改善肠道微环境健康的母乳化婴幼儿配方粉及其应用的制作方法

1.本发明是关于母乳低聚糖的新应用，具体地说，是关于母乳低聚糖在制备具有改善肠道微环境健康(特别是减少肠道支链脂肪酸)功效的婴幼儿配方粉中的应用，以及所制备得到的婴幼儿配方粉及相关制备方法。


背景技术：

2.母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，简称hmos)属于母乳中除乳糖和脂肪外，含量第三丰富的物质。其总含量在泌乳期的各个阶段有变化，在成熟乳中大约是12-14g/l，而初乳中大约是20-24g/l。每一种母乳低聚糖的结构在还原端都有一个乳糖，大部分以聚乳糖胺作为结构主链，并在链端含有岩藻糖、唾液酸或二者均有。母乳低聚糖主要由三大类组成：岩藻糖基类低聚糖，以2
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岩藻糖基低聚糖和3
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岩藻糖基低聚糖为代表性物质；唾液酸基类低聚糖，以3
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唾液酸基乳糖和6
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唾液酸基乳糖为代表性物质；不含岩藻糖基或唾液酸基的核心糖链结构形成的低聚糖，以乳糖-n-四糖和乳糖-n-新四糖为代表性物质。hmos的存在与含量存在个体差异，并与哺乳母亲的路易斯分泌型组成有关。由于婴幼儿配方粉的原料通常是牛乳，而牛乳中通常不含或含有很少这类低聚糖物质(表1)，hmos便成为了婴幼儿配方粉想要更加接近母乳成分所必须跨越的一道鸿沟。
3.表1成熟母乳和牛乳中宏量营养素与hmos的含量
4.营养成分人乳牛乳蛋白质/(g/l)832脂肪/(g/l)4137乳糖/(g/l)7048低聚糖/(g/l)5～150.05确定的低聚糖种类100 ～40盐藻基化的比例/％50～80～1唾液酸化的比例/％10～20～70
5.肠道菌群是人体肠道微生态系统的重要组成物质，对人类健康有重要作用。肠道菌群中的厌氧类杆菌、双歧杆菌、真细菌、链球菌和乳酸杆菌等通过发酵碳水化合物、蛋白质和脂质等能释放代谢产物短链脂肪酸(short chain fatty acids,scfa)，主要包括乙酸、丙酸和丁酸等。scfa可调节机体的多种生理功能，为调节肠道微环境的健康发挥了重要作用。比如，scfa能提供能量和调节电解质，乙酸是宿主能量的重要来源，丙酸能参与丙酮酸逆转化为葡萄糖的过程，丁酸被上皮细胞摄取，是上皮细胞的主要能量来源。scfa还具有抗炎、提升肠道屏障功能和抗菌的作用。肠道菌群发酵释放的scfa能降低肠道ph，进而增加肠道内有益菌的生长，减少有害菌的增殖。
6.此外，肠道中代谢产物还可能有少量的支链脂肪酸(bcfa)如异丁酸和异戊酸，它们由肠道菌群代谢支链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等产生，是未消化的蛋白与多肽到达结肠后被细菌发酵的产物，主要来自于膳食或粘膜细胞的脱落。因此与乙酸、丙酸和
丁酸不同，异丁酸和异戊酸是蛋白质的代谢产物。异丁酸和异戊酸的降低可看做从蛋白发酵转向纤维发酵，被认为是积极的效应。这些支链脂肪酸被认为是结肠蛋白质发酵的标记物质，该过程同时也产生其他代谢物，如氨气、酚、对甲酚、或生物胺类等，这些物质能对小肠环境中的细胞造成破坏(aguirre et al.,2016)。粪便中高水平的异戊酸与人的抑郁和皮质醇水平有关(szczesniak et al.,2016)，最近也有关于bcfa对葡萄糖和脂类代谢的研究(heimann et al.,2016)。
7.与未接受母乳喂养的相比，全母乳喂养的婴儿粪便中测得异丁酸和异戊酸含量较低(bridgman et al,2017)。粪便中较高的支链脂肪酸，如戊酸、异丁酸和异戊酸，是来自氨基酸代谢的，它们的存在表明婴配粉喂养组的蛋白质吸收较低，或者有过量的蛋白质摄入(可能因为婴配粉中蛋白含量比母乳更高)。这些代谢产物可能也导致了婴配粉喂养的婴儿粪便中，负责分解蛋白的细菌，如拟杆菌属和梭菌属的含量较高。婴配粉喂养的婴儿粪便中蛋白分解的代谢产物水平较高，可能也因为婴配粉不含有hmo因此碳水化合物的存在较低，所以这些婴儿的能量获取更多依赖于蛋白质代谢。
8.chow等人的研究也表明，当母乳喂养和配方粉喂养的婴幼儿粪便培养体系中，可发酵的碳水化合物不存在时，就会主要生成蛋白发酵的代谢产物；而当加入各种可以发酵的，类似hmo的碳水化合物后，这些蛋白代谢物含量又下降了。配方粉喂养组粪便中较高的短链脂肪酸可能对婴幼儿代谢产生影响。thompson-chagoyan等人(2011)对92个2-12个月的婴儿进行了研究，其中一半是不过敏的，一半有牛奶蛋白过敏症状。牛奶蛋白过敏婴儿的粪便支链脂肪酸的浓度和比例比健康婴儿更高。
9.目前，婴幼儿配方粉蛋白消化利用率偏低，蛋白质设计值一般会高，以弥补其损失率的不足。所以制备一种能够可改善肠道微环境健康，减少异丁酸和异戊酸等支链脂肪酸的婴幼儿配方粉是十分必要的。


技术实现要素：

10.本发明的一个目的在于提供一种母乳低聚糖的新应用，具体是其在制备具有可改善肠道微环境健康功效的母乳化婴幼儿配方粉中的应用。
11.本发明的另一个目的在于提供一种母乳化婴幼儿配方粉。
12.本发明的另一个目的在于提供一种母乳化婴幼儿配方粉的应用。
13.本发明发现一些母乳低聚糖具有显著改善肠道微环境健康的作用，具体表现在可在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，降低ph维持肠道微环境健康，减少支链脂肪酸如异丁酸和异戊酸等，从而提供了母乳低聚糖的新应用。
14.具体而言，本发明提供了母乳低聚糖在制备用于改善肠道微环境健康的婴幼儿配方粉中的应用，其中，所述改善肠道微环境健康包括：在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，降低ph以维持肠道微环境健康，和/或减少支链脂肪酸。
