一种高活性的凝血因子

一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr
技术领域
1.本发明属于血友病领域，特别涉及一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr。


背景技术：

2.目前f
ⅷ
终身替代性治疗是临床上唯一有效的治疗手段。由于f
ⅷ
在血浆中含量极低 (100～200ng/ml)，浓缩人f
ⅷ
来源局限，且存在潜在的病毒传播的风险，随着生物技术的发展，基因重组f
ⅷ
逐渐取代了血浆来源的f
ⅷ
，成为替代治疗的首选制剂。f
ⅷ
替代治疗极大地改善了血友病患者的病情和生活质量。
3.随着时间的推移，替代治疗的短处不免越来越显著地暴露出来：首先，诱发抑制物的产生被认为是替代治疗最严重的并发症，约20％～30％的血友病a患者会在治疗过程中产生f
ꢀⅷ
抑制物，导致疗效降低甚至替代治疗失败；其次，f
ⅷ
半衰期短，用药次数频繁：f
ⅷ
体内半衰期仅有不到12小时，为了维持其血浆有效浓度，达到预防出血的目的，每周需要注射f
ꢀⅷ
3次；再次，f
ⅷ
替代治疗费用昂贵，重症血友病a患者每年替代治疗的平均费用达到10 万美金，虽然目前我国已将血友病列入重大疾病医保，报销比例也在逐年增高，但是昂贵的药物费用仍给家庭和社会带来沉重的经济负担。而沉重的经济负担是我国大部分重症血友病 a患者难以坚持长期预防治疗的最主要原因。ha的基因疗法有望解决上述难题，使患者免于终身替代治疗以及产生抑制物的风险，并且近年来也已经有了不错的进展，但接受此治疗的患者被观察到f
ⅷ
表达随时间呈下降趋势，且部分患者仍需配合替代疗法治疗才能维持体内f
ⅷ
水平，基因疗法的成功尚先解决如何保持导入体内凝血因子基因的稳定表达这一问题，非替代治疗虽然在未来也许可以推迟或至少是减少外源性f
ⅷ
的暴露，但替代治疗仍然会是 ha治疗的主流。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr，该突变体没有破坏或抑制f
ⅷ
的凝血活性，凝血比活性为野生型的1.6～2倍，在稳定性上表现更优越；突变体明显提高了f
ⅷ
的药物效能，具备很好的临床应用前景。
5.本发明提供了一种编码高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的核酸：
6.(1)hf
ⅷ
cdna：核苷酸序列如seq id no:1-4任一所示；
7.或(2)bdd hf
ⅷ‑
sq：核苷酸序列如seq id no:5-8任一所示；
8.或(3)bdd hf
ⅷ‑
n8：核苷酸序列如seq id no:9-12任一所示；
9.或(4)bdd hf
ⅷ‑
sc：核苷酸序列如seq id no:13-16任一所示；
10.或(5)bdd hf
ⅷ‑△
f：核苷酸序列如seq id no:17-20任一所示。
11.本发明还提供了一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的突变蛋白，氨基酸序列如seq id no:21-29任一所示，该突变体位于第710位的氨基酸为thr而非野生型
ⅷ
或
ⅷ
a的gly。所述氨基酸序列依次包括hf
ⅷ
cdna、bdd hf
ⅷ‑
sq、bdd hf
ⅷ‑
n8、bddhf
ⅷ‑
sc、bdd hf
ⅷ‑△
f对应的突变蛋白的氨基酸序列以及bdd hf
ⅷ‑
v3、bdd human-clrhf
ⅷ
、pf
ⅷ
、bdd pf
ⅷ‑
ol的突变蛋白的氨基酸序列。
12.本发明还提供了编码所述的突变蛋白的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸。
13.本发明还提供了一种表达所述的突变蛋白的载体。
14.本发明还提供了一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的突变蛋白的制备方法，包括如下步骤：
15.以bdd-hf
ⅷ
或全长f
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为模板，用pcr定点诱变法在野生型f
ⅷ
中引入突变位点，将 gly710氨基酸残基替换成thr，经转化后筛选出正确插入gly710thr突变的bdd-hf
ⅷ
或全长 f
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真核表达质粒。
16.本发明还提供了一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的突变蛋白编码核酸的应用，应用所述的核酸于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和终止序列连接，构建表达质粒、基因治疗病毒或非病毒载体，表达突变蛋白。
17.本发明还提供了一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的突变蛋白的应用，应用于制备血友病的重组蛋白治疗药物。
18.本发明还提供了一种高活性的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr的突变蛋白的应用，应用于制备凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr突变体融合蛋白，并将所述融合蛋白用于制备血友病的重组蛋白治疗药物。
19.所述融合蛋白为由人白蛋白、免疫球蛋白fc、转铁蛋白或alpha 1抗胰蛋白酶中的一种与所述的凝血因子
ⅷ
或
ⅷ
a多肽变体gly710thr突变体的突变蛋白融合而得。
