洗涤2-4次。
[0015]
优选地，步骤(2)所述阴离子交换柱分离时依次使用去离子水、0.05m、0.1m、0.2m的nacl溶液进行梯度洗脱，收集0.2m nacl洗脱液的洗脱组分。
[0016]
优选地，步骤(2)中，在采用所述sephacryl s-300hr凝胶柱进一步纯化时，使用0.2m nacl洗脱液进行洗脱，收集得到的洗脱组分即为栀子多糖。
[0017]
对本发明对所得到的栀子多糖进行鉴定，该鉴定包括进行纯度及分子量的测定，然后采用糖组成的测定及核磁共振等方法对其结构特征进行分析，经过上述分析，本发明的栀子多糖具有上文中所示的结构。
[0018]
本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述栀子多糖，以及药学上可接受的辅料。
[0019]
本发明还提供了所述栀子多糖或所述药物组合物在制备预防和/或治疗肝纤维化的药物或护肝保健品中的用途。
[0020]
优选地，所述栀子多糖或所述药物组合物对化学肝损伤具有辅助保护功能。
附图说明
[0021]
图1为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2高效液相色谱的纯度图。
[0022]
图2为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2的1h nmr(a)和
13
c nmr(b)图谱。
[0023]
图3为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2对ccl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型中小鼠体重的影响折线图。
[0024]
图4为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2对ccl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型中小鼠血清生化指标谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)变化的柱状图。与野生组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，与ccl4模型组相比，#p《0.05。
[0025]
图5a和5b分别为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2对ccl4诱导小鼠慢性肝纤维化模型中小鼠α-sma蛋白水平表达量的免疫印迹图和免疫荧光图。与野生组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，与ccl4模型组相比，#p《0.05。
[0026]
图6为使用cck-8细胞增殖及毒性检测实验检测制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2对肝星状细胞lx-2细胞活力影响的折线图。
[0027]
图7a和7b分别为制备实施例1中制得的栀子多糖gje0.2-2抑制lx-2细胞中α-sma、
collagen i和fibronectin的mrna表达量变化柱状图及蛋白水平表达量的免疫印迹图。与空白组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，与tgf-β1模型组相比，#p《0.05。
具体实施方式
[0028]
制备实施例1：栀子多糖gje0.2-2的提取分离纯化和结构表征
[0029]
(1)多糖的提取分离
[0030]
将栀子多糖用沸水提取法提取，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。合并提取液，浓缩至小体积后，离心去沉淀。将上清液用对流水透析两天。透析内液用体积分数95％的乙醇以提取液与乙醇的体积比为1：4(v/v)进行醇沉，静置过夜。弃掉上层多余乙醇，沉淀离心后将沉淀用乙醇和丙酮交替洗三次，干燥后得栀子水提粗多糖gje(得到116.25g，得率为5.8％)。
[0031]
(2)多糖的纯化
[0032]
取7.3g粗多糖溶解于80ml去离子水中，搅拌过夜，离心取上清上样于deae sepharose