15.本发明还提供了一种具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉，其中含有母乳低聚糖。其中，所述改善肠道微环境健康包括：在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，降低ph以维持肠道微环境健康，和/或减少支链脂肪酸。
16.已知母乳低聚糖包括岩藻糖基乳糖、唾液酸基乳糖，以及不带岩藻糖基或唾液酸基的母乳寡糖基本糖链结构(典型的代表物质包括乳糖-n-四糖及其同分异构体乳糖-n-新
四糖)。
17.其中2
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岩藻糖基乳糖(2
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fucosyllactose，2
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fl或2-fl或2fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
18.3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3
’‑
fl或3-fl或3fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，与2
’‑
岩藻糖基乳糖互为同分异构体。是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
19.乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构，且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0020]3’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl或3-sl或3sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0021]6’‑
唾液酸基乳糖(6
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sialyllactose，6
’‑
sl或6-sl或6sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。该物质经微生物发酵法制备，与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
[0022]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉，其中含有母乳低聚糖14.2-3182.2mg/100g，或以计奶液计含有母乳低聚糖0.02-4.2g/l。
[0023]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉，为婴幼儿配方粉，其中含有母乳低聚糖14.2-3182.2mg/100g，并且，该婴幼儿配方粉的总蛋白含量为10.5～18g/100g，α-乳清蛋白含量为1.25～1.8g/100g，β-酪蛋白含量为2.2～3.7g/100g，脂肪含量为20～29g/100g，亚油酸含量为2600～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为350～450mg/100g，碳水化合物含量为52～58g/100g。
[0024]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的母乳化婴幼儿配方粉中，蛋白、脂肪指标可根据婴儿发育阶段做更进一步细分。具体而言，针对0-6个月婴儿：该奶粉中的总蛋白含量为9～15g/100g，α-乳清蛋白含量为1.25～1.8g/100g，β-酪蛋白含量为2.2～3.7g/100g，脂肪含量为23～29g/100g，亚油酸含量为2600～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为350～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g，母乳低聚糖含量为14.2-3182.2mg/100g。针对6-12个月较大婴儿：该奶粉中总蛋白含量为11～18g/100g，α-乳清蛋白含量为1.25～1.8g/100g，β-酪蛋白含量为2.2～3.7g/100g，脂肪含量为20～29g/100g，亚油酸含量为2600～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为350～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g，母乳低聚糖含量为14.2-3182.2mg/100g。针对12-36个月幼儿：该奶粉中总蛋白含量为12～18g/100g，α-乳清蛋白含量为1.0～1.8g/100g，β-酪蛋白含量为2.0～3.7g/100g，脂肪含量为20～29g/100g，亚油酸含量为2600～4500mg/100g，α-亚麻酸含量为350～450mg/100g，碳水化合物含量为52～56g/100g，母乳低聚糖含量为14.2-3182.2mg/100g。
[0025]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，提供乳蛋白的原料包括基础原料牛奶、全脂奶粉、脱脂奶粉中的一种或多种；优选