20.本发明的核酸或氨基酸序列的药物组合物或基因治疗载体，用于预防和/或治疗疾病，其中所述疾病主要包括出血性疾病或各种原因导致的出血；其中，最可能的出血性疾病是血友病a和b，即由于遗传性凝血因子
ⅷ
缺乏导致的出血性疾病，并包括其中有抑制性抗体产生的血友病a和b，或者后天因抑制物产生所导致的获得性凝血因子
ⅷ
缺乏；及其它使用旁路制剂的出血性疾病，例如新生儿凝血障碍；严重的肝脏疾病；高风险手术；创伤性失血；骨髓移植；血小板减少症和血小板功能障碍；口服抗凝的紧急逆转；先天性凝血因子
ⅷ
的缺陷；血管性血友病，及血管性血友病因子抑制物导致的获得性血管性血友病，与大量损伤有关的失血，大脑出血，血小板功能障碍。
21.有益效果
22.本发明的突变体没有破坏或抑制f
ⅷ
的凝血活性，凝血比活性为野生型的1.6～2倍，在稳定性上表现更优越；突变体明显提高了f
ⅷ
的药物效能，具备很好的临床应用前景。
附图说明
23.图1为无f
ⅸ
a存在下bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体的f
ⅷ
活性时程检测。
24.图2为f
ⅸ
a存在下bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体的f
ⅷ
活性时程检测。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人
graphpadprism软件分析得出one phase decay模型拟合衰减曲线，得出半衰期。
36.(2)f
ⅷ
a活性衰减实验：
37.①
无f
ⅸ
a存在下的f
ⅷ
活性时程：分别取f
ⅷ
gly710thr及野生型bdd-hf
ⅷ
各4nm，经凝血酶20nm活化后水蛭素灭活凝血酶,加入fixa 40nm、pspc 10μm，混合后23℃孵育，分别取样于孵育后0min、5min、10min、15min、20min，加入fx，比照fxa生成试验程序检测样本fxa浓度，间接确定残留f
ⅷ
a的浓度。
38.②fⅸ
a存在下的f
ⅷ
活性时程：重复上述步骤，在添加凝血酶之前，在反应中添加因子 ixa40nm。经凝血酶20nm活化后水蛭素灭活凝血酶,加入pspc 10μm，混合后23℃孵育，分别取样于孵育后0min、10min、20min、30min、40min，加入fx，比照fxa生成试验程序检测样本fxa浓度，间接确定残留f
ⅷ
a的浓度。
39.③
以上两个实验结果用graphpad prism的one phase decay模型拟合出衰减曲线，得出半衰期，比较f
ⅷ
a的稳定性。
40.4.实验结果
41.(1)bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体相对比活性检测：
42.质粒瞬时转染cho细胞，培养48h后收集培养液，取上清液进行检测，用aptt一期法检测突变体的活性，用elisa法检测突变体的蛋白量，与野生型bdd-hf
ⅷ
比较，初步得出突变体的相对比活性。结果显示：bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体的相对比活性为1.084
±ꢀ
0.004。
43.筛选bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体稳定表达的细胞株进行大容量细胞培养，分别于48h、 72h收集培养液，低温环境下提取、纯化、浓缩后得到目的蛋白。分别用一期法、二期法检测突变体的活性，用elisa法检测突变体的蛋白量，与野生型bdd-hf
ⅷ
比较，计算突变体的相对比活性。结果显示：bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体在一期法的相对比活性为2.07
±
0.67，在二期法的相对比活性为1.62
±
0.65。
44.(2)bdd-hf
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gly710thr突变体辅酶活性与稳定性的检测：
45.采用上述大容量细胞培养产物进行检测，通过fxa生成试验、f
ⅷ
活性时程试验等检测突变体的辅酶活性与稳定性，结果显示，在相同的活性浓度下，突变体不但具有与野生型相当的辅酶性能和热稳定性，而且在没有fixa存在下表现出更好的稳定性。
46.①
通过fxa生成试验检测f
ⅷ
gly710thr突变体的辅酶作用。结果显示：f
ⅷ
gly710位点突变为thr后，与野生型有着相当的辅酶性能。
47.②
通过无
ⅸ
a存在下的f
ⅷ
活性时程检测f
ⅷ
gly710thr突变体的辅酶状态与稳定性。如图1结果显示：在不含fixa的反应中，23℃条件下f
ⅷ
gly710thr突变体的半衰期是野生型的2倍，提示f
ⅷ
gly710thr突变体在a2亚单位的保留率上表现更好，具有更优秀的稳定性。
48.③
通过检测f
ⅸ
a存在下的f
ⅷ
活性时程观察f
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突变体对f
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稳定性的影响。如图2结果显示：在含有fixa的反应中，23℃条件下f
ⅷ
gly710thr突变体的半衰期与野生型相当。
49.④
bdd-hf
ⅷ
gly710thr突变体热稳定性检测：在55℃条件反应下，f
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gly710thr突变体与野生型bdd活性衰减50％的时间相当，提示两者在高温下具有相似的热稳定性。