tm fast flow阴离子交换柱，依次用去离子水和不同浓度的nacl溶液(0.05m,0.1m、0.2m)进行梯度洗脱，流速控制在13ml/15min，用自动收集仪收集。每管取100μl用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度，用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集分离的多糖进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，最后得到0.2m nacl洗脱液的洗脱组分gje0.2(11.58g)。
[0033]
将180mg的粗多糖gje0.2溶于4ml去离子水中，离心(4,000r/min)取上清上样于sephacryl s-300hr凝胶柱，经0.2m nacl洗脱液洗脱，流速控制在5ml/15min，自动收集仪收集。经过硫酸苯酚法显色、酶标仪检测吸光度并绘制洗脱曲线，收集所需的分离组分进行浓缩透析，最后冷冻干燥得到该均一的栀子多糖，命名为gje0.2-2(1.84g)。
[0034]
(3)多糖的结构鉴定
[0035]
多糖gje0.2-2在串连sugar ks-802(排阻限为1x10
4 da)和ks-804(排阻限为4x10
5 da)分析凝胶柱上的特征图谱如图1所示，其色谱条件为：流动相：0.1m nano3；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；agilent 1260液相色谱仪；检测器：示差检测器和紫外检测器。
[0036]
经hplc测定单糖组成。设定流速为1ml/min，柱温为25℃，紫外检测波长值为254nm，样品进样量为10μl/个。结果显示，栀子多糖gje0.2-2主要含有半乳糖醛酸，己烯糖醛酸，还含有少量的鼠李糖、半乳糖以及阿拉伯糖。其中基于糖的总量，半乳糖醛酸含量为40-80％，己烯糖醛酸含量为5-25％，鼠李糖含量为1-15％，半乳糖含量为1-10％，阿拉伯糖含量为1-10％。
[0037]
取栀子多糖组分样品gje0.2-2 35mg，加d2o 0.5ml溶解，加2.5μl丙酮为内标(δh＝2.29ppm，δc＝31.5ppm)，于bruker avance iii 500m核磁共振仪上，25℃分别测定一维核磁共振谱，结果如图2所示。图2a表示多糖的1h nmr图谱，1,4-连接半乳糖醛酸聚糖中h1-h5的化学位移分别为5.13ppm，3.84ppm，4.07ppm，4.47ppm和4.83ppm。图2b表示多糖的
13
c nmr图谱，其c1-c6的化学位移为100.15ppm,69.43ppm,70.08ppm,79.10ppm,72.58ppm和176.24ppm。所述多糖gje0.2-2具体结构为：
[0038][0039]
经高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)测定栀子多糖组分样品gje0.2-2的平均相对分子质量为40.62kda。
[0040]
测试实施例 栀子多糖gje0.2-2的抗肝纤维化的活性
[0041]
(1)四氯化碳诱导的慢性肝纤维化模型检测栀子多糖组分gje0.2-2对动物体重的影响
[0042]
此次动物实验遵行实验动物管理和使用指南，获得中国科学院上海药物研究所动物伦理委员会批准。从上海灵畅生物科技有限公司购得四周龄雄性c57bl/6小鼠50只。动物随机分为三组，对照组10只，模型组10只，实验组30只，每5只一牢饲养，鼠牢可以自由获取无菌饮水和食物。在温度(25℃
±
2℃)恒定，光照循环(12小时光照，12小时黑暗)环境中饲养，适应环境饲养一周后开始实验。模型组和实验组，腹腔注射ccl4(20％ccl4溶剂为橄榄油，每周三次)，持续六周。10只同窝小鼠仅腹腔注射橄榄油为正常对照组。两周后实验组随机分组给药，每组10只，分为三组a、b、c组。a组给药50mg/kg gje0.2-2多糖，b组给药100mg/kg gje0.2-2多糖，c组给药30mg/kg奥贝胆酸(oca)阳性对照，每隔天一次，持续四周，模型组和实验组给予等体积生理盐水。第三周起每周检测动物体重三次。结果如图3所示，模型组体重较空白对照组明显降低，实验组体重较模型组无明显变化，表明其没有毒性，具备较好安全性。
[0043]
(2)血清生化指标alt/ast检测gje0.2-2对减轻肝损伤的作用
[0044]
给药四周后48h内眼眶取血，分离血清通过检测试剂盒检测alt、ast，如图4所示，给予gje0.2-2多糖的低剂量(50mg/kg)和高剂量组(100mg/kg)的alt、ast数值都明显低于模型组，这说明多糖gje0.2-2可以减轻四氯化碳诱导的慢性肝纤维化模型的肝损伤。
[0045]