地，基于1000重量份(除特别注明外，本发明中所述的份均为重量份)的所述减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉，其原料包括：生牛乳800～3000重量份；脱盐乳清粉100-300份，乳清蛋白粉20-80份。进一步，为满足本发明的婴儿配方粉产品中对乳清蛋白、α-乳清蛋白及β-酪蛋白的含量指标要求，本发明的婴儿配方粉的原料还包括：为强化乳清蛋白而添加的乳清蛋白粉(例如乳清蛋白粉wpc80％、乳清蛋白粉wpc34％、乳清蛋白粉(富含乳脂肪球球膜)等)、脱盐乳清粉(例如脱盐乳清粉d70、d90等)中的一种或多种，优选包括乳清蛋白粉wpc 80％和脱盐乳清粉，选择性添加乳清蛋白粉wpc34％；且为强化产品中的α-乳清蛋白更进一步添加有原料α-乳清蛋白粉，以及为强化产品中的β-酪蛋白更进一步添加有原料β-酪蛋白粉。
[0026]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，提供产品脂肪和脂肪成分的原料除含有乳脂的基础原料(如前述的全脂奶粉、脱脂奶粉、牛奶)外，还包括植物油。所述植物油可包括葵花籽油、玉米油、大豆油、低芥酸菜籽油、椰子油、棕榈油、核桃油、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯中的一种或多种，优选包括玉米油和大豆油、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。这些植物油的添加一方面为产品提供脂肪成分，另一方面提供亚油酸和α-亚麻酸。更优选地，本发明中所用原料玉米油、大豆油、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量分别为大豆油10-70份，玉米油10-70份，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯80-180份，也可以是上述任意两种及以上的食用植物调和油。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，提供母乳低聚糖的原料直接来自商品化的母乳低聚糖，其在本发明的婴幼儿配方粉中的添加量为0.142-31.8份。
[0028]
根据本发明的一优选具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，所述母乳低聚糖中，以各单体低聚糖总量计为100％，可以为单独添加2
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fl含量为14.2-3182.2mg/100g，或者3
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fl含量为14.2-1515.3mg/100g，或者3sl含量为14.2-1515.3mg/100g，或lnt含量为14.2-2273.0mg/100g，也可以多种低聚糖一起添加。当本发明的婴幼儿配方粉中同时含有2
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fl和lnt时，2
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fl含量为14.2-3182.2mg/100g，lnt含量为14.2-2273.0mg/100g，且总量在300～1800mg/100g；优选地，2
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fl：lnt约为2:1。
[0029]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，碳水化合物一部分来自含有乳糖的基础原料如牛奶、全脂奶粉和/或脱脂奶粉等，此外应额外添加乳糖原料来提供碳水化合物。即，本发明的婴儿配方粉中，提供碳水化合物的原料除含有乳糖的基础原料外，还包括原料乳糖。优选地，基于1000重量份的所述减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉中，其原料包括：乳糖100～450重量份。可在所述范围内调整乳糖的具体添加量以使本发明的减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉碳水化合物含量为52～58g/100g。
[0030]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉，其原料中还可包括适当的低聚果糖、低聚半乳糖、dha、ara、双歧杆菌、乳铁蛋白中的一种或多种，还可包括包含钙粉、维生素和矿物质的复配营养素，此外还包括在奶粉制备工艺中喷雾干燥时所用的载体无水奶油和磷脂。优选地，基于1000重量份的所述含有核苷酸和opo结构脂的母乳化婴幼儿配方粉，其原料包括：低聚果糖粉10～30重量份；低聚半乳糖浆12～85重量份；包含钙粉、维生素和矿物质的复配营养素7～18重量份；dha6～20重量份；
ara5～20重量份；双歧杆菌0.1～0.2重量份；磷脂2～量份；无水奶油0.5～2量份。
[0031]
本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，采用原料低聚半乳糖和低聚果糖来提供产品膳食纤维。目前市场上的婴儿配方粉中多是单一使用了低聚半乳糖或者低聚果糖。本案发明人经过各方便的摸索分析，考虑其在肠道内对益生菌的促进作用以及加工性能影响等，最终于本发明中选用了低聚半乳糖(fos)及低聚果糖(gos)按照特定比例的组合。
[0032]
本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，所用原料双歧杆菌是用来提供产品益生菌的。根据本发明的具体实施方案，本发明的减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉中，双歧杆菌的添加量为4
×
106fu/g奶粉(为满足该要求，通常，基于1000重量份的所述减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉，其原料包括双歧杆菌0.1～0.2重量份)。经过试验验证，该添加量的双歧杆菌，在经过本发明的奶粉加工工艺后，产品货架期内活菌数能够保证在4
×
106cfu/g以上。
[0033]
本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，还含有特定量的钙粉、维生素和矿物质。母乳中的维生素和矿物质是保证婴儿健康的重要保证，合理的维生素添加量能够在满足婴儿营养需要的情况下提供给婴儿更多的免疫力，如果矿物质含量过低会造成婴儿骨骼和身体发育延缓，但是如果矿物质摄入过高会造成婴儿肾脏负担的加重。同时通过对奶粉中钙磷比的调整使产品中的钙更加容易吸收。本发明所述的复配营养素为符合国家标准的营养成分的组合，按照不同配方使用不同添加量。本发明的配方粉根据需要若添加营养素可选择性采用下述复配营养素成分中的任一或任意组合。优选地，所述复配营养素至少包括复配维生素、钙粉、矿物质、氯化镁和氯化钾等营养包，各组分用量为：
[0034]
1)矿物质，每克矿物质一中：铁40-120mg，锌20-45mg，铜2600-4200μg，硒0-180μg，碘500-1000μg，锰0-560μg，总重1kg；
[0035]
2)钙粉，每克钙粉中：钙180-420mg，磷45-100mg，钠0-150mg，总重8kg；
[0036]
3)氯化钾，每1000克奶粉中：钾0-1.4g，总重3kg；和
[0037]
4)氯化镁，每1000克奶粉中：镁0-0.2g，总重1.5kg。
[0038]
5)在本发明的配方粉中，复配维生素中还可含有：牛磺酸130-170mg；维生素a 1500-2900μg re；维生素d 20-40μg；维生素e14-35mgα-te；维生素k1 210-360μg；维生素b1 2200-3600μg；烟酰胺13300-21000μg；维生素b61200-2000μg；叶酸290-460μg；泛酸5400-12500μg；生物素50-120μg；维生素b12 3-10μg；维生素c350-500mg；维生素b2 1200-2200μg。
[0039]
此外，所述复配营养素中还可选择性包括氯化胆碱(每1000千克奶粉中含胆碱300～750g)。
[0040]
本发明的减少支链脂肪酸的的母乳化婴幼儿配方粉中，所用原料磷脂和无水奶油主要是用于喷雾干燥过程中粉颗粒的成型，所述磷脂可以是大豆磷脂和/或卵磷脂。磷脂和无水奶油的用量较少，但对于奶粉产品中脂肪含量也具有一定贡献。
[0041]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉的方法，该方法采用湿法或干法生产工艺，将母乳低聚糖与配方中的其他原料混合，制备所述婴幼儿配方粉。其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。
[0042]
具体而言，本发明的制备所述的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉的方法包括：
[0043]
配料：将配方粉原料中除喷雾载体(磷脂及无水奶油)及后混料(dha、ara、双歧杆菌、乳铁蛋白等)外的其他原料进行混合，得混合料液；
[0044]
均质：混合料液进行均质；
[0045]
浓缩杀菌：均质后的料液进行浓缩杀菌，浓缩杀菌条件为：双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间15～30秒，并控制出料浓度为48％～52％干物质；
[0046]
喷雾干燥：浓奶液经预热器预热到60～70℃，预热后物料经0.8～1.2mm孔径的过滤器过滤后，打入干燥塔喷雾干燥，控制喷雾干燥条件为：进风温度165～180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160～210bar，塔负压-4～-2mbar；
[0047]
流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经一级流化床二次干燥后，经二级流化床冷却到25～30℃，同时在压缩空气作用下，将加热至60～65℃的磷脂(卵磷脂和/或大豆磷脂)与载体(无水奶油)的混合物均匀分散到粉表面，得到粉颗粒；
[0048]
后混料：将后混料与流化床干燥冷却后的粉颗粒干混混均，包装，得奶粉成品。
[0049]
本发明中，母乳低聚糖可以在配料时一起混料，也可以在后混料过程中添加。
[0050]
另一方面，本发明还提供了所述的婴幼儿配方粉在制备具有改善肠道微环境健康功效的食品中的应用。其中，所述改善肠道微环境健康包括：在肠道系统中作为益生元被肠道菌群利用并产气，降低ph以维持肠道微环境健康，和/或减少支链脂肪酸。
[0051]
根据本发明的具体实施方案，本发明的具有改善肠道微环境健康功效的婴幼儿配方粉中，所述母乳低聚糖选自岩藻糖基类低聚糖、唾液酸基类低聚糖或乳糖-n-四糖中的一种或多种。优选地，所述岩藻糖基类低聚糖为2
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fl或3-fl，所述唾液酸基类低聚糖为3-sl或6-sl。
[0052]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于在近端结肠中作为益生元被肠道菌群利用并产气。优选地，所述母乳低聚糖为3-sl、6-sl或lnt。
[0053]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于在远端结肠中作为益生元被肠道菌群利用并产气。所述母乳低聚糖为2
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fl、3-fl、3-sl、6-sl或lnt。
[0054]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于降低近端结肠ph以维持肠道微环境健康。所述母乳低聚糖为2
’‑
fl、3-fl、3-sl、6-sl或lnt。
[0055]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于降低远端结肠ph以维持肠道微环境健康。优选地，所述母乳低聚糖为2
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fl、3-fl或lnt。