(3)免疫印迹和免疫荧光实验检测给药栀子多糖gje0.2-2对小鼠肝中α-sma蛋白水平的影响
[0046]
给药四周后48h内牺牲小鼠，部分肝用生工组织提取试剂盒提取蛋白，加入5
×
上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性10min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测α-sma的蛋白表达情况。结果如图5a所示，栀子多糖gje0.2-2能够以浓度依赖性地抑制α-sma的表达。
[0047]
部分肝用多聚甲醛固定后，30％蔗糖溶液梯度脱水，冰切后新鲜的多聚甲醛固定，0.3％triton通透，5％bsa封闭后加入α-sma一抗4℃孵育过夜，第二天与对应种属的荧光二抗结合后，dapi染色，dako封片剂封片。干燥后荧光显微镜共聚焦结果如图5b所示，ccl4模型组α-sma表达明显升高，而gje0.2-2多糖的低剂量(50mg/kg)和高剂量(100mg/kg)给药组
α-sma表达明显被抑制。这说明多糖gje0.2-2可以减轻四氯化碳诱导的慢性肝纤维化趋势。
[0048]
(4)cck-8实验检测栀子多糖gje0.2-2对肝星状细胞lx-2生长的影响
[0049]
对数生长期的lx-2细胞(5
×
103个/孔)种入96孔板中，设三复孔，于培养箱中培养24h；吸去细胞上清液，加入终浓度分别为100、200、400、800及1000μg/ml的栀子多糖gje0.2-2溶液，继续培养48h后，每孔加入10μl cck-8增强型溶液(购自碧云天公司)，继续培养1.5h后用酶标仪在450nm下采集吸光度。细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组od值－空白组od值)/(对照组od值－空白组od值)
×
100％。结果如图6所示，说明gje0.2-2基本无毒性。
[0050]
(5)rt-pcr实验及免疫印迹实验检测栀子多糖gje0.2-2对肝星状细胞lx-2细胞中α-sma、collagen i和fibronectin在mrna及蛋白水平表达的影响
[0051]
人肝星状细胞lx-2培养于含10％胎牛血清(购自美国gibco公司)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的以体积比1:1混合的dmem培养基中。取对数生长期的lx-2细胞，以1.2
×
106个/孔的密度种于6孔板中，培养24h后，用0、500及1000μg/ml的栀子多糖gje0.2-2(实施例1制备)处理1h后，以0、10ng/ml的浓度加入tgf-β1蛋白刺激。培养48小时后，弃上清，用预冷的pbs漂洗细胞，用trizol(购自美国invitrogen公司)提取细胞中的总rna，提取步骤按照说明书中进行。提取得到的总rna采用m-mlv反转录酶(购自日本takara公司)以oligo(dt)18为引物参照说明书将rna反转录成cdna，利用primer5设计的引物pcr扩增collagen iii、collagen i和fibronectin，荧光定量pcr按照tb green premix ex taq kit说明书进行，应用v7 real-time pcr的fast程序(两步法)。
[0052]
如上同理培养48小时后，弃上清，用预冷的pbs漂洗细胞，western及ip细胞裂解液(购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5
×
上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性10min，冷却后储存于-80℃。免疫印迹检测α-sma、collagen i和fibronectin的蛋白表达情况。结果如图7a和7b所示，栀子多糖gje0.2-2可以显著地抑制collagen iii、collagen i和fibronectin基因mrna和α-sma、collagen i和fibronectin蛋白的表达。
[0053]
综上，通过测试实施例结果可知，栀子多糖组分gje0.2-2能够降低四氯化碳诱导的慢性肝纤维化，包括维持动物的体重，减少动物肝损和α-sma的表达。并且在体外不影响肝星状细胞lx-2的细胞活力，gje0.2-2能明显抑制纤维化相关蛋白α-sma、collagen i和fibronectin的表达，从而抑制肝星状细胞的激活。因此本技术的多糖gje0.2-2可成为预防和/或治疗肝纤维化的潜在的糖类药物或护肝保健品。