[0056]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于降低远端结肠支链脂肪酸的产生。
[0057]
根据本发明的一些更具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖是用于降低远端结肠异丁酸的产生。优选地，所述母乳低聚糖为2
’‑
fl、3-fl、3-sl、或lnt。当用于此用途时，2
’‑
fl的应用量为14.2-3182.2mg/100g粉，或以换算成奶液为0.02-4.2g/l；优选为70.9-1818.4mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.4g/l；更优选为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l。3-fl的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换
算成奶液计为0.02-2.0g/l；优选为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l；更优选为70.9-757.7mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-1.0g/l。3-sl的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-2.0g/l；优选为70.9-454.6mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.6g/l；更优选为70.9-227.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.3g/l。lnt的应用量为14.2-2273.0mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-3.0g/l；优选为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l；更优选为70.9-757.7mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-1.0g/l。
[0058]
根据本发明的一些更具体实施方案，本发明的母乳低聚糖是用于降低远端结肠异戊酸的产生。优选地，所述母乳低聚糖为2
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fl、3-fl、3-sl或6-sl。所述食品可以为乳粉或乳液，优选为婴儿配方粉。当用于此用途时，2
’‑
fl的应用量为14.2-3182.2mg/100g粉，或以换算成奶液为0.02-4.2g/l；优选为70.9-1818.4mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.4g/l；更优选为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l。3-fl的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-2.0g/l；优选为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l；更优选为70.9-757.7mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-1.0g/l。3-sl的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-2.0g/l；优选为70.9-454.6mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.6g/l；更优选为70.9-227.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.3g/l。6-sl的应用量为14.2-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-2.0g/l；优选为70.9-606.1mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.8g/l；更优选为70.9-454.6mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-0.6g/l。
[0059]
根据本发明的具体实施方案，根据本发明的一些具体实施方案，本发明的婴幼儿配方粉中的母乳低聚糖还有利于促进肠道系统中对人体有益的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的产生。从而，本发明所述的改善肠道微环境健康还包括：调控肠道系统中有益的短链脂肪酸的产生，所述有益的短链脂肪酸包括甲酸、乙酸、丙酸和/或丁酸。
[0060]
综上所述，本发明发现母乳低聚糖能显著改善肠道微环境健康，将其用于添加到婴幼儿配方粉中，可改善肠道微环境健康，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0061]
图1a为本发明的shime装置中粪便接种培养示意图。
[0062]
图1b显示本发明的shime发酵分组示意图。
[0063]
图2显示在模拟婴儿结肠的shime装置中培养两周后，模拟近端结肠(左)和远端结肠(右)的菌群情况。
[0064]
图3a显示本发明各hmo在小批量发酵实验中近端结肠的ph随时间变化检测结果。
[0065]
图3b显示本发明各hmo在小批量发酵实验中远端结肠的ph随时间变化检测结果。
[0066]
图4a显示本发明各hmo在小批量发酵实验中近端结肠引起的气压随时间变化检测结果。
[0067]
图4b显示本发明各hmo在小批量发酵实验中远端结肠引起的气压随时间变化检测结果。
[0068]
图5a显示本发明模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸的检测结果。
[0069]
图5b显示本发明模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异戊酸的检测结果。
[0070]
图6a显示本发明模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸的检测结果。
[0071]
图6b显示本发明模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异戊酸的检测结果。
[0072]
图7显示本发明模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的总体检测结果。
[0073]
图8显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿近端结肠的粪便批量发酵实验中产生的甲酸的检测结果。
[0074]
图9显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿近端结肠的粪便批量发酵实验中产生的乙酸的检测结果。
[0075]
图10显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿近端结肠的粪便批量发酵实验中产生的丙酸的检测结果。
[0076]
图11显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿近端结肠的粪便批量发酵实验中产生的丁酸的检测结果。
[0077]
图12显示本发明模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的总体检测结果。
[0078]
图13显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿远端结肠的粪便批量发酵实验中产生的甲酸的检测结果。
[0079]
图14显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿远端结肠的粪便批量发酵实验中产生的乙酸的检测结果。
[0080]
图15显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿远端结肠的粪便批量发酵实验中产生的丙酸的检测结果。
[0081]
图16显示本发明母乳低聚糖各单体模拟婴儿远端结肠的粪便批量发酵实验中产生的丁酸的检测结果。
具体实施方式
[0082]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0083]
实施例1
[0084]
本实施例提供一种婴幼儿配方粉，其原料组成包括(制备1000公斤)：
[0085]
乳糖425千克，全脂奶粉190千克，乳清蛋白粉wpc80％40千克，脱盐乳清粉d90 25千克，葵花籽油140千克份，玉米油20千克，大豆油60千克，α-乳清蛋白粉30千克，β-酪蛋白粉9千克，复配核苷酸0.54千克，卵磷脂2千克，无水奶油1千克，低聚果糖粉17千克，低聚半乳糖浆40千克，复配营养素14千克，dha 8千克，ara 8.2千克，乳铁蛋白0.45千克，母乳低聚糖(2
’‑
fl)6.73千克。
[0086]
本实施例的婴幼儿配方粉采用干法生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo，得到成品。
[0087]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。其中母乳低聚糖2
’‑
fl含量为606.1mg/100g。
[0088]
实施例2
[0089]
本实施例提供一种婴幼儿配方粉，其原料组成包括：
[0090]
生牛乳1000千克，乳糖350千克，脱脂奶粉235千克，乳清蛋白粉wpc80％20千克，脱盐乳清粉d90 25千克，葵花籽油85千克，玉米油20千克，大豆油50千克，α-乳清蛋白粉4千克，β-酪蛋白粉1千克，复配核苷酸0.57千克，大豆磷脂2千克，无水奶油1千克，低聚果糖粉6千克，低聚半乳糖浆14千克，复配营养素13.7千克，dha 7千克，ara 8千克，乳铁蛋白0.5千克，母乳低聚糖(3-fl)2.52千克。
[0091]
本实施例的婴幼儿配方粉采用湿法工艺制备而成，主要包括：
[0092]
配料：将配方粉原料中除喷雾载体(磷脂及无水奶油)及后混料(dha、ara、乳铁蛋白)外的其他原料进行混合，得混合料液；
[0093]
均质：混合料液进行均质；
[0094]
浓缩杀菌：均质后的料液进行浓缩杀菌，浓缩杀菌条件为：双效浓缩，杀菌温度≥83℃，杀菌时间15～30秒，并控制出料浓度为48％～52％干物质；
[0095]
喷雾干燥：浓奶液经预热器预热到60～70℃，预热后物料经0.8～1.2mm孔径的过滤器过滤后，打入干燥塔喷雾干燥，控制喷雾干燥条件为：进风温度165～180℃，排风温度75-90℃，高压泵压力160～210bar，塔负压-4～-2mbar；
[0096]
流化床干燥冷却：从干燥塔出来的粉再经一级流化床二次干燥后，经二级流化床冷却到25～30℃，同时在压缩空气作用下，将加热至60～65℃的磷脂(卵磷脂和/或大豆磷脂)与载体(无水奶油)的混合物均匀分散到粉表面，得到粉颗粒；
[0097]
后混料：将后混料与流化床干燥冷却后的粉颗粒干混混均，包装，得奶粉成品。
[0098]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。其中母乳低聚糖3-fl含量为223.3mg/100g。
[0099]
实施例3
[0100]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖的0～6月龄的婴儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0101]
生牛乳1000份，乳糖350份，混合植物油120份，opo结构油脂110份，脱盐乳清粉125份，脱脂奶粉50份，乳清蛋白粉70份，母乳低聚糖(lnt)2份，复配维生素2.5份，复配矿物质8份。
[0102]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。其中母乳低聚糖lnt含量为115.2mg/100g。
[0103]
实施例4
[0104]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖的6～12月龄的较大婴儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0105]
生牛乳1500份，脱盐乳清粉220份，乳糖170份，脱脂奶粉170份，混合植物油70份，opo结构脂70份，乳清蛋白粉40份，母乳低聚糖(3-sl混合物)0.8份，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0106]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。其中母乳低聚糖3sl含量为71.2mg/100g。
[0107]
实施例5
[0108]
本实施例提供一种含有母乳低聚糖和长双歧杆菌婴儿亚种组合物的12～36月龄
的幼儿配方粉，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0109]
生牛乳1500份，脱脂奶粉250份，乳糖180份，脱盐乳清粉150份，混合植物油70份，opo结构油脂65份，乳清蛋白粉35份，母乳低聚糖(2
’‑
fl、lnt混合物)4.2份，且2
’‑
fl:lnt约为2:1，复配维生素3份，复配矿物质6份。
[0110]
经检测，该奶粉中各成分含量符合要求。其中母乳低聚糖2
’‑
fl含量为253.5.1mg/100g，lnt含量为131.2mg/100g。
[0111]
母乳低聚糖功效实验
[0112]
shime装置中粪便接种培养
[0113]
使用shime装置(参见图1a所示意)，从一个5月龄自然分娩和仅接受了母乳喂养的健康婴儿获取含有菌群的新鲜粪便样品，并接种到对应近端结肠和远端结肠的容器中。饲喂食物料到该装置的胃/小肠端，每天三次，连续饲喂两周，来支持近端和远端结肠中菌群的生长和定植。其中，由小肠消化完并进入到结肠的食物料是在shime装置的生产商prodigest提供的标准食物料基础上调整乳糖、酪蛋白和乳清蛋白比例而成，标准食物料由以下成分组成：果胶(1g/l)，葡萄糖(1g/l)，淀粉(1g/l)，纤维二糖(1g/l)，蛋白胨(2g/l)，黏蛋白(6g/l)，乳糖(2.1g/l)，酪蛋白(0.2g/l)，乳清蛋白-乳白蛋白(2.7g/l)，l-半胱氨酸盐酸盐(0.2g/l)。本发明各实验中的食物料参考le blay等人(2010)调整了乳糖、酪蛋白和乳清蛋白的比例约为12:1:15并保证营养素稳定均衡，来模拟婴儿的肠道微生态在常规的母乳或婴配粉喂养中可能接触到的食物组成。婴儿粪便菌群在shime模型中稳定了两周后，近端和远端结肠会被取样，溶于甘油中形成原液，并在厌氧条件下存放于-80℃。
[0114]
对微生物群组成的分析检测将集中于特定的菌株：乳酸杆菌，双歧杆菌，罗斯氏菌，真杆菌和粪杆菌，因为已知它们与(益生元)健康功效相关。检测分析基于qpcr。
[0115]
小批量发酵
[0116]
婴儿菌群接种到shime模型中稳定2周生长之后(如前述“shime装置中粪便接种培养”)，取10ml近端和远端结肠的菌群并在厌氧条件下分别转移到发酵瓶进行小批量发酵。在43ml基底缓冲液(用于调整ph并模拟相应的结肠环境)的基础上，每个发酵瓶中还含有添加了不同含量hmo的20ml pbs缓冲液(用于溶解和带入hmo受试物质)，使各种hmo的终浓度为0.02g/l、0.2g/l、2g/l，近端结肠ph设置为5.6，远端结肠ph设置为6.5。小瓶在37℃震动条件下孵育。在孵育时，在0、6小时、24小时和48小时检测气压，随后取样检测ph和短链脂肪酸。重复测定三次。
[0117]
在hmo干预期间，各组的气体产量通过测量气压变化来比较。对短链脂肪酸的分析包括异丁酸、异戊酸，还分析了丁酸、丙酸和乙酸，也分析了甲酸，各物质通过hplc进行分析。
[0118]
shime发酵
[0119]
使用“shime装置中粪便接种培养”中取样储存的婴儿粪便菌群接种到shime模型中，考察hmo在shime装置中的发酵情况。前后做了两批实验，每批实验同时做三个样品组(或对照)。三套实验装置中，模拟极端和远端结肠的装置都被分别接种(参见图1b所示意)。每日饲喂三次食物料，培养4天后，饲喂的食物料中加入了hmo(对照组没有加入hmo)。每种食物料在140ml料液中加入了280mg hmo(浓度为2g/l)以及60ml胰液。每组hmo与对照都只进行1次实验，因此生物学重复为1。shime发酵持续到hmo干预后第14天，于发酵期间的不同
时间段取样检测。
[0120]
数据分析
[0121]
对于数据结果进行双样本双侧t检验(two tailed,paired t-test)。两个组若有显著性差异，且p《0.05，则用星号*表示。两个星号**表示p《0.01。三个星号***表示p《0.001。
[0122]
模拟近端和远端结肠环境中的菌群情况
[0123]
粪便菌群在shime装置中接种培养稳定两周后的菌群鉴定情况请参见图2。在shime模型中稳定了两周后，经过菌群测定，发现双歧杆菌和乳酸杆菌含量很低，几乎不可测得，与此前文献报道吻合(laforest-lapointe,2017)。证明在模拟婴儿肠道环境中，用含乳糖/酪蛋白/乳清的标准食物料饲喂后，对应结肠的菌群环境更趋向于配方粉喂养的婴儿，而不是母乳喂养的婴儿。
[0124]
各hmo在小批量发酵实验中ph随时间变化情况
[0125]
各hmo在小批量发酵实验中近端结肠的ph随时间变化检测结果参见图3a。各hmo在小批量发酵实验中远端结肠的ph随时间变化检测结果参见图3b。可以看出，在近端结肠，时间为6小时的ph降低比其他时间点更显著。在远端结肠，2g/l的2
’‑
fl和3-fl有显著降低ph的趋势。可见随着发酵时间的延长，hmo会被婴儿粪便中的菌群利用，产生短链脂肪酸，从而降低了ph。lnt在0.2g/l的条件下有较好的降低ph的趋势。
[0126]
各hmo在小批量发酵实验中引起的气压随时间变化情况
[0127]
各hmo在小批量发酵实验中近端结肠引起的气压随时间变化检测结果参见图4a。各hmo在小批量发酵实验中远端结肠引起的气压随时间变化检测结果参见图4b。可以看出，3-sl和6-sl这两种唾液酸类的低聚糖在2g/l的条件下，在近端结肠产生的气压较高，证明在这个条件下，两种低聚糖能被粪便菌群较好地利用。在0.2g/l的条件下，lnt有较好的产气的趋势。而在模拟远端结肠的条件下，所有hmo在2g/l条件下都可导致气压的升高。
[0128]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸和异戊酸的情况
[0129]
异丁酸和异戊酸这类短链脂肪酸(scfa)主要由蛋白质发酵产生。本发明中，模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸和异戊酸的检测结果分别参见图5a和图5b。可以看出，各hmo在模拟近端结肠的小批量发酵中，并未影响异丁酸和异戊酸的生成。
[0130]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸和异戊酸的情况
[0131]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生异丁酸和异戊酸的检测结果分别参见图6a和图6b。可以看出，在远端结肠，2
’‑
fl、3-fl和3-sl、lnt均可显著减少异丁酸的产生，且以两种岩藻糖基类低聚糖效果更佳。两种唾液酸类低聚糖和两种岩藻糖基类低聚糖均分别可减少异戊酸的产生，且以2
’‑
fl能力最强。综合起来，两种岩藻糖基类的低聚糖，2
’‑
fl和3-fl均能显著地减少异丁酸和异戊酸的产生。
[0132]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的情况
[0133]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的总量检测结果参见图7。可以看出，对所有hmo发酵了48小时后，产生的短链脂肪酸相对其他的时间点更高，特别是3-sl和6-sl在2g/l的条件下，产生scfa显著较多，其中2g/l的3-sl在发酵24小时后，也产生了较多scfa。
[0134]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生甲酸的检测结果参见图8。可以看出，
3-sl和6-sl在模拟近端结肠发酵48小时后，显著地增加了甲酸。其中以6-sl效果更显著。
[0135]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生乙酸的检测结果参见图9。可以看出，3-sl和6-sl在模拟近端结肠发酵48小时后，显著地增加了乙酸。其中以3-sl效果更显著。
[0136]
模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生丙酸的检测结果参见图10。可以看出，6-sl在模拟近端结肠发酵48小时后，显著地增加了丙酸。
[0137]
本发明中，模拟近端结肠环境下各hmo小批量发酵产生丁酸的检测结果参见图11。可以看出，在模拟近端结肠环境中，6-sl在发酵48小时后，能显著增加丁酸的生成。
[0138]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的情况
[0139]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生短链脂肪酸的总量检测结果参见图12。可以看出，在远端结肠，各hmo产生scfa相比近端结肠是更活跃的，这也能印证肠道菌群大部分发酵发生在远端结肠的公认科学观点。随时间从0、6、24、到48小时的延长，产生的scfa也随之增加。在6小时这个时间点，0.02g/l的3-sl和0.02g/l的lnt产生短链脂肪酸相对较多；在24小时这个时间点，2g/l的6-sl和2g/l的3-fl产生短链脂肪酸相对较多；而在48小时这个时间点，所有hmo在2g/l的条件下，均可产生较多的短链脂肪酸。
[0140]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生甲酸的检测结果参见图13。可以看出，所有hmo在模拟远端结肠发酵48小时后，均显著地增加了甲酸。其中以3-sl、6-sl、lnt、3-fl效果更显著。
[0141]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生乙酸的检测结果参见图14。可以看出，所有hmo在模拟远端结肠发酵48小时后，均显著地增加了乙酸。其中以3-sl、6-sl和lnt效果更显著。
[0142]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生丙酸的检测结果参见图15。可以看出，所有hmo在模拟远端结肠发酵48小时后，均显著地增加了丙酸。其中以3-sl和3-fl效果更显著。
[0143]
模拟远端结肠环境下各hmo小批量发酵产生丁酸的检测结果参见图16。可以看出，3-sl和6-sl在模拟远端结肠发酵48小时后，显著地增加了丁酸。
[0144]
模拟远端结肠环境下各hmo在shime模型发酵产生丁酸的情况
[0145]
模拟远端结肠环境下各hmo在shime模型发酵产生丁酸的检测结果参见表1。
[0146]
表1
[0147][0148]
在shime模型发酵情况下，发酵14天后，各种hmo产生的丁酸相比发酵初始第1天，都有所降低，但是以对照组(未加hmo)降低的倍数最多；而hmo干预后，第14天相比第1天的降低倍数具有显著提升和改善，其中，以3-sl的降低倍数最低，而3-fl其次，6-sl、2
’‑
fl和lnt相比对照，也都有较好的改善作用。可见，各hmo对于发酵产物中丁酸的调控，相比不加hmo的对照组，有一定优势。